Summary
Flow sitometri yaralı / patolojik MSS hücresel inflamasyon Niceleme azalan hassasiyet / doğruluk, benzer boyutta ve granülasyon hücreleri olabilir lipid / miyelin enkaz karmaşıktır. Biz miyelin enkaz kaldırmak ve yaralanan omurilikte akım sitometri ile hücre algılama geliştirmek için bir hücre hazırlama yöntemi gelişmiş var.
Abstract
Morfolojik ve histolojik teknikler kullanarak yaralı bir merkezi sinir sistemi (MSS) bağışıklık hücrelerinin tespiti her zaman hücresel inflamasyon gerçek kantitatif analiz sunmamıştır. Flow sitometri, bağışıklık hücrelerinin zarar gören beyin veya omurilik dokusunda ölçmek için hızlı bir alternatif bir yöntem. Tarihsel olarak, flow sitometri, kan ya da ayrışmış dalak ve timus alınan bağışıklık hücreleri ölçmek için kullanılır olmuştur ve sadece birkaç çalışma yaralı omurilik taze ayrışmış kord dokusu kullanılarak flow sitometri ile bağışıklık hücrelerinin ölçmek için çalıştılar. Ancak, ayrışmış omurilik dokusunda hücreler için yanlış olabilir ve akış sitometresi ile elde edilen hücre sayımı güvenilirliğini azaltmak miyelin enkaz ile yoğunlaşmıştır. Biz flow sitometri yaralı omurilikte hücresel inflamasyon hassas ve güvenilir niceleyiciler, hücreleri etkili bir şekilde ayrı lipid / miyelin enkaz OptiPrep degrade sistemini kullanarak bir hücre hazırlama yöntemi gelişmiş var. (Beck & Nguyen ve ark, Beyin 2010 Şubat 133 (Pt 2):. 433-47) son çalışmada belirtildiği gibi, OptiPrep hücre hazırlama, sayar, yaralanan omurilikte hücresel inflamasyon tespit duyarlılık artmıştır yaralanma şiddeti ile korele özel hücre tipleri. Kritik, roman bu yöntemin kullanımı, 2 saat arasında değişen bir süre içinde tam bir zaman polimorfonükleer lökositlerin kursu (PMN, nötrofiller), makrofaj / mikroglia ve T-hücrelerinin SKY sonrasında akut ve kronik hücresel inflamasyon ilk karakterizasyonu hücresel inflamasyon şaşırtıcı bir roman ikinci aşaması tanımlayan 180 gün sonrası yaralanma (dpi). Bu yöntemi kullanarak hücresel inflamasyon Kapsamlı karakterizasyonu yaralı MSS nöro daha iyi anlaşılmasını sağlamak ve rasyonel tedavi stratejileri de dahil olmak üzere hücre tabanlı ve farmakolojik hem de tasarım ve uygulama için kritik olabilecek nöro multifazik önemli bir bileşeni açığa SKY yönelik müdahalelerin.
Protocol
1. Omurilik dokusunda Fototerapisi
- Spinal kord segmentleri yaralı olmayan yaralı ya da spinal kord kontüzyonu T8-T10 (T9 az yaralanma) Sprague Dawley rat disseke ve oda sıcaklığında HBSS ince makas mekanik olarak ayrışmış, önceden 1 tarif. Doku disosiasyon öncesinde, bütün omurilik sütunları kord segmentleri T8-T10 ekstraksiyon önce 5 dakika boyunca kuru buz üzerinde tutuldu.
- Doku bit santrifüj (1 dakika, 1000 rpm, oda sıcaklığında) ve 2.5 mg tripsin ve 20 dakika boyunca 37 az 5 ml DME (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Kullanıcı medya) 5 mg kollajenaz ° öğütme önce C (enzimatik ayrışmış tarafından alınan edildi ~ 10 kez oda sıcaklığında) bir cam Pasteur pipeti (9-inç).
