Summary
フローサイトメトリーによる負傷者/病理学的な中枢神経系における細胞性炎症の定量は感度/精度を低下させる、細胞に類似した大きさと造粒を持つことができる脂質/ミエリン破片によって複雑になる。我々は、ミエリン破片を除去し、損傷した脊髄のフローサイトメトリーによって細胞の検出を向上させるために細胞の調製法を進めてきた。
Abstract
形態学的または組織学的手法を用いて負傷した中枢神経系の免疫細胞（CNS）の検出は、常に細胞の炎症の真の定量分析が提供されていない。フローサイトメトリーは負傷し、脳や脊髄の組織に免疫細胞を定量化するために迅速な方法の一つです。歴史的に、フローサイトメトリーは、血液または解離脾臓または胸腺から採取した免疫細胞を定量するために使用されている、とだけいくつかの研究では、新鮮な解離脊髄組織を用いたフローサイトメトリーにより損傷した脊髄の免疫細胞を定量することを試みた。しかし、解離脊髄組織は、細胞と誤認し、フローサイトメーターにより得られた細胞数の信頼性を減らすことができますミエリン破片に集中している。我々は、フローサイトメトリーによる脊髄損傷における細胞性炎症の高感度かつ信頼性の高い、数量を提供して、細胞から効率的に別個の脂質/ミエリン破片にOptiPrep勾配系を用いて細胞の調製法を進めてきた。我々の最近の研究（。。ベック＆グエンら、脳2010年2月、133（パート2）：433〜47）に記載されているように、OptiPrepの細胞調製はのカウントで、損傷した脊髄の細胞の炎症を検出する感度を増加していた傷害の重症度と相関する特定の細胞タイプ。批判的に、このメソッドの小説用法は2時間からに至るまでの期間にわたって多形核白血球（PMNは、好中球）、マクロファージ/ミクログリア、及びT -細胞のための完全な時間の経過を含むようにSCI後の急性および慢性の細胞の炎症の最初の特性評価を提供180日後の傷害（解像度）、細胞の炎症の驚くべき小説第二段階を識別する。この方法を使用して細胞性炎症の徹底した特性評価は、負傷したCNSの神経炎症のより良い理解を提供し、セルベースおよび薬理学の両方を含む、合理的な治療戦略の設計と実装のために重要かもしれない神経炎症の重要な多面的な構成要素を明らかにすることがありますSCIのための介入。
Protocol
1。脊髄組織の解離
- 脊髄セグメント以前に1で説明した以外の負傷または挫傷脊髄の負傷のT8 - T10（T9で負傷）Sprague Dawleyラットは、室温で解剖し、HBSSで細かいハサミで機械的に解離された。組織解離に先立ち、全脊髄の列は、コードセグメントT8 - T10の抽出の前に5分間ドライアイス上で維持した。
- 37℃で遠心分離によって取得された（1分間、1000rpmで、室温）と2.5 mgのトリプシンおよび20分間5ミリリットルDME（ダルベッコ変法イーグル培地）に5 mgのコラゲナーゼで酵素的に解離された組織のビット°粉砕の前にC（〜10倍室温で）ガラスパスツールピペット（9インチ）付き。
- DME + 10％ウシ胎児血清10mlの酵素活性を阻害するために細胞に添加し、40μmのセルストレーナーに通して濾過した。クイックスピンした後、細胞ペレットをHBSS 6mlに再懸濁し、OptiPrep勾配のソリューション以下に説明の上で合成。
2。 OptiPrep勾配ソリューションを作成する
- 希釈OptiPrepはMOPSバッファー（0.15 M NaCl、10mMのMOPS、pH7.4）でOptiPrep 1:1に希釈することにより構築した。
- 四OptiPrep勾配のソリューションは、混合350、250、200、または1ミリリットル（表1）の最終容量にHBSSで150μlの希釈OptiPrepによってなされた。
- 4つのソリューションは、ゆっくりと慎重に、少なくとも下部に希釈し、上部（図1A）で最も希釈した15 mlコニカルチューブ内のレイヤーに配置した。
3。細胞から脂質/ミエリン破片の分離
- HBSSで解離脊髄細胞6mlを注意深くOptiPrep勾配のソリューションの上に重層した。
- 管を含む細胞と勾配のソリューションは、脂質との別個の層に細胞溶液を分離し、スイングバケットローター（A - 4 - 62）とエッペンドルフ遠心分離機5810Rを使用して（15分、1900 rpmまたは726 RCF、20℃）遠心したペレット中の炎症細胞、グリア、および赤血球と神経細胞の3層、続いて/ミエリンは破片（チューブの上部7 ml）を、。単球、マクロファージ、PMNの顆粒球、リンパ球を含むほとんどの炎症性細胞は、ペレットで発見されたものの、一部の大型活性化マクロファージは、ペレット上の層で見つけることができる。
