Summary
Quantificazione di infiammazione cellulare nel sistema nervoso centrale feriti / patologico mediante citometria di flusso è complicata da lipidi / mielina detriti che possono avere dimensioni simili e granulazione per le cellule, diminuendo la sensibilità / precisione. Abbiamo cercato di migliorare un metodo di preparazione delle cellule per rimuovere i detriti della mielina e migliorare la rilevazione delle cellule mediante citometria di flusso nel midollo spinale danneggiato.
Abstract
Rilevamento di cellule immunitarie nel feriti sistema nervoso centrale (SNC) con tecniche morfologiche e istologiche non ha sempre fornito vera analisi quantitativa di infiammazione cellulare. Citometria di flusso è un metodo veloce alternativa per quantificare le cellule immunitarie nel cervello ferito o tessuto del midollo spinale. Storicamente, la citometria a flusso è stato utilizzato per quantificare le cellule immunitarie raccolti dal sangue o milza dissociati o timo, e solo pochi studi hanno tentato di quantificare le cellule immunitarie nel midollo spinale danneggiato mediante citometria di flusso con ingredienti freschi tessuti dissociato cavo. Tuttavia, il tessuto dissociato midollo spinale è concentrato con detriti mielina che possono essere scambiate per cellule e ridurre l'affidabilità conta delle cellule ottenute dal citometro a flusso. Abbiamo cercato di migliorare un metodo di preparazione delle cellule utilizzando il sistema gradiente OptiPrep per separare in modo efficace lipidi / mielina detriti dalle cellule, fornendo quantificazioni sensibile e affidabile di infiammazione cellulare nel midollo spinale danneggiato mediante citometria di flusso. Come descritto nel nostro recente studio (Beck & Nguyen et al, Brain 2010 Feb; 133 (Pt 2):.. 433-47), la preparazione delle cellule OptiPrep è aumentata la sensibilità per rilevare l'infiammazione cellulare nel midollo spinale danneggiato, con un numero di specifici tipi cellulari correlazione con la gravità della lesione. Criticamente, l'utilizzo di questo nuovo metodo previsto la prima caratterizzazione dei acuta e cronica infiammazione cellulare dopo SCI per includere un corso completo di tempo per leucociti polimorfonucleati (PMN, neutrofili), macrofagi / microglia e le cellule T per un periodo che varia da 2 ore 180 giorni dopo la lesione (dpi), individuando una fase sorprendente secondo romanzo di infiammazione cellulare. Caratterizzazione approfondita dei infiammazione cellulare con questo metodo può fornire una migliore comprensione della neuroinfiammazione nel SNC feriti, e rivelano una componente importante multifasico di neuroinfiammazione che possono essere critici per la progettazione e realizzazione di razionale strategie di trattamento terapeutico, sia a base di cellule e farmacologici interventi per la SCI.
Protocol
1. Dissociazione del tessuto del midollo spinale
- Segmenti del midollo spinale T8-T10 di non feriti o contusione del midollo spinale danneggiato (lesione al T9) ratti Sprague Dawley sono stati sezionati e dissociato meccanicamente con le forbici bene in HBSS a temperatura ambiente, come descritto in precedenza 1. Prima di dissociazione dei tessuti, intere colonne del midollo spinale sono stati tenuti in ghiaccio secco per 5 minuti prima dell'estrazione dei segmenti cavo T8-T10.
- Frammenti di tessuti che sono stati recuperati per centrifugazione (1 minuto, 1000 rpm, temperatura ambiente) e enzimaticamente dissociato con 2,5 mg di tripsina e 5 collagenasi mg in 5 ml DME (Dulbecco Modified Eagle Media) per 20 minuti a 37 ° C prima di triturazione (~ 10 volte a temperatura ambiente) con una pipetta Pasteur di vetro (9-pollici).
- 10 ml di DME + 10% di siero fetale bovino è stato aggiunto alle cellule di inibire l'attività enzimatica e poi è stato filtrato attraverso un colino cellula 40 micron. Dopo un giro veloce, il pellet è stato risospeso in 6 ml di HBSS e sovrapposto OptiPrep soluzioni gradiente descritto di seguito.
