Summary
Um experimento de pressurização romance impulsivo celular foi desenvolvido utilizando um dispositivo de bar Kolsky para investigar os mecanismos moleculares / celulares da explosão induzida lesão cerebral traumática.
Abstract
Um experimento de pressurização romance impulsivo celular foi desenvolvido utilizando um dispositivo de bar Kolsky para investigar explosão induzida por traumatismo crânio-encefálico (TCE). Demonstramos neste artigo de vídeo como a pressurização explosão TBI-impulsivo relevante é aplicada às células neuronais in vitro. Isto é conseguido através da utilização bem controlada pulso de pressão criado por um dispositivo especializado Kolsky bar, com história completa da pressão no interior da câmara de pressurização da célula registada. Pressurizados células neuronais são inspeccionadas imediatamente após a pressurização, ou ainda incubadas para examinar os efeitos a longo prazo de pressurização impulsivo sobre neurite / axonal outgrowth, a expressão do gene neuronal, apoptose, etc observou-se que a pressurização impulsivo a cerca de 2 MPa relativos induz perda distinta neurite de células não pressurizados. A nossa técnica proporciona um método novo para investigar os mecanismos moleculares / celulares de explosão TBI, através de pressurização impulsivo de células cerebrais em bem controlada prEssure magnitude e duração.
Protocol
1. Cultura Celular Neuronal
- As células do cérebro, incluindo células neuronais, astrócitos e a sua co-cultura pode ser utilizado como um modelo de célula. Como uma demonstração de viabilidade, pressurização impulsivo de células da linha de células neuronais é apresentado.
- SH-Sy5y células de neuroblastoma humano (ATCC, CRL-2266) são cultivadas em lamelas de vidro 18 mm de diâmetro. As células são semeadas a uma densidade de 3 x 10 3 células / cm 2, usando os meios de crescimento composto por DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina. Lâminas de vidro de células em cultura são mantidas em 5% de CO 2 incubador humidificado a 37 ° C.
- Para obter a diferenciação de células neuronais de células SH-Sy5y, as células são tratadas com meio suplementado com mais de 10 uM de ácido retinóico (AR) durante 7 dias com meio mudado a cada dois dias. No dia 7, as células estão prontas para ser pressurizado.
2. Equipamento de pressurização: Kolsky Bar
- A barra de Kolsky, dedesenvolvido pela Kolsky 1 em 1949, tem sido utilizado para medir a propriedade mecânica de um material, a uma taxa de carregamento muito elevada. O aparelho é constituído por duas barras com uma amostra colocada em contacto entre as barras. Uma onda de tensão, criada na barra incidente, se propaga para a amostra, onde a onda se divide em uma onda reflectida e transmitida. A tensão da amostra é proporcional à onda transmitida. No presente estudo, nós utilizamos uma câmara de pressurização da célula a ser colocado entre as duas barras da Kolsky set-up.
- As duas barras de liga de alumínio (cada comprimento de 6 m) estão suspensos por chumaceiras de bronze alinhados, e uma câmara de pressurização in vitro de células é colocado entre as barras. O bar é o bar a montante incidente com uma massa 130 lb presa em uma extremidade. Um grampo de fricção é colocado numa posição em que vai dar a duração do impulso desejada. Ao envolver-se a braçadeira de aperto e um macaco tesoura entre a massa e um suporte de carga, a secção de aperto de massa da barra de incidente é pré-compressed para o nível desejado. Forçar um parafuso entalhado que trava o grampo para uma ruptura brusca com um sistema hidráulico libera a compressão pré-armazenados rapidamente e, assim, gera um impulso de pressão. Esta propaga-se através da barra incidente, acciona o êmbolo da câmara de teste, e pressuriza o fluido e as células dentro da câmara de impulso. A pressurização da câmara, por sua vez inicia uma pressão de pulso de propagação a jusante da barra de transmissão. As estirpes associadas com os impulsos de pressão das barras são medidos com medidores de compostos de alta resistência de tensão excitado a 45 volts. Os sinais de calibre são gravados com um osciloscópio digital na freqüência de 1 MHz, como uma história de carregamento.
