Summary
हम एक रिसेप्टर सेल मुक्त बाध्यकारी परख डिजाइन क्रम में रिसेप्टर्स करने के लिए granulocyte-बृहतभक्षककोशिका कॉलोनी उत्तेजक कारक (जीएम-CSF) के बंधन का अनुमान है. यह हमें सक्षम बनाता है biotinylated जीएम-CSF के प्रतिस्पर्धी निषेध घुलनशील जीएम-CSF रिसेप्टर अल्फा के लिए बाध्य उत्कृष्ट reproducibility के साथ जीएम-CSF autoantibody द्वारा मूल्यांकन है.
Protocol
1. उत्पादन और sGMRα की शुद्धि
- पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) के द्वारा मानव नाल सीडीएनए लाइब्रेरी से sGMRα के सीडीएनए बढ़ाना.
- उनका टैग 3 'की एक और पीसीआर पीसीआर amplicon अंत करने के लिए 50 आधार baculovirus polyhedrin अंत के अनुक्रम 5'-UTR और 27 आधार कोडन RGS जोड़ें.
- एक प्लाज्मिड pMSG1.1MG में परिलक्षित पीसीआर उत्पाद डालें.
- सहायक वेक्टर रेशमकीट तनाव PND-w1 के अंडे में pHA3PIG निर्माण psGMR/M1.1MG इंजेक्षन.
- 25 में रियर रची G0 पतिंगे लार्वा डिग्री सेल्सियस स्क्रीन G1 भाई बहन के बीच या PND-w1 के साथ संभोग के द्वारा MGFP अभिव्यक्ति के लिए आंखों में प्राप्त करने के लिए ट्रांसजेनिक कीड़ों sGMRα जीन असर प्राप्त भ्रूण.
- ट्रांसजेनिक रेशम के कीड़ों की cocoons से 500mm NaCl युक्त फॉस्फेट - बफर के साथ पुनः संयोजक sGMRα और 4 में हलचल ° 24 घंटों के लिए सी निकालें.
- 15min के लिए 20000 जी पर नमूना अपकेंद्रित्र को हमेशा हटाने की एक precipitates.
- एक स्तंभ निकल आत्मीयता सतह पर तैरनेवाला लागू.
- Imidazole 10mm, 500mm NaCl और 20mm सोडियम फॉस्फेट, pH6.3, और imidazole की एक रैखिक ढाल के साथ 10mm से 250mm के लिए elute के साथ स्तंभ धो लें. पूल के खिलाफ शुद्ध sGMRα और dialyze युक्त भिन्न खारा फॉस्फेट-buffered (pH7.4) (पीबीएस).
2. पुनः संयोजक जीएम-CSF की Biotinylation
- पीबीएस के खिलाफ डायलिसिस द्वारा sorbitol तैयारी निकालें.
- बर्फ पर समाधान करने के लिए 20mm ठंड 4 में सोडियम मेटा periodate समाधान ° C के 1ml जोड़ें.
- अंधेरे में बर्फ पर 30min के लिए नमूना सेते हैं.
- 15mm के एक अंतिम एकाग्रता में समाधान के लिए ग्लिसरॉल जोड़ें.
- 100mm सोडियम एसीटेट बफर (pH5.5) के खिलाफ समाधान Dialyze
- 5mm की एक अंतिम एकाग्रता में समाधान के लिए बायोटिन hydrazide जोड़ें और लगातार आंदोलन कमरे के तापमान पर 2 के लिए समाधान.
- Pbs, pH7.4 खिलाफ डायलिसिस द्वारा गैर - प्रतिक्रिया व्यक्त की सामग्री निकालें.
3. एक सेल मुक्त जीएम-CSF रिसेप्टर ligand बाध्यकारी परख
- कोट 4 में मोनोक्लोनल एंटीबॉडी विरोधी polyHistidine रातोंरात 50μl के साथ एक microtiter प्लेट डिग्री सेल्सियस
- PBST के 500μl के साथ पांच बार धोएं.
- एक अवरुद्ध समाधान और 3h लिए सेते 4 डिग्री सेल्सियस के 100μl जोड़ें
- PBST के 500μl के साथ पांच बार धोएं.
- SGMRα के अवरुद्ध समाधान में 50μl जोड़ें और 4 में रात भर सेते डिग्री सेल्सियस
- PBST के 500μl के साथ पांच बार धोएं.
- जीएम-CSF autoantibody और तब biotinylated जीएम-CSF के 25μl युक्त नमूनों की 25μl जोड़ें. 4 पर 1 के लिए सेते डिग्री सेल्सियस sGMRα जीएम-CSF जटिल फार्म करने के लिए.
- PBST के 500μl के साथ पांच बार धोएं.
- 4 में 1hour के लिए 0.4mm streptavidin alkaline फॉस्फेट के 50μl जोड़ें डिग्री सेल्सियस biotinylated जीएम-CSF बाध्य sGMRα का पता लगाने के लिए.
- PBST के 500μl के साथ पांच बार धोएं.