2. Creazione OptiPrep soluzioni gradiente
- Diluito OptiPrep è stato costruito diluendo OptiPrep 1:1 con tampone MOPS (0,15 M di NaCl, 10 mM MOPS, pH 7,4).
- Quattro OptiPrep soluzioni gradiente sono state fatte da mescolando 350, 250, 200, o 150 microlitri OptiPrep diluito con HBSS ad un volume finale di 1 ml (Tabella 1).
- I quattro soluzioni sono state lentamente e con attenzione disposti a strati in un tubo da 15 ml con il minimo diluire in basso e il più diluire in alto (Figura 1A).
3. Separare lipidi / mielina detriti dalle cellule
- 6 ml di cellule dissociate spinale in HBSS stato accuratamente a strati sopra di soluzioni del gradiente OptiPrep.
- Provetta contenente le cellule e le soluzioni gradiente è stato centrifugato (15 minuti, 1900 rpm o 726 RCF, 20 ° C) utilizzando una centrifuga Eppendorf 5810R con un rotore basculante (A-4-62), separando la soluzione cella in strati distinti con i lipidi / detriti mielina (in alto 7 ml di tubo), seguita da 3 strati di neuroni, con le cellule infiammatorie, glia, e globuli rossi nel pellet. Sebbene la maggior parte delle cellule infiammatorie, tra cui monociti, macrofagi, granulociti PMN e linfociti sono stati trovati nel pellet, alcuni di grandi dimensioni-macrofagi attivati è stato trovato in strati sopra il pellet.
- La lipidi / strato di mielina detriti (in alto 7 ml) è stato accuratamente aspirati e rimossi. Le cellule sono state poi lavate e risospese in 2,5 ml HBSS e utilizzati per immunomarcatura sotto.
4. Immunomarcatura di specifiche cellule del sistema immunitario per la citometria a flusso
- Cellule (500 microlitri) raccolti da preparativi del midollo spinale sono stati pellettato e risospesi in cloruro di ammonio 0,85% (diluito in acqua distillata) per 5 minuti per lisare i globuli rossi.
- Le cellule sono state lavate con 500 microlitri HBSS e poi bloccata per 30 minuti in coniglio normale o nel siero del mouse a temperatura ambiente.
- Le cellule sono state lavate e incubate a temperatura ambiente per 1 ora con anticorpi (anti-coniglio PMN FITC, chimica accurato e scientifico; topo anti-ratto ED1 Alexa 488, Serotec; o Mouse anti-ratto CD3 Alexa 488) o isotipo IgG soluzione diluita in HBSS (tutti in diluizione 1:100), come descritto in precedenza 1.
- Le cellule sono state lavate due volte dopo ogni passo sopra e poi risospeso in 300 microlitri HBSS dopo il passo finale.
5. Valutazione quantitativa delle cellule mediante citometria di flusso
- I campioni sono stati analizzati su un FACS Calibur (Becton-Dickinson) citofluorimetro utilizzando Quest software cellulare. 5.000 eventi per campione sono stati letti per tutti i campioni e analisi dei dati è stata completata con Summit (DakoCytomation).
- Porte citometria a flusso sono stati fissati con il controllo delle cellule isotipo IgG etichettati o cellule del midollo spinale di animali di controllo indenne per impostare i valori di base per la normalizzazione attraverso punti di tempo come descritto in precedenza 1. I valori medi di cellule positivamente etichettati sono stati espressi come percentuale (± SEM) dell'intero campione.
