Summary
Die Quantifizierung des zellulären Entzündung im verletzten / pathologischen ZNS mittels Durchflusszytometrie wird durch Lipid / Myelin Trümmer, die ähnliche Größe und Granulierung von Zellen haben kann, eine verringerte Empfindlichkeit / Genauigkeit kompliziert. Wir haben eine Zelle Herstellungsmethode des Myelins Ablagerungen zu entfernen und zu verbessern Zelldetektion mittels Durchflusszytometrie in das verletzte Rückenmark fortgeschritten.
Abstract
Nachweis von Immunzellen in die verletzte zentrale Nervensystem (ZNS) mit morphologischen oder histologischen Techniken nicht immer wahr quantitative Analyse von zellulären Entzündung zur Verfügung gestellt. Die Durchflusszytometrie ist eine schnelle alternative Methode zur Immunzellen im verletzten Gehirn oder Rückenmark zu quantifizieren. Historisch gesehen hat die Durchflusszytometrie verwendet worden, um Immunzellen aus dem Blut oder dissoziierte Milz oder Thymus gesammelt zu quantifizieren, und nur wenige Studien haben versucht, Immunzellen in das verletzte Rückenmark Quantifizierung mittels Durchflusszytometrie mit frischen dissoziiert Schnur Gewebe. Allerdings ist die distanzierte Rückenmark mit Myelin Trümmer, die für Zellen verwechselt werden können und reduzieren Zellzahl Zuverlässigkeit durch das Durchflusszytometer erhalten konzentriert. Wir haben eine Zelle Herstellungsverfahren mit dem OptiPrep Gradientensystem wirksam zu trennen Lipid / Myelin Trümmer von Zellen, die Bereitstellung empfindlicher und zuverlässiger Quantifizierungen der zellulären Entzündung in das verletzte Rückenmark mittels Durchflusszytometrie fortgeschritten. Wie in unserer letzten Studie beschrieben (Beck & Nguyen et al, Brain 2010 Feb; 133 (Pt 2):.. 433-47) hatte der OptiPrep Zellpräparation Sensibilität für zelluläre Entzündung in das verletzte Rückenmark erkennen erhöht, mit einer Anzahl von spezifischen Zelltypen korreliert mit Schwere der Verletzungen. Entscheidend ist, sofern neuartige Verwendung dieser Methode die erste Charakterisierung von akuten und chronischen zellulären Entzündung nach einer Rückenmarksverletzung zu einer vollständigen zeitlichen Verlauf der polymorphkernigen Leukozyten (PMN, Neutrophile), Makrophagen / Mikroglia und T-Zellen über einen Zeitraum von 2 Stunden zu zählen 180 Tage nach der Verletzung (dpi), die Identifizierung einer überraschenden Roman zweite Phase des zellulären Entzündung. Gründliche Charakterisierung der zellulären Entzündung mit dieser Methode kann ein besseres Verständnis der Neuroinflammation im verletzten ZNS liefern, und zeigen ein wichtiger Bestandteil des mehrphasigen Neuroinflammation, dass entscheidend für die Planung und Durchführung von rationalen therapeutischen Strategien, die sowohl zell-basierte und pharmakologische können Interventionen für SCI.
Protocol
1. Dissoziation von Rückenmark
- Rückenmarksegmente T8-T10 von nicht verletzt oder Quetschung des Rückenmarks verletzt (Verletzung am T9) Sprague Dawley Ratten wurden seziert und mechanisch dissoziiert mit einer feinen Schere in HBSS bei Raumtemperatur, wie zuvor 1 beschrieben. Vor Gewebedissoziation wurden ganze Rückenmark Spalten auf Trockeneis für 5 Minuten vor der Extraktion der Schnur Segmente T8-T10 gehalten.
- Tissue-Bits wurden durch Zentrifugation (1 Minute, 1000 rpm, Raumtemperatur) und enzymatisch gespalten mit 2,5 mg Trypsin und 5 mg Kollagenase in 5 ml DME (Dulbecco modifiziertem Eagle-Media) für 20 Minuten bei 37 ° C vor der Trituration (abgerufen ~ 10 Mal bei Raumtemperatur) mit einem Glas Pasteurpipette (9-Zoll).
- 10 ml DME + 10% fötalem Rinderserum wurde, um Zellen hinzugefügt, um Enzymaktivitäten hemmen und wurde dann durch ein 40 um Zellsieb gefiltert. Nach einer schnellen Spin, wurde das Zellpellet in 6 ml HBSS resuspendiert und überlagert auf OptiPrep Gradienten-Lösungen beschrieben.
