Summary
Роман импульсивный эксперимент давления клетки была разработана с использованием устройства Кольский бар, чтобы исследовать молекулярные / клеточных механизмов доменных индуцированной черепно-мозговой травмой.
Abstract
Роман импульсивный эксперимент давления клетки была разработана с использованием устройства Кольский бар для расследования взрыва вызванных черепно-мозговой травмы (ЧМТ). Мы демонстрируем в этом видео статье, как взрыв TBI-соответствующими импульсивный давления применяется для нервных клеток в пробирке. Это достигается с помощью хорошо контролируемых импульсов давления создается специализированное устройство бар Кольский, с полной историей давление в камере давления ячейки записаны. Под давлением нервных клеток проверяются сразу после наддува, или дополнительно инкубировали изучить долгосрочные последствия импульсивного давления на нейритов / аксональной вырост, нейронные экспрессии генов, апоптоз, и т.д. Мы заметили, что импульсивные давлением около 2 МПа вызывает различные относительные потери аксонов в негерметичной клеток. Наша методика предлагает новый метод для исследования молекулярно / клеточные механизмы взрыва TBI, с помощью импульсивного давления в клетках головного мозга в хорошо контролируемых пр.Essure величины и длительности.
Protocol
1. Нейронных клеточных культур
- Клетки головного мозга, включая нервные клетки, астроциты и их совместного культивирования могут быть использованы в качестве клеточной модели. В качестве демонстрации возможностей, импульсивный давления в линии клеток нервных клеток представлены.
- SH-SY5Y человеческих клеток нейробластомы (ATCC, CRL-2266) культивируют на 18 мм покровные стекла диаметром. Клетки высевали при плотности 3 × 10 3 клеток / см 2 с использованием питательных сред состоит из DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 1% пенициллин-стрептомицин. Сотовые культурного предметные стекла хранятся в 5% CO 2 увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° C.
- Для получения нейрональной дифференцировки клетки SH-SY5Y клетки, клетки обрабатывают СМИ дополнена с 10 мкМ ретиноевой кислоты (RA) в течение 7 дней со средствами массовой информации меняется каждые два дня. На 7-й день, клетки готовы находиться под давлением.
2. Наддува оборудование: Кольский Bar
- В баре Кольский, де-разработаны по Кольскому 1 в 1949 году, был использован для измерения механических свойств материала при очень высокой скорости нагружения. Аппарат состоит из двух баров с образцом помещают в контакт между барами. Волны напряжения, созданного на случай бар, распространяется на образцы, где волна расщепляется на отраженном и проходящем волны. Напряжений в образце пропорциональна прошедшей волны. В данном исследовании мы используем камеру ячейки давления должны быть размещены между двумя барами Кольский настройки.
- Два алюминиевых сплавов (каждый 6-м) были приостановлены соответствие подшипников из латуни, и в пробирке камеры давления ячейки зажата между прутьями. Верхний бар инцидента бар с 130 фунтов масса закреплена на одном конце. Фрикционный зажим находится в положении, которое даст желаемого длительности импульса. Участвуя зажим и ужесточение ножницы гнездо между массой и загрузки поддержку, зажим массы разделе инцидента бар предварительно сompressed до желаемого уровня. Принуждение зубчатый болт, который фиксирует зажим для внезапного разрыва с гидравлической системой освобождает предварительно сохраненные сжатие быстро и, следовательно, создает импульс давления. Это распространяется через инцидент бар, приводит в движение поршня испытательной камеры, и создает давление жидкости и клеток в камере импульсивно. Камера давления в свою очередь, инициирует импульса давления, распространяющегося в передаются вниз по течению бар. Штаммы, связанные с импульсами давления в барах измеряются с соединением высокого сопротивления тензодатчиков рады до 45 вольт. Датчик сигналов, записанных с цифровой осциллограф на 1 МГц в истории нагружения.
- В пробирке камеры давления ячейки состоят из поршень-цилиндр. Цилиндр имеет 2,6 см внутренний диаметр 3,8 см и внешним диаметром, и имеет небольшое отверстие с резьбой в основании полости. Отверстие служит воздуха и избыточной жидкости вентиляционной установки в ячейку образца. Поршень длиной 7,5 сми сделан из того же материала, бар. Поршня, завернутый в два-три слоя (тефлона) Лента водопроводчика, которые служат низкий уплотнения трения. Крышки составляет 32 мм в длину и имеет два небольших винтов из нержавеющей стали, которые крепят стекло покровные (на которой клетки культивируют) во время загрузки.