- DME +% 10 fetal sığır serumu 10 ml enzim faaliyetlerinin engellenmesi ve ardından 40 mikron hücre süzgecinden geçirilerek süzülür hücrelere eklendi. Hızlı bir spin sonra, hücre pelletini HBSS 6 ml yeniden süspanse edildi ve OptiPrep degrade çözümleri aşağıda açıklanan üzerine yerleştirilmiştir.
2. OptiPrep degrade çözümler oluşturma
- Seyreltilmiş OptiPrep OptiPrep 01:01 MOPS Buffer (0,15 M NaCl, 10 mM MOPS pH 7.4) ile seyreltilmesi ile inşa edilmiştir.
- Dört OptiPrep degrade çözümleri karıştırma 350, 250, 200 veya 150 ul seyreltilmiş OptiPrep son hacmi 1 ml (Tablo 1) HBSS tarafından yapılmıştır.
- Dört çözüm yavaş ve dikkatli altındaki en seyreltik ve en üst (Şekil 1A) seyreltilmiş bir 15 ml konik tüp katmanları yerleştirildi.
3. Hücrelerin lipid / miyelin enkaz ayırmak
- 6 ml HBSS ayrışmış spinal hücrelerinin OptiPrep degrade çözümleri üstüne dikkatlice katmanlı oldu.
- Tüp içeren hücreler ve degrade çözümler lipid farklı katmanları içine hücre çözümü ayıran bir salıncak kova rotor (A-4-62) ile bir Eppendorf Centrifuge 5810R kullanarak santrifüj edildi (1900 rpm veya 726 RCF, 15 dakika, 20 ° C) / pelet inflamatuar hücreler, glia, ve kırmızı kan hücreleri nöronların 3 kat, takip miyelin enkaz (üst 7 ml tüp). Bazı büyük ölçekli aktive makrofajlar, monositler, makrofajlar, PMN granülositler ve lenfositler de dahil olmak üzere pek çok inflamatuvar hücreler, pelet bulundu rağmen, pelet yukarıda katmanlar halinde tespit edilemedi.
- Lipid / miyelin enkaz tabakası (üst 7 ml) aspire kaldırıldı. Hücreler daha sonra yıkanır ve 2.5 ml HBSS yeniden bekletildi ve aşağıda immunolabeling için kullanılır.
4. Flow sitometri için spesifik bağışıklık hücrelerinin Immunolabeling
- Omurilik hazırlıkları toplanan Hücreler (500 ul) pelet ve kırmızı kan hücreleri lyse için 5 dakika için 0.85% amonyum klorür (distile su ile seyreltilmiş) yeniden süspanse.
- Hücreler 500 ul HBSS ile yıkanmalı ve daha sonra, oda sıcaklığında, normal tavşan ya da fare serumu 30 dakika süreyle bloke edildi.
- Ya da sulandırılmış izotip IgG çözüm Hücreler 1 antikoru ile saat (; Fare anti-sıçan ED1 Alexa 488, Serotec veya Fare anti-sıçan CD3 Alexa 488 Tavşan anti-PMN FITC, Doğru Kimyasal ve Bilimsel) yıkanmış ve oda sıcaklığında inkübe HBSS (1:100 dilüsyon), daha önce 1 nitelendirdi.
- Hücreler 300 ul HBSS son adım sonra yeniden süspanse her adımdan sonra yukarıda ve daha sonra iki kez yıkandı.
5. Flow sitometri ile hücre nicel değerlendirmesi
- Hücre Görev yazılımı kullanarak bir FACS Calibur (Becton-Dickinson) akış sitometresinin Numuneler analiz edildi. Örnek başına 5.000 etkinlik örnekleri için okuma ve veri analizi Zirvesi (DakoCytomation) ile tamamlanmıştır.
- Flow sitometrik kapıları,, daha önce 1 açıklandığı gibi zaman noktaları arasında normalleşme için temel değerlerini ayarlamak için kontrol IgG izotip etiketli hücreleri veya yaralanmamış bir şekilde kontrol hayvanlardan omurilik hücreleri kullanılarak ayarlanır . Olumlu etiketli hücrelerin ortalama değerleri tüm örneklem yüzde (± SEM) olarak ifade edildi.