2. Erstellen OptiPrep Gradienten-Lösungen
- Das verwässerte OptiPrep wurde durch Verdünnung OptiPrep 1:1 mit MOPS-Puffer (0,15 M NaCl, 10 mM MOPS, pH 7,4) gebaut.
- Vier OptiPrep Gradienten-Lösungen wurden durch Mischen von 350, 250, 200 oder 150 ul verdünnt OptiPrep mit HBSS auf ein Endvolumen von 1 ml (Tabelle 1).
- Die vier Lösungen wurden langsam und vorsichtig in Schichten in einem 15 ml konischen Röhrchen gegeben mit der geringsten Verdünnung auf den Boden und die meisten verdünnten auf der Oberseite (Abbildung 1A).
3. Die Trennung Lipid / Myelin Trümmer von Zellen
- 6 ml dissoziierter spinalen Zellen in HBSS wurde sorgfältig auf der Oberseite des OptiPrep Gradienten Lösungen geschichtet.
- Röhrchen mit Zellen und Gradienten-Lösungen wurde zentrifugiert (15 Minuten, 1900 rpm oder 726 RCF, 20 ° C) mit einer Eppendorf-Zentrifuge 5810R mit einem Ausschwingrotor (A-4 bis 62), die Trennung der Zell-Lösung in verschiedene Schichten mit Lipid / Myelin Trümmer (top 7 ml Tube), gefolgt von 3 Schichten von Neuronen, die mit entzündlichen Zellen, Gliazellen, und die roten Blutkörperchen in das Pellet gefolgt. Obwohl die meisten entzündlichen Zellen, einschließlich Monozyten, Makrophagen, PMN Granulozyten und Lymphozyten in das Pellet gefunden wurden, könnten einige großformatige-aktivierten Makrophagen in Schichten oberhalb des Pellet gefunden werden.
- Die Lipid / Myelin Trümmer Schicht (oben 7 ml) wurde vorsichtig abgesaugt und abgeführt. Die Zellen wurden dann gewaschen und in 2,5 ml HBSS und für Immunomarkierung unten.
4. Immunomarkierung von spezifischen Immunzellen für die Durchflusszytometrie
- Cells (500 ul) aus Rückenmark Präparate gesammelt wurden pelletiert und in 0,85% Ammoniumchlorid (verdünnt in destilliertem Wasser) für 5 Minuten, um rote Blutkörperchen zu lysieren.
- Die Zellen wurden mit 500 ul HBSS gewaschen und anschließend für 30 Minuten in normales Kaninchen oder Maus-Serum bei Raumtemperatur blockiert.
- Die Zellen wurden gewaschen und bei Raumtemperatur für 1 Stunde mit dem Antikörper (Rabbit anti-PMN FITC, Accurate Chemical und Scientific; Maus anti-Ratte ED1 Alexa 488, Serotec, oder Maus-anti-Ratte CD3 Alexa 488) oder Isotyp IgG-Lösung verdünnt in HBSS (alle bei 1:100 Verdünnung), wie zuvor beschrieben 1.
- Die Zellen wurden zweimal nach jedem Schritt vor und dann in 300 ul HBSS nach dem letzten Schritt resuspendiert.
5. Zell-quantitative Bewertung mittels Durchflusszytometrie
- Die Proben wurden auf einem FACS Calibur (Becton-Dickinson) Durchflusszytometer mit Cell Quest Software analysiert. 5.000 Veranstaltungen pro Probe wurden für alle Proben zu lesen, und Daten-Analyse wurde mit Summit (DakoCytomation) abgeschlossen.
- Durchflusszytometrische Tore gesetzt wurden mit Kontroll-IgG Isotyp markierten Zellen oder Rückenmark Zellen aus unverletzten Kontrolltieren zu den Ausgangswerten für die Normalisierung über Zeitpunkte festlegen, wie vorher beschrieben 1. Die Mittelwerte der positiv markierten Zellen wurden in Prozent (± SEM) der gesamten Probe ausgedrückt.