- 脂質/ミエリン破片の層（上位7 ml）を注意深く吸引して除去した。次いで、細胞を洗浄し、2.5mlのHBSSに再懸濁し、下記の免疫標識に使用した。
4。フローサイトメトリーのために特定の免疫細胞の免疫標識
- 脊髄の調製物から採取した細胞（500μl）をペレット化し、赤血球を溶解するために5分間0.85％塩化アンモニウム（蒸留水で希釈）に再懸濁した。
- 細胞を500μlのHBSSで洗浄し、室温で正常ウサギやマウスの血清で30分間ブロッキングした。
- またはで希釈したアイソタイプIgG溶液セルが1抗体との時間（;マウス抗ラットED1アレクサ488、Serotecまたはマウス抗ラットCD3をアレクサ488ウサギ抗- PMN FITC、正確な化学と科学）のために洗浄し、室温でインキュベートしたHBSSは（1:100希釈ですべて）、前述1に記載。
- 細胞は、最終ステップの後に300μlのHBSSに再懸濁し、上記とし、各ステップの後に二回洗浄した。
5。フローサイトメトリーによる細胞定量的評価
- サンプルは、セルクエストソフトウェアを使用してFACSキャリバー（ベクトン- Dickinson社）フローサイトメーターで分析した。サンプルあたり5,000個のイベントは、すべてのサンプルのために読んでいた、とデータ解析は、サミット（DakoCytomation）で完成しました。
- フローサイトメトリーゲートは、以前は次の1に記載のように時間のポイント間での正規化のためのベースライン値を設定するには、無傷の対照動物からコントロールIgGアイソタイプ標識細胞や脊髄細胞を用いて設定されていました。積極的に標識された細胞の平均値は、サンプル全体のパーセント（± SEM）として表した。
6。代表的な結果：
ミエリン破片を除去し、フローサイトメトリーによる免疫細胞の検出を向上させるためにOptiPrep勾配の能力は、1解像度（図1B）、SCI 1月3日後のPMN浸潤の以前に報告されたピーク時に脊髄PMNはを定量化することによって評価した。また、同じ解剖脊髄は、ミエリン破片のOptiPrep除去することなく酵素的に解離し、同様にフローサイトメトリーによるPMN浸潤を並列に評価した。我々は以前に1を報告しているように、単独で酵素的解離に比べOptiPrep勾配精製法で分離した試料中のイベントの位置にずれがあった、無傷のミエリンの残骸のサンプルで検出されたPMNの割合を示すことはほんの一部（0.5％）であったOptiPrep purifで検出されたPMNの割合（5.1％）のIEDのサンプル（図1B）。これらのデータは、損傷した脊髄組織における免疫細胞の検出の感度を高める組織調製物中のミエリン破片がフローサイトメトリーの測定値をあいまいにし、ミエリンの破片のその除去を実証できることを示唆している。
損傷した脊髄の細胞検出のためのOptiPrep勾配系の感度を確立した後、我々は2時間から180 dpiに至るまでの期間にわたって細胞浸潤の変化を特徴とし、PMNは、マクロファージを含むSCI後の細胞の炎症の新たな多面的な応答を設立/ミクログリアとT -細胞。として1から3までの研究によって確認された、PMNは、最初の2時間後に傷害でコードを入力し、1解像度（図2＆4）でピークに達した。一方、マクロファージ/ミクログリア1,4,5は 、3解像度まで、脊髄損傷の検出、および7解像度（図3＆4）で最初にピークを迎えていませんでした。驚いたことに、我々はマクロファージ/ミクログリア第二時間60 dpiのピークと180解像度（図3＆4）を介して上昇残ったことを初めて示す。マクロファージ/ミクログリアと同様に、T細胞の浸潤は7解像度5-7ピークに達すると予測された、T -細胞の上昇数が検出されたもののしかし、フローサイトメトリーは、最初の7解像度のT細胞数の変化を検出しなかった9時解像度（1.6％）（図4）。 T細胞数が10解像度が減少した一方で、永続的なT細胞応答は細胞の4.4％がCD3（図4）のために標識した時点で180解像度、で観察した。
一緒に、これらのデータは、SCI後の細胞性炎症（図4）の時間依存性の多面的な応答を示し、細胞の炎症の初期段階は、解像度がED1のピークが続くPMNは1の初期のピークから成っていた+マクロファージ/ミクログリア7解像度及びT細胞9解像度、後での段階は、60 dpiでマクロファージ/ミクログリアの注目に値する番目のピークと、14 dpiと180解像度を通じて持続した後に上昇し、3つの細胞集団で構成されている。このtimecourseの研究およびフローサイトメトリーによって生成された定量的データは、免疫標識脊髄のセクション1の定量的な立体学から収集したデータに匹敵する結果を示し、以前に検証されています。
