प्रवाह cytometry से घायल / रोग सीएनएस में सेलुलर सूजन की मात्रा का ठहराव / लिपिड माइलिन मलबे है कि समान आकार और दानेदार बनाने कोशिकाओं को, संवेदनशीलता / कम सटीकता कर सकते हैं द्वारा जटिल है. हम एक सेल तैयारी विधि माइलिन मलबे को हटाने और घायल रीढ़ की हड्डी में प्रवाह cytometry द्वारा कोशिका का पता लगाने में सुधार उन्नत है.
घायल केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में प्रतिरक्षा कोशिकाओं (सीएनएस) रूपात्मक या histological तकनीक का उपयोग कर की जांच हमेशा सच सेलुलर सूजन के मात्रात्मक विश्लेषण नहीं प्रदान की है. प्रवाह cytometry एक त्वरित वैकल्पिक विधि घायल मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी के ऊतक में प्रतिरक्षा कोशिकाओं यों है. ऐतिहासिक, प्रवाह cytometry करने के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं को रक्त या अलग तिल्ली या thymus से एकत्र यों इस्तेमाल किया गया है, और केवल कुछ अध्ययनों से घायल रीढ़ की हड्डी में ताजा अलग गर्भनाल ऊतक का उपयोग कर प्रवाह cytometry द्वारा प्रतिरक्षा कोशिकाओं यों का प्रयास किया है. हालांकि, अलग रीढ़ की हड्डी के ऊतकों है कि कोशिकाओं के लिए गलत हो सकता है और कोशिका गिनती प्रवाह cytometer द्वारा प्राप्त विश्वसनीयता कम माइलिन मलबे के साथ ध्यान केंद्रित किया है. हम एक सेल तैयारी कोशिकाओं से प्रभावी ढंग से अलग मलबे / लिपिड माइलिन OptiPrep ढाल प्रणाली, प्रवाह cytometry से घायल रीढ़ की हड्डी में सेलुलर सूजन के संवेदनशील और विश्वसनीय quantifications प्रदान विधि उन्नत है. के रूप में हमारे हाल ही के अध्ययन में वर्णित (बेक और गुयेन एट अल, मस्तिष्क Feb 2010, 133 (2 पं.):. 433-47), OptiPrep सेल तैयारी घायल रीढ़ की हड्डी में सेलुलर सूजन का पता लगाने के लिए संवेदनशीलता बढ़ गया था की गिनती के साथ, विशेष सेल प्रकार चोट गंभीरता के साथ correlating. गंभीर, इस पद्धति का उपन्यास उपयोग तीव्र और जीर्ण एससीआई के बाद सेलुलर सूजन का पहला लक्षण वर्णन प्रदान करने के लिए polymorphonuclear leukocytes के लिए एक पूर्ण समय पाठ्यक्रम (PMNs, neutrophils), / मैक्रोफेज microglia, और टी कोशिकाओं को एक अवधि में 2 घंटे से लेकर शामिल 180 दिन के बाद चोट सेलुलर सूजन का एक आश्चर्य की बात उपन्यास दूसरे चरण की पहचान (डीपीआई). सेलुलर सूजन की इस पद्धति का उपयोग करके पूरी तरह से लक्षण वर्णन घायल सीएनएस में neuroinflammation की एक बेहतर समझ प्रदान करते हैं, कर सकते हैं और neuroinflammation का एक महत्वपूर्ण multiphasic घटक है कि डिजाइन और तर्कसंगत चिकित्सीय उपचार कार्यनीतियों के कार्यान्वयन दोनों सेल आधारित और औषधीय सहित, के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है प्रकट एससीआई के लिए हस्तक्षेप.
प्रवाह cytometry CNS में प्रतिरक्षा कोशिकाओं यों का उपयोग लिपिड / माइलिन सामग्री और मलबे के द्वारा जटिल है. एंटीबॉडी बंधन और विशिष्टता के साथ दखल के अलावा, myelin मलबे समान आकार और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए दानेदार गुण है, माप संवेदनशीलता और सटीकता 8 कम कर सकते हैं . उपन्यास सेल तैयारी यहाँ वर्णित विधि माइलिन मलबे को हटाने में प्रभावी है और जिससे प्रवाह cytometry घायल रीढ़ की हड्डी में सेलुलर सूजन में परिवर्तन का पता लगाने की संवेदनशीलता को बेहतर बनाता है. उदाहरण के लिए, प्रतिरक्षा कोशिकाओं की इस पद्धति का पता लगाने बढ़ाया द्वारा माइलिन मलबे को हटाने के एंजाइमी alone.Critically पृथक्करण की तुलना में, इस विधि का उपयोग उपन्यास तीव्र और जीर्ण सूजन सेलुलर का पहला लक्षण वर्णन की अनुमति के बाद एससीआई PMNs के लिए एक पूर्ण समय पाठ्यक्रम को शामिल करने के लिए, मैक्रोफेज / microglia, और 180 डीपीआई टी कोशिकाओं, और सेलुलर सूजन के एक उपन्यास दूसरे चरण की पहचान की. Neuroinflammation के एक multiphasic घटक के ये महत्वपूर्ण निष्कर्ष तर्कसंगत एससीआई के लिए दोनों सेल आधारित और औषधीय हस्तक्षेप सहित चिकित्सकीय उपचार कार्यनीतियों के डिजाइन और कार्यान्वयन के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है.