6. Repräsentative Ergebnisse:
Die Fähigkeit eines OptiPrep Gradienten Myelin Ablagerungen zu entfernen und zu verbessern Immunzellen Detektion mittels Durchflusszytometrie wurde durch Quantifizierung der Wirbelsäule PMNs bei 1 beurteilt dpi (Abbildung 1B), die zuvor berichteten Höhepunkt der PMN-Infiltration nach SCI 1-3. Alternativ wurden identisch seziert Rückenmark enzymatisch gespalten, ohne OptiPrep-Entfernung von Myelin Trümmer und wurden in ähnlicher Weise parallel zur PMN-Infiltration mittels Durchflusszytometrie untersucht. Wie wir bereits 1 berichtet haben, gab es eine Verschiebung der Position der Ereignisse in Proben mit OptiPrep Gradientenreinigung Methode im Vergleich zu enzymatischen Dissoziation allein isoliert, demonstrierte der Anteil der PMN in Proben mit intakten Myelin Trümmer entdeckt nur ein Bruchteil (0,5%) der Anteil der PMN festgestellt (5,1%) in OptiPrep purifIED Proben (Abbildung 1B). Diese Daten legen nahe, dass Myelin Trümmer im Gewebe Zubereitungen können durchflusszytometrischen Messungen dunkel, und zeigen, dass das Entfernen von Myelin Trümmer verbessert die Empfindlichkeit von Immunzellen Erkennung in das verletzte Rückenmark Gewebe.
Nachdem festgestellt wurde, die Empfindlichkeit des OptiPrep Gradientensystem für die Zell-Erkennung in das verletzte Rückenmark, charakterisierten wir Veränderungen in der zellulären Infiltration über einen Zeitraum von 2 Stunden auf 180 dpi und gründete eine neue mehrphasige Reaktion der zellulären Entzündung nach einer Rückenmarksverletzung, die PMN, Makrophagen aufgenommen / Mikroglia und T-Zellen. Wie frühere Studien 1-3 bestätigt, PMNs zuerst in das Kabel um 2 Uhr nach der Verletzung und erreichte bei 1 dpi (Abb. 2 & 4). Makrophagen / Mikroglia auf der anderen Seite 1,4,5, wurden nicht in das verletzte Rückenmark bis 3 dpi erkannt, und erreichte zunächst bei 7 dpi (Abbildung 3 und 4). Überraschenderweise zeigen wir zum ersten Mal, dass Makrophagen / Mikroglia zum zweiten Mal 60 dpi Höhepunkt und blieb erhöhten durch 180 dpi (Abbildung 3 und 4). Ähnlich wie Makrophagen / Mikroglia, T-Zell-Infiltration wurde vorhergesagt, bis 7 dpi 5-7 Spitze, aber Durchflusszytometrie zeigten keinen Veränderungen in der T-Zell-Zahl in den ersten 7 dpi, obwohl eine erhöhte Anzahl von T-Zellen erkannt wurde um 9 dpi (1,6%) (Abbildung 4). Während T-Zellzahl um 10 dpi, eine anhaltende T-Zell-Antwort wurde durch 180 dpi beobachtet, zu welchem Zeitpunkt 4,4% der Zellen für CD3 (Abbildung 4) wurden als rückläufig.
Zusammen zeigen diese Daten eine zeitabhängige mehrphasige Reaktion der zellulären Entzündung nach SCI (Abbildung 4); den ersten Phasen der zellulären Entzündung wurden von den frühen Höhepunkt der PMNs 1 enthielt dpi, gefolgt von einem Spitzenwert von ED1 + Makrophagen / Mikroglia 7 dpi und T -Zellen 9 dpi, während die späteren Phasen wurden von allen drei Zellpopulationen steigende nach 14 dpi und persistierende durch 180 dpi, mit einer bemerkenswerten zweiten Peak von Makrophagen / Mikroglia bei 60 dpi zusammen. Dieser Zeitverlauf studieren und die quantitativen Daten mittels Durchflusszytometrie generiert wurden zuvor validierten zeigen vergleichbare Ergebnisse, Daten aus quantitativen Stereologie von immunolabeled Rückenmark Abschnitte 1 gesammelt.
Tabelle 1. Vorbereitung der OptiPrep Gradienten für die Entfernung von Myelin Trümmer. Four OptiPrep Gradienten-Lösungen werden mit HBSS verdünnt und OptiPrep (1:1 Verdünnung OptiPrep und MOPS).
Abbildung 1. OptiPrep Gradienten Dichten trennen meisten Myelin / Trümmer verletzten Rückenmarks Gewebe / Zellen und verbessern Immunzellen Beurteilung mittels Durchflusszytometrie. (A) Myelin / Schutt wurde aus Zellen (Neuronen, Glia-und Immunzellen) nach Zentrifugation dissoziierter Rückenmark durch eine OptiPrep Gradienten durch Aspiration von Myelin / Schüttschichtfiltertechnik gefolgt getrennt. (B) PMN Zahl in das verletzte Rückenmark, zeigen eine erhöhte Empfindlichkeit bei der Erkennung PMNs nach Schmutzentfernung (Student-t-Test, p = 0,0001). Alle durchflusszytometrischen Tore gesetzt wurden unter Verwendung von markierten Zellen aus unverletzten Tiere; n = 5 pro Gruppe, Mittelwert ± SEM. 5.000 Veranstaltungen pro Probe wurden für alle Proben zu lesen und die Mittelwerte der positiv markierten Zellen wurden in Prozent (± SEM) der gesamten Probe ausgedrückt.