表1。ミエリンの破片を除去するためのOptiPrep勾配の準備。四OptiPrep勾配のソリューションをHBSSおよび希薄化後OptiPrep（OptiPrepとMOPSの1:1希釈）を使用して行われる。
図1。OptiPrep勾配の密度別のほとんどのミエリン/脊髄損傷の組織/細胞からの破片やフローサイトメトリーによる免疫細胞の評価を改善。 （A）ミエリン/残骸は、ミエリン/残骸層の吸引に続いOptiPrepの勾配を通じて解離脊髄組織の遠心分離後の細胞（ニューロン、グリアおよび免疫細胞）から分離した。脊髄損傷における（B）PMN番号、瓦礫撤去後のPMNが検出における感度の向上（スチューデントのt -検定、p = 0.0001）を示す。 nはグループごとに= 5、平均± SEM、すべてのフローサイトメトリーゲートは、無傷の動物からの標識された細胞を用いて設定されていました。サンプルあたり5,000個のイベントは、すべてのサンプルのために読んでいたし、積極的に標識された細胞の平均値は、サンプル全体のパーセント（± SEM）として表した。
図2フローサイトメトリーによる脊髄損傷におけるPMN浸潤の検出。 T9での適度な（200 KD）挫傷の傷害の後に、PMNがすぐに2時間（B）後の傷害を開始し、1解像度（C）のピーク脊髄に入った。すべてのフローサイトメトリーゲートは、無傷の動物（）から標識された細胞を使用して設定された。
図3。マクロファージ/フローサイトメトリーによる脊髄損傷におけるミクログリアの浸潤の検出。 T9での適度な（200 KD）挫傷の傷害の後、ED1 +マクロファージ/ミクログリア数は、解像度（D）3から脊髄損傷で増加して7解像度（E）で急性ピークに、14解像度（F）で低レベルに低下、前に60解像度（G）の第二ピークに上昇し、最大180解像度（H）に脊髄損傷にとどまった。 7解像度脊髄細胞のIgGアイソタイプのコントロールのラベル（B）は、最小限の抗体標識の背景と2時間からの抗体 - 標識された細胞のポスト外傷（C）または無傷（A）動物に違いを示した。すべてのフローサイトメトリーゲートは、無傷の動物からの標識された細胞を用いて設定されていました。
表2。 timecourse実験における動物のサンプルは、各時点（0時間180解像度）は、5匹の動物は、T9での適度な（200 KD）挫傷の傷害を受けたと脊髄組織はPMNは、ED1 +マクロファージ/ミクログリア、およびCD3 + T細胞の数のためにフローサイトメトリーによって評価した。ただし、すべての動物の試料はPMN（4-5）、ED1（3-5）、およびCD3（4-5）フローサイトメトリー分析のために正常に回復した。
図4。T9で中等度（200 KD）挫傷の傷害後脊髄の細胞の炎症のtimecourse。として、フローサイトメトリー、PMNの数字、ED1 +マクロファージ/ミクログリア、及びCD3によって評価+ T細胞急性ピーク（それぞれ1,7、および9解像度、）と脊髄損傷で慢性的に持続した。nは = 3〜5％グループは、平均± SEM。
Discussion
CNSでの免疫細胞を定量化するためにフローサイトメトリーの使用は、脂質/ミエリン含量と破片によって複雑になる。抗体の結合および特異性に干渉に加えて、ミエリンの残骸は、測定感度と精度が8減少、免疫細胞に類似した大きさと造粒特性を持つことができます。ここで説明する新しい細胞の調製法は、ミエリン破片の除去に有効であり、それによって損傷した脊髄の細胞の炎症の変化を検出するフローサイトメトリーの感度を向上させます。 SCIは、PMNはのための完全な時間の経過を含むようにした後、例えば、免疫細胞のこの方法の拡張検出によってミエリン破片の除去がalone.Critically酵素的解離に比べ、この方法の斬新な使用量は、急性および慢性の細胞の炎症の最初の特性を許可マクロファージ/ミクログリア、及びT -細胞の最大180 dpiの、そして細胞の炎症の新たな第二相を同定した。神経炎症の多面的なコンポーネントのこれらの重要な知見は、SCIの両方のセルベースおよび薬理学的介入を含む合理的な治療戦略の設計および実装するために重要になることがあります。