6. Temsilcisi Sonuçlar:
1 spinal PMN niceleme miyelin enkaz kaldırmak ve flow sitometri ile immün hücre algılama geliştirmek için bir OptiPrep degrade yeteneği değerlendirildi dpi (Şekil 1B), SKY 1-3 sonra PMN infiltrasyonu önceden bildirilen tepe. Alternatif olarak, aynı disseke omurilik miyelin enkaz OptiPrep çıkarmadan enzimatik ayrışmış ve benzer flow sitometri ile PMN infiltrasyonu paralel olarak değerlendirildi. Biz daha önce 1 bildirdin gibi, sağlam miyelin enkaz örneklerinde tespit PMNs'nin yüzdesini gösteren, sadece bir kısmını (% 0.5) tek başına enzimatik disosiasyon göre OptiPrep degrade arıtma yöntemi ile izole edilen örneklerde olayların konumunda bir değişim var . OptiPrep purif tespit PMNs'nin yüzdesi (% 5.1)IED örnekleri (Şekil 1B). Bu veriler doku hazırlıkları miyelin enkaz akım sitometrik okuma belirsiz olduğunu göstermektedir ve bu miyelin enkaz kaldırma yaralı omurilik dokusunda immün hücre algılama hassasiyeti artırır göstermek.
Yaralı omurilik hücre tespiti için OptiPrep degrade sisteminin hassasiyeti tespit ettikten sonra, 2 saat ile 180 dpi arasında değişen bir süre içinde hücresel infiltrasyon değişiklikler karakterize ve PMN, makrofajlar dahil SKY sonra hücresel inflamasyon bir roman multifazik yanıt kurdu / mikroglia ve T-hücrelerinin. 1-3 önceki çalışmalar tarafından onaylandıktan sonra, PMN-yaralanma sonrası ilk 2 saat kablosu girdi ve 1 dpi (Şekil 2 & 4) zirve yaptı. Öte yandan 1,4,5 Makrofajlar / mikroglia 3 dpi kadar yaralı spinal kord tespit ve başlangıçta 7 dpi (Şekil 3 ve 4) zirve yaptı değildi. Hayret, biz ilk defa makrofaj / mikroglia doruğa için ikinci kez 60 dpi ve 180 dpi (Şekil 3 ve 4) ile yüksek kaldı göstermektedir. Makrofaj / mikroglia, benzer şekilde T-hücre infiltrasyonu 7 dpi 5-7 zirve tahmin; ancak, flow sitometri, ilk 7 dpi yüksek bir T-hücrelerinin sayısı tespit edildi rağmen, T hücre sayısında herhangi bir değişiklik tespit etmedi 9 dpi (% 1.6) (Şekil 4). T-hücre sayısı 10 dpi, hücrelerin% 4.4 CD3 (Şekil 4) etiketli hangi zaman kalıcı bir T-hücre yanıtı, 180 dpi aracılığıyla gözlendi azalarak iken.
Birlikte, bu veriler SKY sonrasında hücresel inflamasyon (Şekil 4) bir zamana bağımlı multifazik tepki göstermek; hücresel inflamasyon ilk aşamalarında dpi ED1, bir tepe + makrofaj / mikroglia 7 dpi ve T tarafından takip PMN 1 erken tepe oluşan edildi hücreleri 9 dpi, daha sonraki aşamalarında, 60 dpi çözünürlükte makrofaj / mikroglia kayda değer bir ikinci zirve, 14 dpi sonra yükselen ve 180 dpi ile ısrar üç hücresel nüfus, oluşmuştu. Bu timecourse flow sitometri tarafından oluşturulan çalışma ve nicel veri immunolabeled omurilik bölüm 1 kantitatif stereology toplanan veriler karşılaştırılabilir sonuçlar gösteren, daha önce onaylandı.
Tablo 1. Miyelin enkaz kaldırma OptiPrep degrade hazırlanması Dört OptiPrep degrade çözümleri HBSS ve seyreltilmiş OptiPrep (OptiPrep ve MOPS 1:1 dilüsyon) kullanılarak yapılır.