- In vitro a câmara de pressurização da célula é constituída por um êmbolo do cilindro. O cilindro tem 2,6 cm de diâmetro interno e 3,8 cm de diâmetro exterior, e tem um pequeno orifício aproveitado na base da cavidade. O orifício serve de ar de ventilação e o excesso de líquido da amostra durante a instalação da célula. O pistão é de 7,5 cm de comprimentoe é feita a partir do material de barra mesmo. O pistão é envolvido com duas a três camadas de fita de encanador (Teflon), que servem como selo de baixo atrito. A tampa de extremidade é de 32 mm de comprimento e tem dois pequenos parafusos de aço inoxidável que fixam as lamelas de vidro (no qual as células são cultivadas), durante o carregamento.
3. Pressurização impulsivo de células neuronais
- Todas as peças da câmara de pressurização são esterilizados utilizando a autoclave e são mantidos sob luz UV. A montagem da câmara é realizada no interior da capa de cultura de células. O parafuso de purga na câmara é fracamente envolvida na entrada de ar na base da cavidade. Pré-aquecido (37 ° C) de meio de crescimento fresco é pipetada para dentro da câmara, sem fazer bolhas. Em seguida, uma lâmina de vidro de células de cultura é recolhida, e é colocado sobre a tampa do êmbolo (células voltados para fora). Os pequenos parafusos que prendem são apertados para o slide para segurá-la no lugar. O êmbolo com uma lâmina de vidro de células cultivadas é inserido um pequeno into da cavidade da câmara, e o conjunto é inclinado com a abertura estar no ponto mais alto. O parafuso de purga é removida e o pistão é empurrado para dentro da primeira cavidade obrigando as bolhas de ar, em seguida, o excesso de líquido. Ou uma marca de referência ou um gabarito é utilizado como um guia para assegurar o mesmo volume de meio de cultura para cada teste. A dimensão axial da mídia na câmara é de cerca de 6 mm. Higienizar o parafuso de purga e substituí-lo para fazer a água da câmara apertado. A câmara não deve vazar sob esta carga estática, se isso acontecer, o envoltório Teflon precisa ser substituídos ou reforçados.
- Neste ponto, o sistema de barra Kolsky é reposto. A massa pesada é transferida de volta para a posição original e um parafuso de travamento novo substitui o utilizado (quebrado) um. O trinco de bloqueio novo com o sistema hidráulico para cerca de 200 psi. Usar a tomada de uma tesoura para comprimir a secção de pré-carregamento da barra incidente, até um pouco de pressão mais elevado do que o valor desejado, e depois voltar-off para envolver o atrito total doparafuso de Jack. A aquisição de dados agora está armado.
- A câmara de pressurização da célula montada é montado no sistema. Ela é colocada num bloco V suportada pela pequena tesoura jack laboratório e em linha com as duas barras. Unte cada interface com uma camada de graxa leve e esfregar as superfícies cabeçadas em conjunto para eliminar as lacunas de ar entre eles.
- O teste está agora pronto para prosseguir. O parafuso de fixação braçadeira é forçado a quebrar rapidamente por bombear o motorista pinça hidráulica. A braçadeira vai separar e a aquisição de dados deve exibir os resultados. A história de pressurização da célula é determinada a partir das medições do calibre bar transmitida. Se a barra de transmissão utilizada é suficientemente longo, este deve ser apenas a partir da primeira perturbação para o ponto em que as medições mostram uma pressão negativa. A duração do pulso transmitido pode ser mais curto do que o impulso de acidente, se a bolha está preso. A magnitude pode não atingir a do pulso incidente, mas deve ter uma lon suficientementeg planalto antes da descarga. Caso contrário, quer uma bolha de ar grande na câmara selada ou um desalinhamento entre o conjunto e uma barra pode ter ocorrido.