3. Импульсные наддува нервных клеток
- Все части наддува камеры стерилизовать с использованием автоклава и находятся под ультрафиолетовым светом. Сборка камеры выполняется внутри капота клеточной культуры. Винт для удаления воздуха в камере свободно участвуют в вентиляционное отверстие в основании полости. Подогретого (37 ° C) свежей среде роста пипеткой в камере без пузырьков. Затем клетки культивировали стекло подобран и установлен на крышке поршня (клетки сталкиваются на улице). Небольшие крепежные винты затянуты вниз на слайде, чтобы удерживать его на месте. Поршень с клеткой-культурный стекло вставляется маленькая яNto полости камеры, и собрание наклонена с вентиляционными находясь на высшей точке. Вентиляционный винт удаляют, а поршень выталкивается в полость первой вытеснить пузырьки воздуха, то избыток жидкости. Либо опознавательный знак или кондуктор используется в качестве руководства для обеспечения той же культуре средств массовой информации громкости для каждого теста. Осевой размер средств массовой информации в камере около 6 мм. Sanitize вентиляционный винт и заменить его, чтобы камера водонепроницаемая. Камеры не должны течь по этой статической нагрузки, если это произойдет, тефлоновая упаковка должны быть заменены или усилены.
- На данный момент, система Кольский бар сбрасывается. Тяжелая масса перемещается обратно в исходную позицию и новый болт блокировки заменяет используется (не работает) один. Включите новый болт замок с гидравликой до 200 фунтов на кв. Используйте ножницы, гнездо для сжатия предварительной загрузки раздел инцидента бар до давления немного выше, чем требуемое значение, а затем снова его покинуть заниматься полным тренияВинт домкрата. Данные приобретения теперь вооружены.
- Собранные камеры ячейки давления установлен в систему. Он находится в блоке V поддерживается небольшой лаборатории ножницы, домкрат и приведены в соответствие с двух баров. Смазка каждый интерфейс с легким слоем смазки и протереть поверхность бодаться друг с другом, чтобы устранить любые воздушные промежутки между ними.
- Тест готов приступить. Болт хомута блокировки вынуждены нарушать, быстро насосная гидравлическая водитель зажима. Зажим отделится и сбора данных должна отображать результаты. История ячейки давления определяется из измерений передаются барах. Если передается бар использоваться достаточно долго, то это должно быть только от первого нарушения до точки, где измерения показывают отрицательное давление. Длительность излучаемого импульса может быть меньше падающего импульса, если пузырь в ловушке. Величина не может достичь этого падающего импульса, но она должна иметь достаточно LONг плато перед разгрузкой. В противном случае, как большой пузырь воздуха в герметичной камере или перекос между Ассамблеей и бар могло иметь место.
- Камера клетки наддува затем удаляется и разбираются внутри капюшона клеточной культуры. Вентиляционный винт удаляют, а поршень вытащил свободной от камеры. Клеточных культурного стекло берется с конца поршня.
4. Оценка давлением поведение клеток
- После давления, клетки могут быть проверены сразу или дополнительно инкубировали для последующей экспертизы. При правильном асептических процессах эксплуатации, долгосрочное после инкубации можно.
- Под давлением клетки могут быть рассмотрены все молекулярной и клеточной биологии методами. Специально для нейронов давления клетки, исследовать клеточной и молекулярной физиологии в условиях ЧМТ, анализы оценке давления-индуцированные изменения в нейритов, микротрубочки цитоскелета изменения нейронов Expre генssion, апоптоз и т.д., могут быть выполнены. В качестве контрольных образцов клеток, клеток, которые культивировали же, находится внутри камеры давления за тот же период времени, но не под давлением используются (так называемый, камеры контроля).
- Для оценки изменений в нейритов под давлением и камерной контрольные клетки рассматриваются оптическом микроскопе сразу же после наддува и 1 и 24 ч после инкубации. Например нейронов изображений клеток показано в разделе "Результаты представитель '(рис. 2). Нейритов изменение длины может быть количественно актина иммунофлуоресцентного окрашивания и анализа изображений. Клетки фиксировали 4% в / о раствор формальдегида, промывают 0,05% V / V твин-20 промывочный буфер, и пермеабилизованной с 0,1% об / об Triton X-100 решение. После блокирования с 1% в / о бычьего сывороточного альбумина решение, клетки инкубируют с тетраметилродамин изотиоцианат (TRITC)-сопряженными фаллоидином. Иммунофлуоресцентного изображения клетки берутся с помощью флуоресцентногомикроскопа и длины нейриты для давления и контроля клетки количественно с помощью программного обеспечения ImageJ (NIH).