6. Rappresentante dei risultati:
La capacità di un gradiente OptiPrep per rimuovere i detriti della mielina e migliorare la rilevazione delle cellule immunitarie mediante citometria di flusso è stata valutata attraverso la quantificazione PMN spinale a 1 dpi (Figura 1B), il picco precedentemente segnalati di infiltrazioni PMN dopo SCI 1-3. In alternativa, identicamente sezionato il midollo spinale erano dissociate enzimaticamente senza OptiPrep-rimozione dei detriti mielina e sono stati valutati allo stesso modo in parallelo per infiltrazioni PMN mediante citometria di flusso. Come abbiamo riportato precedentemente 1, ci fu un cambiamento nella posizione degli eventi in campioni isolati con il metodo del gradiente di purificazione OptiPrep rispetto alla dissociazione enzimatica da solo, dimostrando la percentuale di PMN rilevati nei campioni con intatta debris mielina era solo uno frazione (0,5%) della percentuale di PMN rilevati (5,1%) in OptiPrep purifcampioni IED (Figura 1B). Questi dati suggeriscono che i detriti mielina nei preparati di tessuto può oscurare letture di citometria a flusso, e dimostrare che la rimozione dei detriti mielina aumenta la sensibilità di rilevazione delle cellule immunitarie nel tessuto danneggiato del midollo spinale.
Dopo aver stabilito la sensibilità del sistema gradiente OptiPrep per il rilevamento delle cellule nel midollo spinale danneggiato, abbiamo caratterizzato i cambiamenti in infiltrazione cellulare per un periodo che varia da 2 ore a 180 dpi e ha stabilito una risposta romanzo multifasico di infiammazione cellulare dopo SCI che comprendeva PMN, macrofagi / microglia e T-cellule. Come confermato da studi precedenti 1-3, PMN primo ingresso il cavo a 2 ore di post-infortunio e ha alzato a 1 dpi (Figura 2 e 4). Macrofagi / microglia invece 1,4,5, non sono stati rilevati nel midollo spinale lesionato fino a 3 dpi, e un picco inizialmente a 7 dpi (Figura 3 e 4). Sorprendentemente, si mostra per la prima volta che i macrofagi / microglia picco per la seconda volta 60 dpi ed è rimasta elevata di 180 dpi (Figura 3 e 4). Simile a macrofagi / microglia, cellule T infiltrazione è stato previsto il picco 05-07 luglio dpi, tuttavia, la citometria a flusso non rileva le modifiche nel numero delle cellule T nei primi 7 dpi, anche se un elevato numero di cellule T è stata rilevata a 9 dpi (1,6%) (Figura 4). Mentre il numero delle cellule T è stata diminuzione di 10 dpi, una persistente risposta delle cellule T è stata osservata di 180 dpi, momento in cui il 4,4% delle cellule sono stati etichettati per CD3 (Figura 4).
Insieme, questi dati dimostrano un dipendente dal tempo di risposta multifasico di infiammazione cellulare dopo SCI (Figura 4), le fasi iniziali di infiammazione cellulare erano comprende il picco precoce di PMN 1 dpi seguito da un picco di ED1 + macrofagi / microglia 7 dpi e T 9-celle dpi, mentre le fasi successive erano composte da tutte e tre le popolazioni cellulari in aumento dopo 14 dpi e persistente di 180 dpi, con un picco notevole seconda macrofagi / microglia a 60 dpi. Questo studio timecourse ed i dati quantitativi generati mediante citometria di flusso sono state convalidate in precedenza, che mostrano risultati comparabili ai dati raccolti da stereologia quantitativo di immunolabeled sezioni del midollo spinale 1.
Tabella 1. Preparazione del gradiente OptiPrep per la rimozione di detriti mielina. Quattro soluzioni gradiente OptiPrep sono realizzati con HBSS OptiPrep e diluito (1:1 diluizione OptiPrep e MOPS).
Figura 1. Gradiente di densità OptiPrep separati più mielina / detriti dalla ferita del midollo spinale tessuti / cellule e migliorare la valutazione delle cellule immunitarie mediante citometria di flusso. (A) La mielina / detriti è stato separato dalle cellule (neuroni, cellule gliali e cellule del sistema immunitario) dopo centrifugazione del dissociato tessuto del midollo spinale attraverso un gradiente OptiPrep seguita da aspirazione di mielina / strato di detriti. (B) numero di PMN nel midollo spinale danneggiato, mostrando una maggiore sensibilità nel rilevare PMN dopo la rimozione detriti (Student t-test, p = 0,0001). Tutte le porte citometria a flusso sono stati impostati utilizzando cellule marcate da animali illeso; n = 5 per gruppo, media ± SEM. 5.000 eventi per campione sono stati letti per tutti i campioni e il valore medio di cellule positivamente etichettati sono stati espressi come percentuale (± SEM) dell'intero campione.