- A câmara de pressurização da célula é então removido e desmontado no interior da capa de cultura de células. O parafuso de purga é removido e o êmbolo é puxado livre da câmara. A lâmina de vidro de células de cultura é tomada a partir da extremidade do êmbolo.
4. Avaliando o comportamento das células pressurizada
- Após a pressurização, as células podem ser inspeccionadas imediatamente ou ainda incubada para posterior exame. Com processos adequados de operação de assepsia, de longo prazo pós-incubação é possível.
- Células sob pressão pode ser examinado por todas as técnicas de biologia molecular e celular. Especificamente para a pressurização da célula neuronal, para investigar a fisiologia celular e molecular, em condições de TBI, os ensaios de avaliação de pressão induzidas por alterações no crescimento de neurites, a mudança de microtúbulos do citoesqueleto neuronal, Expre genession apoptose, etc, pode ser realizada. Como amostras de controlo de células, as células que são cultivadas na mesma, mantida no interior da câmara de pressurização para o mesmo período de tempo, mas não pressurizado são utilizados (assim chamada, câmara de controlo).
- Para avaliar as alterações no crescimento de neurites, as células de controlo submetidas a pressão e da câmara são examinadas por microscópio óptico imediatamente após a pressurização e 1 e 24 h de pós-incubação. Um exemplo de imagens de células neuronais são mostrados na seção "Resultados representativos" (Figura 2). A mudança de comprimento de neurites pode ser quantificado por coloração imunofluorescente actina e análise de imagem. As células são fixadas com uma solução de paraformaldeído a 4% w / v, lavou-se com um 0,05% v / v de Tween-20 tampão de lavagem, e permeabilizadas com um v / v 0,1% de Triton X-100 a solução. Após o bloqueio com um w / v de bovino a 1% solução de albumina de soro, as células são incubadas com o isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC)-faloidina conjugada. Imagens de imunofluorescência das células são colhidas utilizando um fluorescentemicroscópio e os comprimentos das neurites de células pressurizados e de controlo são quantificados utilizando o software ImageJ (NIH).
- As neurites pode ser identificado como axônios ou dendritos. Para avaliar as alterações morfológicas nos axônios ou dendritos, os experimentos acima descritos podem ser repetidos, utilizando anticorpos de detecção de cada estrutura, ou seja, um anticorpo de neurofilamento (NF) para axónios e do microtúbulo associado à proteína de anticorpo (MAP2) para dendrites.
- Os microtúbulos são um dos principais componentes do citoesqueleto de neurónios, e os danos aos microtúbulos tem sido utilizada como marcador de lesão neuronal. Microtúbulos 2 pode ser visualizada usando o anticorpo imunofluorescência β-tubulina. As células são fixadas após 0 e 24 h de pós-pressurização, coradas com anticorpo β-tubulina, e observadas ao microscópio de fluorescência.
- Para avaliar o efeito da pressurização impulsiva na expressão do gene neuronal apoptótica e, de ARN total é extraído a partir de células submetidas a pressão e de controlo. Genexpressão e pode ser examinado através da realização de RT-PCR quantitativo em tempo real ou RT-PCR, semelhante aos nossos protocolos publicados. 3
5. Resultados representativos:
Figura 1. Um exemplo de perfil de pressão aplicada às células no interior da câmara de pressurização. O aparelho bar Kolsky sucesso gera nível 2 MPa, um único pulso de pressurização tipo impulsivo, com uma duração de cerca de 0,7 ms.
Figura 2. Um exemplo de resposta de células neuronais de pressurização impulsivo. SH-Sy5y células expostas a pressurização impulsivo a 2 MPa mostra colapso neurite / axon distinta em relação às células de controlo da câmara.