- Нейриты может быть идентифицирован как аксоны и дендриты. Для оценки морфологических изменений в аксонов или дендритов, эксперименты, описанные выше, могут быть повторены с использованием антител обнаружения каждой структуры, т. е. нейрофиламентов (NF) антитела для аксонов и микротрубочек связанных белка (MAP2) антитела для дендритов.
- Микротрубочки являются одним из ключевых компонентов цитоскелета нейронов и повреждения микротрубочек был использован в качестве маркера нейронов травм. 2 микротрубочек могут быть визуализированы immunofluorescently использованием β-тубулина антителами. Клетки фиксировали через 0 и 24 ч после наддува, окрашивали β-тубулина антитела, и наблюдается флуоресцентного микроскопа.
- Для оценки влияния импульсного давления на нейронов и экспрессии генов апоптоза, общая РНК экстрагируют из под давлением и контролем клетки. Genэлектронной выражение может быть рассмотрено выполнение количественной ОТ-ПЦР в реальном масштабе времени RT-PCR, похожей на нашу опубликованы протоколы 3.
5. Представитель Результаты:
Рисунок 1. Пример профиля давления применяются к клеткам в камере давления. Устройство Кольский бар успешно генерирует 2 МПа уровня, одно-импульсного типа импульсивного давления с длительностью около 0,7 мс.
Рисунок 2. Пример нейронной клеточный ответ к импульсивным давления. SH-SY5Y клетки подвергаются импульсивный давлением 2 МПа показать различные нейритов / аксона разбивка по отношению к клеткам управления камерой.
6. Трудности и пути их решения
- Палата уплотнение является одним из основных препятствий, которые необходимо преодолеть. Это FOунд, что широкие диски с уплотнительными кольцами есть проблема строжки и повышенного трения. Для того чтобы устранить трения эффектов, а также не допустить взвинчивания, простой метод поршня лентой с тефлоновой ленты водопроводчика используется. Это решает проблемы и дает желаемого уровня давления и продолжительности.
- Под давлением нейронов поведение клеток, особенно при оценке вторичных TBI механизма или более долгосрочные последствия, должны быть рассмотрены после долгого пост-время инкубации. Ячейки содержащие камере подвергается воздействию потенциально нестерильных условиях при движении в баре Кольский, давления, и движется по направлению к капот культуре клеток. С предварительной стерилизации в камере частей и правильной работе в сборке / разборке клетки культивировали слайдов и камеры внутри капота культуры клеток, долгосрочных после инкубации можно до нескольких недель.
- Воспроизводимость данных является важным параметром в сотовых механических опытов стимуляции. Для нашего устройства, reproducibilitУ нейронов в ответ ячейки определяется как желаемый импульсивный профиль давления, как давление и продолжительность, неоднократно получено. Так как мы записываем полученный профиль давления для каждого давления, клеточного ответа данных от нежелательных профиль давления можно вручную исключить впоследствии.
- Весь шаги наддува, в том числе камеры сборки, передачи и смонтировать в Кольский бар, давления, трансфер-назад, и камера разборки, происходит менее чем за 10 мин. Следующую ячейку культурной слайд может находиться под давлением сразу после предыдущей давления. Таким образом, достаточное количество экспериментов наддува может быть завершена эффективно. Наша установка использует 18 мм покровные диаметр стекла. Один давления эксперимент не обеспечивает достаточно белка для западных иммуноблоттинга в связи с подложки размером (а также отчасти потому, что некоторые из под давлением клетки мертвых). Около трех повторных экспериментов давления обеспечивают белки сумма, необходимая для immunoblotting. Опять же, воспроизводимость проверяется каждый раз при нажатии профиль.