OptiPrep ढाल प्रणाली 9 खून में कोशिकाओं, सेल संस्कृति 10 प्रयोजनों के लिए मस्तिष्क से या शुद्ध न्यूरॉन्स से किया गया है अलग मलबे के लिए इस्तेमाल किया, तथापि, हम संशोधित और इस विधि प्रणाली को उन्नत करने के लिए रीढ़ की हड्डी अलग कोशिकाओं से माइलिन मलबे से अलग है, और अनुमति दी प्रवाह cytometry द्वारा सेलुलर सूजन के तेजी से और अधिक सटीक मात्रा का ठहराव. इस cytometry प्रवाह के साथ साथ विधि सीएनएस चोट या रोग की स्थिति के बाद सूजन अनुसंधान में महत्वपूर्ण प्रगति प्रदान के रूप में सबसे अधिक अध्ययन केवल morphological और histological तकनीक है कि सेल प्रकार विशिष्ट हैं या नहीं सच नहीं प्रदान कर सकते हैं हमेशा उपयोग CNS में सेलुलर सूजन की विशेषता है की संभावना है मात्रात्मक निर्धारण. इसके अलावा, कुछ हाल ही के अध्ययन घायल रीढ़ की हड्डी में ताजा dissociated कॉर्ड 11,12 ऊतक या Percoll ढाल प्रणाली 13 द्वारा अलग कक्षों का उपयोग कर प्रवाह cytometry द्वारा प्रतिरक्षा कोशिकाओं यों का प्रयास किया है, तथापि, इन अध्ययनों या तो कम सेल पैदावार का प्रदर्शन किया है या असंवेदनशील प्रतिरक्षा कोशिकाओं का पता लगाने.
इसके विपरीत, पहली बार के लिए OptiPrep ढाल सेल तैयारी विधि प्रदान की गई है, संवेदनशील और विश्वसनीय प्रवाह cytometry द्वारा मात्रात्मक वर्गीकृत चोट की गंभीरता के लिए प्रतिक्रिया में और 180 में डीपीआई एक विस्तारित timecourse पर सेलुलर सूजन के परिवर्तन करने के लिए मूल्यांकन. और प्रवाह cytometric विश्लेषण की संवेदनशीलता और विश्वसनीयता भी विशिष्ट प्रतिरक्षा सेल प्रकार का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया एंटीबॉडी की विशिष्टता पर निर्भर करती है, प्रवाह cytometry के रूप में रूपात्मक मापदंड और सेल प्रकार का भेद करने के लिए की अनुमति नहीं देती. PMNs, मैक्रोफेज / microglia या टी बताता के लिए एंटीबॉडी की विशिष्टता प्रवाह cytometry में किया गया है अच्छी तरह से peritoneal PMNs और वायुकोशीय मैक्रोफेज संस्कृति और कोशिकाओं में घायल रीढ़ की हड्डी ऊतक 1,2 में परीक्षण किया गया. OptiPrep ढाल प्रणाली के साथ साथ, इन प्रवाह cytometry के लिए इस्तेमाल किया एंटीबॉडी सेलुलर सूजन के एक लौकिक और मात्रात्मक विश्लेषण है कि एससीआई microenvironment की गतिशीलता में नए अंतर्दृष्टि प्रदान की है, और पहले एक विस्तारित multiphasic प्रतिक्रिया समय के लिए पहचान की पीढ़ी के लिए योगदान दिया है सेलुलर सूजन के. एससीआई के बाद कक्षों की यह multiphasic प्रतिक्रिया महत्वपूर्ण हो सकता है के लिए विशेष सेल प्रकार के चोट के बाद किसी विशिष्ट समय पर उपस्थित की भूमिका की जांच के लिए या विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं है कि चोट बढ़ सकता है के खिलाफ उपचारात्मक उपायों उत्पन्न हो सकता है. इसके अलावा, इन निष्कर्षों एससीआई के लिए इष्टतम दवा या सेल आधारित हस्तक्षेप के लिए एक उचित तर्क के विकास में सहायता कर सकते हैं.
The authors have nothing to disclose.
हम रेबेका निशि, एमएस, और क्रिस्टोफर और दाना रीव जानवरों की सर्जरी में उनकी मदद के लिए फाउंडेशन पशु UC Irvine पर कोर सुविधा के तकनीशियनों धन्यवाद. हम भी तकनीकी सहायता, पांडुलिपि, और वीडियो शूट की तैयारियाँ और एनीमेशन के लिए गैब्रिएला Funes, उषा Nekanti और Denisse मोरेनो धन्यवाद. इस शोध NINDS (RO1 AJA NS43428-01), अमेरिका के पक्षाघात परियोजना (HXN को PPA 32,574), और पुनर्योजी चिकित्सा के लिए कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट (सीआईआरएम) स्टेम सेल प्रशिक्षण पुरस्कार HXN के लिए T1 00,008 द्वारा समर्थित किया गया. KDB UC Irvine (NS007444 T32) में आणविक और सेलुलर तंत्रिका विज्ञान में प्रशिक्षण कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
OptiPrep | Fisher Scientific | NC9182490 |
HBSS | Sigma | H1387 |
Rabbit anti-rat PMN (FITC) | Accurate Chemical & Scientific | AIFAD51140 |
Mouse anti-rat ED1 (Alexa Fluor 488) | AbD Serotec | MCA341A488 |
Mouse anti-rat CD3 (FITC) | AbD Serotec | MCA772F |
Trypsin | Sigma | T9935 |
Collagenase | Sigma | C5138 |
DME | Sigma | D1152 |
MOUSE IgG1 (Alexa Fluor 488) | AbD Serotec | MCA1209A488 |
Fetal bovine serum | Hyclone | SH30070.03 |
Rabbit serum | Jackson ImmunoResearch | 011-000-120011-000-120 |
Mouse serum | Jackson ImmunoResearch | 015-000-120 |
Cell Strainer | BD Falcon | 352340 |