6. Dificuldades e Soluções
- Câmara de vedação é um dos principais obstáculos a serem superados. É found que os discos de largura, com o-rings tem um problema de cinzelamento e atrito maior. A fim de eliminar os efeitos de fricção, bem como evitar cinzelamento, um simples método de gravação do pistão com a fita de Teflon canalizador é usado. Isto resolve os problemas e produz o nível de pressão desejado e duração.
- Comportamento da célula neuronal pressurizado, especialmente quando se avalia mecanismo TCE secundário ou efeitos a longo prazo, deve ser examinada depois de um tempo pós-incubação longo. A câmara contendo as células é exposto a condições potencialmente não esterilizadas enquanto se move para a barra Kolsky, pressurizando, e movendo-se para trás para o capuz de cultura de células. Com a esterilização prévia das partes da câmara e do funcionamento apropriado de montagem / desmontagem da corrediça de células cultivadas e câmara no interior da capa de cultura de células, de longo prazo pós-incubação é possível até várias semanas.
- A reprodutibilidade dos dados é um parâmetro importante em celulares experiências de estimulação mecânica. Para o nosso dispositivo, o reproducibility em resposta celular neuronal é determinada como desejado perfil de pressurização impulsivo, nos dois níveis de pressão e duração, é repetidamente obtidos. Uma vez que o perfil de pressão gravar obtido para cada pressurização, os dados de resposta de células a partir de perfil de pressão não desejada pode ser manualmente excluída depois.
- As etapas de pressurização inteiras, incluindo a montagem da câmara de transferência e montar na barra Kolsky, a pressurização, a transferência de recurso, e a desmontagem da câmara, ter menos de 10 min. A corrediça próxima célula de cultura pode ser pressurizado imediatamente após a pressurização anterior. Assim, um número suficiente de experiências de pressurização pode ser completado de forma eficiente. O nosso set-up utiliza 18 milímetros lamínulas de diâmetro. Um experimento pressurização não fornece proteínas suficientes para inmunotransferência devido ao tamanho do substrato (e também em parte por causa de algumas das células submetidas a pressão são mortos). Cerca de três experimentos de pressurização repetidas fornecer quantidade de proteína necessária para immunoblOtting. Mais uma vez, a reprodutibilidade é verificada cada vez com o perfil de pressão.
Discussion
Muitas das técnicas experimentais in vitro têm sido tentadas para estudar os danos das células cerebrais em condições de TCE. Estes incluem neurônio / astrócitos alongamento, tensão de escoamento induzido cisalhamento, queda de peso, laceração caneta, laser transecção, litotripsia, etc 4,5 Assumiu-se que de curta duração sobre pressão é um fator dominante física para TCE. 6,7 Especialmente , a onda de choque da explosão TCE tem uma duração de pulso de uma ordem de milissegundos. 4 Com base neste pressuposto e observação, câmara barômetro capaz de pressurização transiente foi desenvolvido e utilizado para avaliar o comportamento de células do cérebro em condições de TCE. Por exemplo, no fluido de percussão barotrauma câmara de um impulso de pressão com 20-30 ms de duração longa e um pico de pressão de até 0,5 MPa foi usada para examinar o comportamento de células glial humana sob o TCE. 6 Recentemente, VandeVord et al. 7 metal usado bola câmara barômetro marcante para examinar a célula astrócitoscomportamento sob TCE, mas a bola de metal dramáticas produzidas pulsos de pressão múltiplos. No presente estudo, nós desenvolvemos um dispositivo de pressurização novel célula que gera um único pulso de pressurização tipo impulsivo. O dispositivo foi desenvolvido com base na barra de Kolsky configuração, que tem sido utilizado como um aparelho de ensaio de materiais em nossos 8 e de outros estudos. 1,9 O bar Kolsky da capacidade de teste de material em taxa de carga muito elevada foi modificado para ser capaz de aplicar um único pulso de sobrepressão tipo para as células de cultura no interior da câmara de pressurização (Figura 1). Poderíamos conseguir controlar a magnitude e duração da sobrepressão impulsivo. Como uma resposta das células representativo, foi demonstrado que a 2 MPa de pressão SH-Sy5y células neuronais exibir neurite significativo e perda axonal, em comparação com células de controlo não pressurizados de câmara.