Şekil 1 OptiPrep degrade yoğunlukları ayrı çoğu miyelin / yaralı spinal kord dokuların / hücrelerin flow sitometri ile enkaz ve immün hücre değerlendirmesi geliştirmek. (A) Miyelin / enkaz miyelin / enkaz tabakası aspirasyonu ile takip OptiPrep degrade ile santrifüj sonra ayrışmış omurilik dokusu hücreleri (nöronlar, glia ve bağışıklık hücreleri) ayrıldı. (B) omurilik yaralı PMN numarası, enkaz kaldırma sonra PMN tespit artmış duyarlılık gösteren (Student t-testi, p = 0.0001). N = 5, grup başına ortalama ± SEM, tüm akım sitometrik kapıları yaralanmamış bir şekilde hayvanlardan etiketli hücreleri kullanılarak belirlenmiştir. Örnek başına 5.000 etkinlik örnekleri için okuma ve pozitif işaretli hücrelerin ortalama değerleri tüm örneklem yüzde (± SEM) olarak ifade edildi.
Şekil 2 akış sitometri yaralanan omurilikte PMN infiltrasyonu Algılama. T9 (200 kd) ılımlı bir kontüzyon yaralanma sonrası, PMN hızlı başlayan ve 2 saat (B) post-yaralanma 1 dpi (C) zirve omurilik girdi. Bütün akış sitometrik kapıları yaralanmamış bir şekilde hayvanlar etiketli hücreleri (A) kullanılarak belirlendi.
Şekil 3 flow sitometri yaralı omurilikte makrofaj / mikroglia infiltrasyon tespiti. T9 az bir orta (200 kd) kontüzyon yaralanma sonra ED1 + makrofaj / mikroglia sayısını 3 dpi (D) başlayan, yaralı spinal kord artan 7 dpi (E) akut zirve yaptı, 14 dpi (F) düşük seviyelere gerilemiştir , daha önce ikinci bir 60 dpi (G) zirvesine yükselen ve 180 dpi (H) omurilik yaralı kaldı. 7 dpi spinal hücrelerinin IgG izotip kontrol etiketleme (B) minimal antikor etiketleme arka plan ve 2 saat antikor etiketli hücreleri sonrası yaralı (C) veya yaralanmamış bir şekilde (A) hayvanlar için hiçbir fark gösterdi. Bütün akış sitometrik kapıları, yaralanmamış bir şekilde hayvanlardan etiketli hücreleri kullanarak kuruldu.
Tablo 2. Timecourse deneyler Hayvan örnekleri her zaman noktası (0 saat 180 dpi), beş hayvan, T9 (200 kd) ılımlı bir kontüzyon yaralanma aldıve omurilik dokularında PMN, ED1 + makrofaj / mikroglia ve CD3 + T hücreleri numaraları için flow sitometri ile değerlendirildi. Ancak, tüm hayvan örnekleri PMN (4-5), ED1 (3-5) ve CD3 (4-5) akış sitometri analizleri için başarıyla kurtarıldı.
Şekil 4 T9 ılımlı (200 kd) kontüzyon yaralanma omurilik hücresel inflamasyon timecourse. + T-hücrelerinin flow sitometri, PMNs'nin numaraları, ED1 + makrofaj / mikroglia ve CD3 tarafından değerlendirilir gibi akut zirve yaptı (sırasıyla 1,7 ve 9 dpi) ve kronik omurilik yaralı ısrar n = 3 ila 5 ortalama grubu, ortalama ± SEM.