Figura 2. Rilevamento di infiltrazioni PMN nel midollo spinale danneggiato mediante citometria di flusso. Dopo un moderato (200 kd) lesioni contusione al T9, PMN rapidamente entrato nel midollo spinale di partenza 2 ore (B) post-infortunio e con un picco 1 dpi (C). Tutte le porte citometria a flusso sono stati impostati utilizzando cellule marcate da animali indenni (A).
Figura 3. Rilevazione dei macrofagi / microglia infiltrazione nel midollo spinale danneggiato mediante citometria di flusso. Dopo un moderato (200 kd) lesioni contusione al T9, ED1 + macrofagi / microglia numero maggiore nel midollo spinale danneggiato a partire da 3 dpi (D), ha raggiunto il picco acutamente a 7 dpi (E), è sceso a livelli bassi a 14 dpi (F) , prima di risalire ad un secondo picco a 60 dpi (G), ed è rimasto nel midollo spinale lesionato fino a 180 dpi (H). IgG etichettatura controllo isotipo di 7 celle dpi spinale (B) hanno anticorpi minimo di etichettatura sfondo e nessuna differenza per le cellule anticorpo marcato da 2 ore post-infortunato (C) o indenne (A) gli animali. Tutte le porte citometria a flusso sono stati impostati utilizzando cellule marcate da animali illeso.
Tabella 2. Campioni di animali negli esperimenti timecourse. Per ogni punto temporale (0 hr a 180 dpi), cinque animali hanno ricevuto un moderato (200 kd) lesioni contusione al T9,e del midollo spinale sono stati valutati mediante citometria di flusso per il numero di PMN, ED1 + macrofagi / microglia, e CD3 + T-cellule. Tuttavia, non tutti i campioni animali sono stati recuperati con successo da PMN (4-5), ED1 (3-5), e CD3 (4-5) analizza citometria a flusso.
Figura 4. Un timecourse di infiammazione cellulare nel midollo spinale a seguito di un moderato (200 kd) lesioni contusione al T9. Valutata mediante citometria di flusso, il numero di PMN, ED1 + macrofagi / microglia, e CD3 + T-cellule ha raggiunto un picco acuto (1,7, e 9 dpi, rispettivamente) e persistito cronicamente nel midollo spinale danneggiato. N = 3 al 5 per gruppo, media ± SEM.
Discussion
L'uso di citometria a flusso per quantificare le cellule immunitarie nel sistema nervoso centrale è complicata da lipidi / mielina contenuti e detriti. Oltre ad interferire con il legame degli anticorpi e la specificità, detriti mielina possono avere dimensioni e proprietà simili granulazione per le cellule immunitarie, diminuendo la sensibilità e la precisione di misurazione 8. La cella nuovo metodo di preparazione qui descritto è efficace nella rimozione di detriti mielina e accresce quindi la sensibilità della citometria a flusso per rilevare i cambiamenti nel processo infiammatorio cellulare nel midollo spinale danneggiato. Per esempio, la rimozione dei detriti mielina da questo metodo di rilevamento maggiore di cellule immuni rispetto alla dissociazione enzimatica alone.Critically, l'utilizzo di questo nuovo metodo ha permesso la prima caratterizzazione dei acuta e cronica infiammazione cellulare dopo SCI per includere un corso completo di tempo per PMN, macrofagi / microglia e le cellule T fino a 180 dpi, e ha individuato una fase secondo romanzo di infiammazione cellulare. Questi risultati importanti di un componente multifasico di neuroinfiammazione può essere fondamentale per la progettazione e realizzazione di razionali strategie di trattamento terapeutico, tra cui interventi sia a base di cellule e farmacologici per la SCI.