Em conclusão, foi desenvolvido um novo aparelho de pressurização impulsivo célula usando um Kolsky especialmente concebidodispositivo bar e demonstrou seu potencial para utilização em investigar a resposta celular neuronal em condições de TCE. Observamos também que esta técnica é muito versátil na medida em que qualquer tipo de células podem ser expostas a pressões impulsivas em níveis diferentes e duração. Portanto, o dispositivo pode ser usado para investigar o impulsivo pressão induzida comportamento mecanotransdução celular, não só para ferir as células, mas também para estimular as células positivamente na sua função e determinação destino.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer as fontes de financiamento: Exército-UNL Centro de Mecânica Trauma (DoD / ARO, # W911NF-11-1-0033, PI: Dr. Chandra Namas), Prêmio Layman UNL (26-1110-0033 -001 , PI: Lim).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SH-SY5Y (ATCC, CRL-2266) human neuroblastoma cells | |||
| 18 mm diameter glass coverslips | |||
| Cell culture media: DMEM, 10% fetal bovine serum, 1% penicillin-streptomycin | |||
| Retinoic acid (10 μM) for inducing neurogenesis | |||
| Kolsky bar impulsive pressurization device | |||
| Piston-cylinder cell pressurization chamber | |||
| Stainless steel screws for securing cell cultured coverslip on the piston | |||
| Grease for interfaces between cell chamber and Kolsky bar | |||
| General molecular biology supplies for assessing cell response to pressurization (fixative, antibody, fluorescent dye, PCR supplies, etc.) |
References
- Kolsky, H. An investigation of mechanical properties of materials at very high rates of loading. Prec. Phys. Soc. London. 62, 676-700 (1949).
- Tang-Schomer, M. D., Patel, A. R., Baas, P. W., Smith, D. H. Mechanical breaking of microtubules in axons during dynamic stretch injury underlies delayed elasticity, microtubule disassembly, and axon degeneration. FASEB. J. 24, 1401-1410 (2010).
- Lim, J. Y., Taylor, A. F., Li, Z., Vogler, E. A., Donahue, H. J. Integrin expression and osteopontin regulation in human fetal osteoblastic cells mediated by substratum surface characteristics. Tissue. Eng. 11, 19-29 (2005).
- Chen, Y. C., Smith, D. H., Meaney, F. D. In vitro approaches for studying blast-induced traumatic brain injury. J. Neurotrauma. 26, 861-876 (2009).
- Ling, G., Bandak, F., Armonda, R., Grant, G., Ecklund, J. Explosive blast neurotrauma. J. Neurotrauma. 26, 815-825 (2009).
- Shepard, S. R., Ghajar, J. B. G., Giannuzzi, R., Kupferman, S., Hariri, R. J. Fluid percussion barotrauma chamber: a new in vitro model for traumatic brain injury. J. Surg. Res. 51, 417-424 (1991).
- VandeVord, P. J., Leung, L. Y., Hardy, W., Mason, M., Yang, K. H., King, I. A. Up-regulation of reactivity and survival genes in astrocytes after exposure to short duration overpressure. Neurosci. Lett. 434, 247-252 (2008).
- Huang, H., Feng, R. A study of the dynamic tribological response of closed fracture surface pairs by Kolsky-bar compression-shear experiment. Int. J. Solids. Struct. 41, 2821-2835 (2004).
- Song, B., Chen, W. Split Hopkinson pressure bar techniques for characterizing soft materials. Lat. Am. J. Solids. Struct. 2, 113-152 (2005).