OptiPrep勾配システムは、細胞培養の目的で10の脳から血液9の細胞、または浄化するニューロンから別の破片に使用されていますが、我々は、修正や脊髄解離細胞からミエリン破片を分離するためにこのメソッドシステムを進め、および許可されているフローサイトメトリーによる細胞の炎症を迅速かつより正確に定量化。ほとんどの研究が唯一の特定の細胞型ではないか常にtrueを提供することができない形態学的および組織学的手法を用いて中枢神経系の細胞の炎症を特徴としているとして、フローサイトメトリーと一緒にこの方法では、CNSの損傷または病理学的状態の後に炎症の研究に大きな進歩を提供しそうです定量的評価。さらに、いくつかの最近の研究では、新鮮な解離脊髄組織11,12またはPercoll勾配システム13により分離された細胞を用いたフローサイトメトリーにより脊髄損傷の免疫細胞を定量化しようとしましたが、これらの研究は、低細胞収量のいずれかを実証するか区別しないしている免疫細胞の検出。
対照的に、OptiPrep勾配の細胞調製法は、最初に段階的傷害の重症度に応じて、180 dpiの拡張timecourse以上の細胞炎症の変化へのフローサイトメトリーによる高感度かつ信頼性の高い定量的な評価を提供しています。フローサイトメトリー分析の感度及び信頼性は、特定の免疫細胞の種類を検出するために使用される抗体の特異性に依存し、フローサイトメトリーとして形態学的基準は、さらに細胞の種類を区別することを許可していません。 PMNは、マクロファージ/ミクログリアやT -伝えるための抗体の特異性は、腹膜PMNは、負傷した脊髄組織の1,2の文化と細胞の肺胞マクロファージのフローサイトメトリーで徹底的にテストされています。 OptiPrep勾配のシステムと一緒に、フローサイトメトリーで使用する場合のこれらの抗体は、SCIの微小環境のダイナミクスに新たな洞察を提供している細胞の炎症の時間と定量分析の世代に貢献し、そして最初に拡張された多面的な応答を同定した細胞性炎症の。 SCI後の細胞のこの多面的な応答は、損傷後の特定の時間に存在する特定の細胞型の役割を調べるため、けがを悪化させることができる特定の細胞型に対する治療的介入を生成することが重要な場合があります。さらに、これらの知見は、SCIに最適な薬剤や細胞ベースの介入のために適切な根拠の開発を支援することがあります。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
我々は動物の手術で彼らの助けのためにレベッカ西、MS、およびカリフォルニア大学アーバイン校でのクリストファー＆ダナリーブ財団の動物中核施設の技術者に感謝。我々はまた、技術支援、原稿とビデオ撮影の準備とアニメーションのためガブリエラフネス、ウシャNekantiとDenisseモレノに感謝。この研究は、NINDS（AJAへRO1 NS43428 - 01）、アメリカの麻痺プロジェクト（HXNにPPA - 32574）、および再生医療のためのカリフォルニア工科大学（CIRM）幹細胞のトレーニング賞HXNにT1 - 00008によってサポートされていました。 KDBは、カリフォルニア大学アーバイン校（T32 NS007444）における分子細胞神経科学におけるトレーニングプログラムによってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OptiPrep | Fisher Scientific | NC9182490 | |
| HBSS | Sigma-Aldrich | H1387 | |
| Rabbit anti-rat PMN (FITC) | Accurate Chemical & Scientific Corporation | AIFAD51140 | |
| Mouse anti-rat ED1 (Alexa Fluor 488) | AbD Serotec | MCA341A488 | |
| Mouse anti-rat CD3 (FITC) | AbD Serotec | MCA772F | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| DME | Sigma-Aldrich | D1152 | |
| MOUSE IgG1 (Alexa Fluor 488) | AbD Serotec | MCA1209A488 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30070.03 | |
| Rabbit serum | Jackson ImmunoResearch | 011-000-120011-000-120 | |
| Mouse serum | Jackson ImmunoResearch | 015-000-120 | |
| Cell Strainer | BD Biosciences | 352340 |
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