Discussion
MSS bağışıklık hücrelerinin ölçmek için flow sitometri lipid / miyelin içerik ve enkaz karmaşıktır. Antikor bağlanma ve özgüllük ile müdahale yanı sıra, miyelin enkaz, ölçü hassasiyeti ve doğruluğu 8 azalan bağışıklık sistemi hücrelerine benzer boyut ve granülasyon özellikleri olabilir. Burada açıklanan yeni hücre hazırlama yöntemi miyelin enkaz giderilmesinde etkilidir ve böylece yaralı omurilik hücresel inflamasyon değişiklikleri belirlemek için flow sitometri duyarlılığını artırır. SKY PMN için bir tam zamanlı kursa dahil sonra Örneğin, bağışıklık hücreleri bu yöntemi gelişmiş algılama miyelin enkaz kaldırma alone.Critically enzimatik ayrılma göre, bu yöntemin yeni kullanımı, akut ve kronik hücresel inflamasyon ilk karakterizasyonu izin makrofaj / mikroglia ve T-hücrelerinin, 180 dpi ve hücresel inflamasyon bir roman ikinci aşaması belirledi. Nöro bir multifazik bileşeni Bu önemli bulgular SKY için her iki hücre tabanlı ve farmakolojik müdahaleler de dahil olmak üzere rasyonel tedavi stratejileri, tasarlanması ve uygulanması için kritik olabilir.
OptiPrep degrade sistemi, beyin hücre kültürü amacıyla 10 9 kan hücreleri veya saflaştırmak nöronlar ayrı enkaz olmuştur, ancak, değiştirilmiş ve omurilik ayrışmış hücreleri miyelin enkaz ayırmak için bu yöntemi sistemi gelişmiş ve izin flow sitometri ile hücresel inflamasyon hızlı ve daha doğru kantifikasyon. Bu yöntem, flow sitometri ile birlikte birçok çalışmanın sadece hücre türüne özgü değildir ya da her zaman doğru sağlayamaz morfolojik ve histolojik teknikler kullanarak CNS hücresel inflamasyon karakterize olduğu gibi, merkezi sinir sistemi yaralanma veya patolojik durumların sonra inflamasyon araştırmalarda önemli bir ilerleme sağlamak olasıdır kantitatif değerlendirilmesi. Ayrıca, bir kaç son çalışmalar, bağışıklık hücrelerinin taze ayrışmış kord doku 11,12 veya Percoll degrade sistemi 13 ayrılmış hücreler kullanılarak flow sitometri ile spinal kord yaralı ölçmek için çalıştılar; Ancak, bu çalışmalar düşük hücre verimi ya da göstermiştir veya duyarsız var bağışıklık hücrelerinin algılama.
Buna karşılık, OptiPrep degrade hücre hazırlama yöntemi, ilk kez kademeli yaralanma şiddetine tepki olarak ve 180 dpi kadar uzun bir timecourse üzerinden hücresel inflamasyon değişiklikleri flow sitometri ile hassas ve güvenilir kantitatif değerlendirme sağladı. Akım sitometri analizi hassasiyet ve güvenilirlik de spesifik immün hücre türlerini tespit etmek için kullanılan antikorların özgüllüğü bağlıdır, flow sitometri olarak morfolojik kriterlerinin daha fazla hücre tiplerini ayırt etmek için izin vermez. PMN, makrofaj / mikroglia ya da T-söyler antikor özgüllüğü yaralı omurilik dokusu 1,2 kültür ve hücrelerin periton PMN ve alveoler makrofajlar için flow sitometri iyice test edilmiştir. OptiPrep degrade sistemi ile birlikte, flow sitometri için kullanılan bu antikorlar, hücresel inflamasyon, SCI mikroçevresinin dinamikleri yeni anlayış sağlamış ve ilk kez uzun bir multifazik yanıt için belirlenen bir zamansal ve kantitatif analiz nesil katkıda bulunmuştur hücresel inflamasyon. SKY sonrasında hücrelerin Bu multifazik yanıt yaralanma sonrası belirli zamanlarda belirli hücre tiplerinin rolünü araştırmak veya yaralanmalara kötüleştirebilir belirli bir hücre türlerine karşı terapötik girişimlerin oluşturmak için önemli olabilir. Ayrıca, bu bulgular SKY için en uygun ilaç ya da hücre tabanlı müdahaleler için uygun bir gerekçe gelişimine yardımcı olabilir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz Rebecca Nishi, MS, ve hayvan cerrahi yardım UC Irvine Christopher ve Dana Reeve Vakfı Hayvan Çekirdek Tesis teknisyenleri teşekkür ederim. Ayrıca, teknik yardım, el yazması ve video çekimi hazırlıkları ve animasyon Gabriella Funes, Usha Nekanti ve Denisse Moreno teşekkür ederim. Bu araştırma, NINDS (AJA RO1 NS43428-01), Amerika Felç Projesi (PPA-32.574 - HXN için) ve California Rejeneratif Tıp Enstitüsü (CIRM) Kök Hücre Eğitim Ödülü HXN T1-00008 tarafından desteklenmiştir. KDB UC Irvine (T32 NS007444) moleküler ve hücresel nörobilim eğitim programı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OptiPrep | Fisher Scientific | NC9182490 | |
