在流式细胞仪受伤/病理中枢神经系统的细胞炎症的定量分析是复杂的脂质/髓鞘碎片,可以有类似的大小和肉芽细胞,减少敏感性/准确性。我们拥有先进的一个细胞的制备方法去除髓鞘碎片和改善由流式细胞仪检测在脊髓损伤细胞检测。
免疫细胞在受伤的中枢神经系统(CNS)的使用形态或组织学技术检测并不总是提供真正的细胞炎症的定量分析。流式细胞仪是一种快速的替代方法来量化免疫细胞在脑损伤或脊髓组织。从历史上看,流式细胞仪已用于量化收集到的免疫细胞从血液中分离脾脏或胸腺,只有少数的研究试图量化流流式细胞仪使用新鲜分离的脊髓组织的免疫细胞在脊髓损伤。然而,分离脊髓组织集中髓鞘碎片可以被误认为是细胞,减少细胞计数流式细胞仪获得的可靠性。我们拥有先进的一个细胞的制备方法,使用OptiPrep梯度系统有效地分离脂质/髓鞘碎片从细胞,流式细胞仪在受伤脊髓细胞炎症反应灵敏,可靠的量化。正如我们在最近的一项研究( 贝克&阮等,脑2010年2月,133(PT 2):。433-47),OptiPrep细胞制备增加了灵敏度,检测细胞在脊髓损伤炎症,与计数特定类型的细胞损伤的严重程度相关。更重要的是,这种方法的新颖使用提供的急性和慢性脊髓损伤后的细胞炎症的第一个表征,包括完成时间为多形核白细胞的过程(中性粒细胞,中性粒细胞),巨噬细胞/小胶质细胞,近一个时期的T细胞,从2小时伤后180天(DPI),确定一个令人惊讶的的小说细胞炎症的第二阶段。彻底表征细胞炎症,使用这种方法可能提供一个更好的neuroinflammation了解,在受伤的中枢神经系统和多相neuroinflammation揭示了一个重要的组成部分可能关键的设计和合理的治疗服务战略的实施,包括基于细胞和药理脊髓损伤的干预措施。
流式细胞仪的量化免疫细胞在中枢神经系统的使用是复杂的脂质/髓磷脂含量和碎片。除了 与抗体结合的特异性干扰,髓鞘碎片可以有类似的免疫细胞的大小和肉芽属性,减少测量的灵敏度和准确性8。这里描述的新的细胞制备方法是有效去除髓鞘碎片,从而提高了检测脊髓损伤的细胞炎症的变化,流式细胞仪的灵敏度。举例来说,通过这种方法增强免疫细胞的检测的髓鞘碎片去除酶解alone.Critically相比,使用这种方法的新颖允许急性和慢性蜂窝炎症的第一表征脊髓损伤后,包括一个完整的中性粒细胞日久,巨噬细胞/小胶质细胞,T细胞为180 dpi,并确定了一个新颖的第二阶段,细胞炎症。这些重要的发现的一个neuroinflammation多相组成部分,可能是关键的设计和实施合理的治疗的治疗策略,包括脊髓损伤的细胞为基础的药物干预。
OptiPrep梯度系统已经使用单独的碎片从9血液中的细胞,或从脑细胞培养的目的10净化神经元;不过,我们已修改和先进的这种方法系统,单独从脊髓分离的细胞髓鞘碎片,并允许快速,更准确的定量流式细胞仪检测细胞炎症。可能这种方法用流式细胞仪,以提供在炎症研究中的重大进步后中枢神经系统受伤或病理条件下,作为大多数的研究都只能特征的形态组织学技术,是不是单元式专用或能不能始终提供真正的中枢神经系统的细胞炎症量化考核。此外,最近的一些研究已经试图量化流流式细胞仪使用新鲜分离的脊髓组织11,12或13 Percoll梯度系统分离细胞的免疫细胞在脊髓损伤,然而,这些研究证明或低细胞产生,或不敏感免疫细胞的检测。
相比之下,首次提供OptiPrep梯度细胞的制备方法,灵敏,可靠,流式细胞仪定量评估损伤的严重程度分级,并在延长timecourse高达180 dpi的细胞炎症的变化。流式细胞仪分析的灵敏度和可靠性,还取决于用于检测特定的免疫细胞类型的特异性抗体,流式细胞仪不允许形态标准,以进一步区分的细胞类型。中性粒细胞,巨噬细胞/小胶质细胞或T -告诉的特异性抗体已经彻底流式细胞仪进行测试,文化和细胞腹腔中性粒细胞和肺泡巨噬细胞在脊髓损伤组织1,2。连同OptiPrep梯度系统,用于流式细胞仪检测这些抗体作出贡献的一代进入SCI的微环境的动态提供了新的见解,并首次确定一个扩展的多相反应的细胞炎症反应的时间和定量分析细胞炎症。这种细胞在脊髓损伤后的多相反应可能是重要的调查目前在伤后的特定时间,特定的细胞类型的角色,或对特定的细胞类型,可加重受伤产生的治疗性干预。此外,这些研究结果可能有助于在一个适当的理由发展,为脊髓损伤的最佳药物或细胞为基础的的干预。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢丽贝卡西,MS和克里达纳里夫基金会动物加州大学欧文分校的核心基金为帮助他们在动物手术的技术人员。我们也感谢技术援助,手稿和视频拍摄的准备工作和动画加布里埃拉富内斯,乌莎Nekanti Denisse莫雷诺。这项研究得到了NINDS(RO1的NS43428 – 01到AJA),美国瘫痪项目(PPA – 32574 HXN),加州再生医学研究所(CIRM)干细胞培训奖T1 – 00008至HXN。韩国产业银行是由加州大学欧文分校(T32 NS007444)在分子和细胞神经科学培训计划的支持。
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
OptiPrep | Fisher Scientific | NC9182490 |
HBSS | Sigma | H1387 |
Rabbit anti-rat PMN (FITC) | Accurate Chemical & Scientific | AIFAD51140 |
Mouse anti-rat ED1 (Alexa Fluor 488) | AbD Serotec | MCA341A488 |
Mouse anti-rat CD3 (FITC) | AbD Serotec | MCA772F |
Trypsin | Sigma | T9935 |
Collagenase | Sigma | C5138 |
DME | Sigma | D1152 |
MOUSE IgG1 (Alexa Fluor 488) | AbD Serotec | MCA1209A488 |
Fetal bovine serum | Hyclone | SH30070.03 |
Rabbit serum | Jackson ImmunoResearch | 011-000-120011-000-120 |
Mouse serum | Jackson ImmunoResearch | 015-000-120 |
Cell Strainer | BD Falcon | 352340 |