Abbildung 2. Erkennung von PMN-Infiltration in das verletzte Rückenmark mittels Durchflusszytometrie. Nach einem moderaten (200 kd) Prellung Verletzungen bei T9, PMNs schnell in das Rückenmark ab 2 Stunden (B) nach der Verletzung und Peaking 1 dpi (C). Alle durchflusszytometrischen Tore gesetzt wurden unter Verwendung von markierten Zellen aus unverletzten Tiere (A).
Abbildung 3. Erkennung von Makrophagen / Mikroglia Infiltration in das verletzte Rückenmark mittels Durchflusszytometrie. Nach einem moderaten (200 kd) Prellung Verletzungen bei T9, ED1 + Makrophagen / Mikroglia Zahl in das verletzte Rückenmark erhöht ab 3 dpi (D), erreichte akut bei 7 dpi (E) sank auf ein niedriges Niveau bei 14 dpi (F) , bevor sie sich zu einem zweiten Peak bei 60 dpi (G), und blieb in das verletzte Rückenmark bis zu 180 dpi (H). IgG Isotyp-Kontroll-Kennzeichnung von 7 dpi spinalen Zellen (B) zeigte minimale Antikörper-Kennzeichnung Hintergrund und keinen Unterschied zu Antikörper-markierte Zellen aus 2 Stunden post-Verletzten (C) oder unverletzt (A) Tiere. Alle durchflusszytometrischen Tore gesetzt wurden unter Verwendung von markierten Zellen aus unverletzten Tiere.
Tabelle 2. Tierische Proben in Zeitverlauf Experimente. Für jeden Zeitpunkt (0 h bis 180 dpi), erhielt fünf Tiere einer moderaten (200 kd) Prellung Verletzungen bei T9,und Rückenmark Gewebe wurden mittels Durchflusszytometrie für die Zahl der neutrophilen Granulozyten, ED1 + Makrophagen / Mikroglia und CD3 + T-Zellen untersucht. Allerdings waren nicht alle tierischen Proben erfolgreich für PMN (4-5), ED1 (3-5) und CD3 (4-5) mittels Durchflusszytometrie analysiert erholt.
Abbildung 4. Ein Zeitverlauf der zellulären Entzündung im Rückenmark nach einer moderaten (200 kd) Prellung Verletzungen bei T9. Wie mittels Durchflusszytometrie, die Zahl der neutrophilen Granulozyten, ED1 + Makrophagen / Mikroglia und CD3 beurteilt + T-Zellen erreichte akut (1,7 und 9 dpi, jeweils) und blieb chronisch in das verletzte Rückenmark. N = 3 bis 5 pro Gruppe, Mittelwert ± SEM.
Discussion
Der Einsatz der Durchflusszytometrie an Immunzellen in das ZNS zu quantifizieren ist durch Lipid / Myelin Inhalt und Schutt kompliziert. Neben der Zusammenarbeit mit Antikörper-Bindung und Spezifität beeinträchtigen können Myelin Trümmer haben ähnliche Größe und Granulierung Eigenschaften Immunzellen, abnehmende Messempfindlichkeit und Genauigkeit 8. Der Roman Zellpräparation hier beschriebene Methode ist wirksam bei der Beseitigung von Myelin Schutt und verbessert dadurch die Empfindlichkeit der Durchflusszytometrie auf Veränderungen in der zellulären Entzündung in das verletzte Rückenmark zu erkennen. Zum Beispiel das Entfernen von Myelin Trümmer mit dieser Methode bessere Erkennung von Immunzellen zur enzymatischen Dissoziation alone.Critically Vergleich erlaubt neuartige Verwendung dieser Methode die erste Charakterisierung von akuten und chronischen zellulären Entzündung nach SCI eine komplette zeitliche Verlauf für PMNs enthalten, um, Makrophagen / Mikroglia und T-Zellen bis zu 180 dpi, und nannte eine neue zweite Phase des zellulären Entzündung. Diese wichtigen Ergebnisse einer mehrphasigen Bestandteil Neuroinflammation kann entscheidend sein für die Gestaltung und Umsetzung der rationalen therapeutischen Strategien, die sowohl zell-basierte und pharmakologische Interventionen zur SCI.