Discussion
Многие в лабораторных методов экспериментальной были попытки для изучения клеток мозга, повреждения в TBI условиях. К их числу относятся нейронные / астроцитов растяжения, вызванные потоком напряжения сдвига, вес капли, стилус рваная рана, лазерным перерезки, литотрипсия, и т.д. 4,5 Предполагалось, что кратковременное давление является доминирующим физическим фактором для TBI. 6,7 особенности , ударная волна от взрыва TBI имеет длительность импульсов порядка миллисекунд. 4 На основе этого предположения и наблюдения, барометр камера способна переходного давления была разработана и использована для оценки поведения клеток головного мозга при ЧМТ условиях. Так, например, в жидкости ударных баротравмы камеры импульса давления с 20-30 мс, длительность и максимальное давление до 0,5 МПа используется для изучения поведения человека глиальных клеток при ЧМТ. 6 Недавно, VandeVord и др. 7. Использовали металл мяч поразительное камеры барометром для изучения клетки астроцитыповедение при ЧМТ, но металлический шар поразительным производится несколькими импульсами давления. В этом исследовании мы разработали новое устройство наддува элемента, который генерирует одиночных импульсов типа импульсивного давления. Устройство было разработано на основе баре Кольский установки, которая была использована в качестве аппарата для испытания материалов в нашей 8 и другого исследования. 1,9 Материал Кольский баре возможность тестирования при очень высокой скорости нагружения была изменена, чтобы быть в состоянии применять одиночных импульсов типа избыточное давление в культуре клеток в камере давления (рис. 1). Мы могли бы успешно контролировать масштабы и продолжительность импульсного давления. Как представитель клеточный ответ, мы показали, что при давлении 2 МПа SH-SY5Y нервных клеток отображать значительные аксонов и аксональной потери по сравнению с негерметичной клеток управления камерой.
В заключение, мы разработали новый импульсивных аппарата наддува клеток с использованием специально разработанных КольскийБар устройства и продемонстрировала свой потенциал использования в расследовании нейронов клеточный ответ в TBI условиях. Отметим также, что этот метод очень универсален в том, что любой тип клеток может подвергаться давлению на импульсивные различного уровня и продолжительности. Таким образом, устройство может быть использовано для исследования импульсивных индуцированных давлением сотовой поведения механотрансдукции, не только за причинение вреда клеткам, но и положительно стимулирует клетки в их функции и определения судьбы.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить источники финансирования: Военно-UNL центром Травма механики (DoD / ARO, # W911NF-11-1-0033, PI: д-р Namas Chandra), UNL премии Лайман (26-1110-0033 -001 , PI: Lim).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SH-SY5Y (ATCC, CRL-2266) human neuroblastoma cells | |||
| 18 mm diameter glass coverslips | |||
| Cell culture media: DMEM, 10% fetal bovine serum, 1% penicillin-streptomycin | |||
| Retinoic acid (10 μM) for inducing neurogenesis | |||
| Kolsky bar impulsive pressurization device | |||
| Piston-cylinder cell pressurization chamber | |||
| Stainless steel screws for securing cell cultured coverslip on the piston | |||
| Grease for interfaces between cell chamber and Kolsky bar | |||
| General molecular biology supplies for assessing cell response to pressurization (fixative, antibody, fluorescent dye, PCR supplies, etc.) |
References
- Kolsky, H. An investigation of mechanical properties of materials at very high rates of loading. Prec. Phys. Soc. London. 62, 676-700 (1949).
- Tang-Schomer, M. D., Patel, A. R., Baas, P. W., Smith, D. H. Mechanical breaking of microtubules in axons during dynamic stretch injury underlies delayed elasticity, microtubule disassembly, and axon degeneration. FASEB. J. 24, 1401-1410 (2010).
- Lim, J. Y., Taylor, A. F., Li, Z., Vogler, E. A., Donahue, H. J. Integrin expression and osteopontin regulation in human fetal osteoblastic cells mediated by substratum surface characteristics. Tissue. Eng. 11, 19-29 (2005).
- Chen, Y. C., Smith, D. H., Meaney, F. D. In vitro approaches for studying blast-induced traumatic brain injury. J. Neurotrauma. 26, 861-876 (2009).
- Ling, G., Bandak, F., Armonda, R., Grant, G., Ecklund, J. Explosive blast neurotrauma. J. Neurotrauma. 26, 815-825 (2009).
- Shepard, S. R., Ghajar, J. B. G., Giannuzzi, R., Kupferman, S., Hariri, R. J. Fluid percussion barotrauma chamber: a new in vitro model for traumatic brain injury. J. Surg. Res. 51, 417-424 (1991).
- VandeVord, P. J., Leung, L. Y., Hardy, W., Mason, M., Yang, K. H., King, I. A. Up-regulation of reactivity and survival genes in astrocytes after exposure to short duration overpressure. Neurosci. Lett. 434, 247-252 (2008).
- Huang, H., Feng, R. A study of the dynamic tribological response of closed fracture surface pairs by Kolsky-bar compression-shear experiment. Int. J. Solids. Struct. 41, 2821-2835 (2004).
- Song, B., Chen, W. Split Hopkinson pressure bar techniques for characterizing soft materials. Lat. Am. J. Solids. Struct. 2, 113-152 (2005).