Il sistema gradiente OptiPrep è stato utilizzato per separare i detriti dalle cellule nel sangue 9, o neuroni purificare dal cervello ai fini di coltura cellulare 10; tuttavia, abbiamo modificato e avanzato questo sistema di metodo per separare i detriti mielina a partire da cellule del midollo spinale dissociato, e ha permesso quantificazione rapida e più accurata di infiammazione cellulare mediante citometria di flusso. Questo metodo con citometria a flusso è tale da rendere avanzamento significativo nella ricerca infiammazione dopo lesioni del SNC o condizioni patologiche, come la maggior parte degli studi hanno solo caratterizzato l'infiammazione cellulare nel sistema nervoso centrale con tecniche morfologiche e istologiche che non sono cellule di tipo specifico o non può sempre fornire informazioni veritiere valutazione quantitativa. Inoltre, alcuni studi recenti hanno tentato di quantificare le cellule immunitarie nel midollo spinale danneggiato mediante citometria di flusso con ingredienti freschi tessuti dissociato cavo 11,12 o cellule separate dal gradiente Percoll sistema 13, tuttavia, questi studi hanno dimostrato sia i rendimenti delle cellule bassa o insensibile rilevamento di cellule immunitarie.
Al contrario, il metodo del gradiente OptiPrep cellula preparazione ha fornito per la prima volta, sensibile e affidabile valutazione quantitativa mediante citometria di flusso ai cambiamenti di infiammazione cellulare in risposta alla gravità delle ferite e graduati su una timecourse esteso fino a 180 dpi. La sensibilità e l'affidabilità di citometria a flusso dipende anche dalla specificità degli anticorpi utilizzati per rilevare specifici tipi di cellule immunitarie, come la citometria a flusso non consente di stabilire criteri morfologici per distinguere ulteriormente i tipi di cellule. La specificità degli anticorpi per i PMN, macrofagi / microglia o T-dice è stato testato a fondo in citometria a flusso per PMN peritoneali e macrofagi alveolari in coltura e le cellule del 1,2 tessuto del midollo spinale lesionato. Insieme al sistema di gradiente OptiPrep, questi anticorpi utilizzati per la citometria a flusso hanno contribuito alla generazione di un'analisi temporale e quantitativa delle infiammazioni cellulari che ha fornito nuovi aspetti delle dinamiche del microambiente SCI, e individuato per la prima volta una risposta estesa Multiphasic di infiammazione cellulare. Questa risposta multifasico delle cellule dopo SCI può essere importante per indagare il ruolo di specifici tipi cellulari presenti in momenti specifici dopo infortuni o generare interventi terapeutici contro specifici tipi cellulari che possono aggravare le lesioni. Inoltre, questi risultati possono contribuire allo sviluppo di una logica adeguata per gli interventi ottimale droga o cell-based per la SCI.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Ringraziamo Rebecca Nishi, MS, ed i tecnici del Fondo per la Christopher & Dana Reeve core Animal Foundation presso la UC Irvine per il loro aiuto in chirurgia animali. Ringraziamo anche Gabriella Funes, Usha Nekanti e Denisse Moreno per le preparazioni sparare assistenza tecnica, manoscritti, video e animazione. Questa ricerca è stata sostenuta da NINDS (RO1 NS43428-01 a AJA), il Progetto Paralisi d'America (PPA-32574 a HXN), e la California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) cellule staminali Premio Formazione T1-00008 per HXN. KDB è stato sostenuto dal programma di formazione molecolare e cellulare neuroscienze all'Università della California di Irvine (T32 NS007444).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OptiPrep | Fisher Scientific | NC9182490 | |
| HBSS | Sigma-Aldrich | H1387 | |
| Rabbit anti-rat PMN (FITC) | Accurate Chemical & Scientific Corporation | AIFAD51140 | |
| Mouse anti-rat ED1 (Alexa Fluor 488) | AbD Serotec | MCA341A488 | |
| Mouse anti-rat CD3 (FITC) | AbD Serotec | MCA772F | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| DME | Sigma-Aldrich | D1152 | |
| MOUSE IgG1 (Alexa Fluor 488) | AbD Serotec | MCA1209A488 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30070.03 | |
| Rabbit serum | Jackson ImmunoResearch | 011-000-120011-000-120 | |
| Mouse serum | Jackson ImmunoResearch | 015-000-120 | |
| Cell Strainer | BD Biosciences | 352340 |
References
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