| HBSS | Sigma-Aldrich | H1387 | |
| Rabbit anti-rat PMN (FITC) | Accurate Chemical & Scientific Corporation | AIFAD51140 | |
| Mouse anti-rat ED1 (Alexa Fluor 488) | AbD Serotec | MCA341A488 | |
| Mouse anti-rat CD3 (FITC) | AbD Serotec | MCA772F | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| DME | Sigma-Aldrich | D1152 | |
| MOUSE IgG1 (Alexa Fluor 488) | AbD Serotec | MCA1209A488 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30070.03 | |
| Rabbit serum | Jackson ImmunoResearch | 011-000-120011-000-120 | |
| Mouse serum | Jackson ImmunoResearch | 015-000-120 | |
| Cell Strainer | BD Biosciences | 352340 |
References
- Beck, K. D. Quantitative analysis of cellular inflammation after traumatic spinal cord injury: evidence for a multiphasic inflammatory response in the acute to chronic environment. Brain. 133, 433-447 (2010).
- Nguyen, H. X., Galvan, M. D., Anderson, A. J. Characterization of early and terminal complement proteins associated with polymorphonuclear leukocytes in vitro and in vivo after spinal cord injury. J Neuroinflammation. 5, 26-26 (2008).
- Saville, L. R. A monoclonal antibody to CD11d reduces the inflammatory infiltrate into the injured spinal cord: a potential neuroprotective treatment. J Neuroimmunol. 156, 42-57 (2004).
- Popovich, P. G., Wei, P., Stokes, B. T. Cellular inflammatory response after spinal cord injury in Sprague-Dawley and Lewis rats. J Comp Neurol. 377, 443-464 (1997).
- Popovich, P. G. Depletion of hematogenous macrophages promotes partial hindlimb recovery and neuroanatomical repair after experimental spinal cord injury. Exp Neurol. 158, 351-365 (1999).
- Jones, T. B., Hart, R. P., Popovich, P. G. Molecular control of physiological and pathological T-cell recruitment after mouse spinal cord injury. J Neurosci. 25, 6576-6583 (2005).
- Kigerl, K. A., McGaughy, V. M., Popovich, P. G. Comparative analysis of lesion development and intraspinal inflammation in four strains of mice following spinal contusion injury. J Comp Neurol. 494, 578-594 (2006).
- Lipton, H. L., Kallio, P., Jelachich, M. L. Simplified quantitative analysis of spinal cord cells from Theiler's virus-infected mice without the requirement for myelin debris removal. J Immunol Methods. 299, 107-115 (2005).
- Bagamery, K., Kvell, K., Landau, R., Graham, J. Flow cytometric analysis of CD41-labeled platelets isolated by the rapid, one-step OptiPrep method from human blood. Cytometry A. 65, 84-87 (2005).
- Majd, S., Zarifkar, A., Rastegar, K., Takhshid, M. A. Culturing adult rat hippocampal neurons with long-interval changing media. Iran Biomed J. 12, 101-107 (2008).
- Tjoa, T. The use of flow cytometry to assess neutrophil infiltration in the injured murine spinal cord. J Neurosci Methods. 129, 49-59 (2003).
- Gonzalez, R., Glaser, J., Liu, M. T., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Reducing inflammation decreases secondary degeneration and functional deficit after spinal cord injury. Exp Neurol. 184, 456-463 (2003).
- Stirling, D. P., Yong, V. W. Dynamics of the inflammatory response after murine spinal cord injury revealed by flow cytometry. J Neurosci Res. 86, 1944-1958 (2008).