Die OptiPrep Gradienten System zu trennen Trümmer von Zellen im Blut 9, oder zu reinigen Neuronen im Gehirn für die Zellkultur Zwecke 10 verwendet, jedoch haben wir geändert und erweiterte diese Methode System Myelin Trümmer Rückenmark dissoziierten Zellen zu trennen, und erlaubt schnelle und genauere Quantifizierung der zellulären Entzündung mittels Durchflusszytometrie. Diese Methode zusammen mit der Durchflusszytometrie ist wahrscheinlich bedeutenden Fortschritt in der Entzündungsforschung bieten nach ZNS-Verletzungen oder pathologischen Bedingungen, da die meisten Studien haben nur zelluläre Entzündung im ZNS durch morphologische und histologische Techniken, die nicht Zelltyp-spezifisch oder kann nicht immer wahr charakterisiert quantitative Bewertung. Darüber hinaus haben einige neuere Studien haben versucht, Immunzellen in das verletzte Rückenmark Quantifizierung mittels Durchflusszytometrie mit frischen dissoziiert Schnur Gewebe 11,12 oder Zellen durch die Percoll-Gradient-System 13 getrennt, aber diese Studien entweder niedrig Zellausbeuten nachgewiesen oder unempfindlich Nachweis von Immunzellen.
Im Gegensatz dazu hat die OptiPrep Gradienten Zellpräparation Methode zum ersten Mal zur Verfügung gestellt, empfindliche und zuverlässige quantitative Bewertung mittels Durchflusszytometrie, um Änderungen der zellulären Entzündung als Reaktion auf abgestufte Verletzungsschwere und über einen längeren Zeitverlauf bis zu 180 dpi. Die Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit der durchflusszytometrischen Analyse auch auf die Spezifität der Antikörper verwendet, um bestimmte Zelltypen erkennen abhängen, nicht wie die Durchflusszytometrie nicht zulassen morphologischen Kriterien weiter zu unterscheiden Zelltypen. Die Spezifität der Antikörper für die PMN, Makrophagen / Mikroglia oder T-sagt wurde gründlich in der Durchflusszytometrie für die Peritonealdialyse PMNs und Alveolarmakrophagen in Kultur und Zellen in das verletzte Rückenmark Gewebe 1,2 getestet. Zusammen mit dem OptiPrep Gradientensystem, haben diese Antikörper für die Durchflusszytometrie verwendet werden, um die Erzeugung einer zeitlichen und quantitativen Analyse von zellulären Entzündung, die neue Einblicke zur Verfügung gestellt hat in der Dynamik des SCI-Mikroumgebung, und identifiziert zum ersten Mal einen längeren mehrphasige Reaktion beigetragen von zellulären Entzündung. Dieses mehrphasige Reaktion der Zellen nach SCI kann wichtig sein, die Rolle spezifischer Zelltypen zu bestimmten Zeiten nach der Verletzung zu untersuchen oder erzeugen therapeutische Interventionen gegen bestimmte Zelltypen, die Verletzungen verschlimmern kann. Darüber hinaus können diese Erkenntnisse in die Entwicklung einer geeigneten Begründung für die optimale Arzneimittel-oder Zell-basierte Interventionen für SCI zu unterstützen.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir danken Rebecca Nishi, MS, und die Techniker des Christopher & Dana Reeve Foundation Tier Core Facility an der UC Irvine für ihre Hilfe in der Tier-Chirurgie. Wir danken auch Gabriella Funes, Usha Nekanti und Denisse Moreno für die technische Unterstützung, Manuskript und Video-Dreh Vorbereitungen und Animation. Diese Arbeit wurde durch NINDS (RO1 NS43428-01 bis AJA), die Lähmung Projekt von Amerika (PPA-32574 zu HXN) und California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) Stem Cell Training Award T1-00008 zu HXN unterstützt. KDB wurde von der Ausbildung in der molekularen und zellulären Neurowissenschaften an der UC Irvine (T32 NS007444) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OptiPrep | Fisher Scientific | NC9182490 | |
| HBSS | Sigma-Aldrich | H1387 | |
| Rabbit anti-rat PMN (FITC) | Accurate Chemical & Scientific Corporation | AIFAD51140 | |
| Mouse anti-rat ED1 (Alexa Fluor 488) | AbD Serotec | MCA341A488 | |
| Mouse anti-rat CD3 (FITC) | AbD Serotec | MCA772F | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| DME | Sigma-Aldrich | D1152 | |
| MOUSE IgG1 (Alexa Fluor 488) | AbD Serotec | MCA1209A488 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30070.03 | |
| Rabbit serum | Jackson ImmunoResearch | 011-000-120011-000-120 | |
| Mouse serum | Jackson ImmunoResearch | 015-000-120 | |
| Cell Strainer | BD Biosciences | 352340 |
References
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