- समाधान के लिए एक chemiluminescent सब्सट्रेट के 50μl जोड़ें और कमरे के तापमान पर 1 के लिए incubated.
- एक chemiluminescence प्लेट रीडर का प्रयोग, chemiluminescence गतिविधि का पता लगाने.
4. प्रतिनिधि परिणाम:
रिसेप्टर जीएम-CSF संकेत transduction मार्ग में पहला कदम जीएम-CSF की कोशिका की सतह पर जीएम-CSF रिसेप्टर अल्फा के लिए बाध्य है. क्योंकि जीएम-CSF autoantibody विशेष रूप से जीएम-CSF बांध और 16,17 इन विट्रो में रिसेप्टर के लिए बाध्य ब्लॉक करने के लिए, हम धारणा है कि autoantibodies सीधे जीएम-CSF बंधन से यह पहली प्रतिक्रिया को बाधित. जैसा कि पहले वर्णित (15/09 संदर्भ), हम ट्रांसजेनिक रेशमकीट तकनीक लागू करने के लिए उच्च शुद्धता के साथ पुनः संयोजक sGMRα की एक बड़ी राशि प्राप्त करने के.
जब रेशमकीट व्युत्पन्न रीकॉम्बीनैंट sGMRα एसडीएस पृष्ठ पर गैर को कम करने की शर्तों के तहत भरी हुई थी, sGMRα दोनों (45 केडीए) monomeric और dimeric (90 केडीए) रूपों से पता चला है, जबकि केवल monomeric फार्म को कम करने शर्तों के तहत पता लगाया था (चित्रा 1 बी) यह दर्शाता है कि पुनः संयोजक sGMRα monomers और डाइसल्फ़ाइड से जुड़े 18 dimmers का एक मिश्रण था.
सेल मुक्त प्रणाली (छवि 2A) का उपयोग करना, हम sGMRα के लिए जीएम-CSF बाइंडिंग के जीएम-CSF (छवि 2B और चित्र 2C) autoantibodies द्वारा निषेध का मूल्यांकन. इन विधियों संदर्भ में 19 Urano एट अल द्वारा वर्णित किया गया. विकास निषेध जीएम-CSF (छवि 3A) autoantibody 19 के विभिन्न सांद्रता में बाध्यकारी निषेध (r = 0.988 = 0.002 पी) के साथ मिलकर सहसंबद्ध था . इसी तरह, बाध्यकारी निषेध काफी विकास निषेध के साथ सहसंबद्ध था. बंधन निषेध जीएम-CSF (छवि 3B) autoantibodies 19 के द्वारा एक खुराक पर निर्भर ढंग में वृद्धि हुई है . विभिन्न रोगियों से सीरम आईजीजी भागों के लिए इन दो मापदंडों के एक दूसरे सहसंबद्ध थे (नि. = 0.589 पी = .006, चित्र 3C). न तो बाध्यकारी निषेध और न ही विकास निषेध केडी मूल्यों के साथ सहसंबद्ध है, और इस प्रकार, दोनों मानकों द्वारा बाध्यकारी आत्मीयता 19 अप्रभावित थे. नतीजतन बंधन और छ के बीच डेटा के reproducibilityrowth तीन अलग अलग नमूने पर तीन स्वतंत्र प्रयोगों के माध्यम से प्राप्त निषेध मूल्यांकन किया गया था. विभिन्नता का गुणांक संकेत दिया है कि सेल मुक्त प्रणाली bioassay (तालिका 1) की तुलना में उत्कृष्ट था.
चित्रा 1. SGMRα ट्रांसजेनिक रेशम के कीड़ों का उपयोग कर के उत्पादन के लिए प्रक्रिया का प्रवाह चार्ट. ए) संरचनाएं परिवर्तन 9-11 वैक्टर. बी) एसडीएस PAGE और Coomassie खूब को कम करने और गैर को कम करने स्थितियों के तहत शुद्ध sGMRα ब्लू धुंधला हो जाना. sGMRα, घुलनशील जीएम-CSF रिसेप्टर अल्फा, MGFP, राक्षस हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन, BmNPVpol5' - UTR, 5'-untranslated Bombyx मोरी परमाणु polyhedrosis वायरस polyhedrin के क्षेत्र अनुक्रम; SV40 Pólya, SV40 Pólya संकेत अनुक्रम, 3xP3 पी, 3xP3 प्रमोटर, पी ser1, ser1 प्रमोटर, fibL Pólya, फ़ाइब्राइन एल श्रृंखला Pólya संकेत अनुक्रम, hr3, Bombyx मोरी परमाणु polyhedrosis वायरस hr3 बढ़ाने.
चित्रा 2 परख सेल मुक्त प्रणाली की योजना है . ए) एक प्रतिस्पर्धी बाध्यकारी sGMRα रेशमकीट द्वारा उत्पादित का उपयोग परख. बी) को निष्क्रिय और गैर निष्क्रिय करने एंटीबॉडी के प्रभाव सेल मुक्त प्रणाली द्वारा बाध्यकारी निषेध पर. ) एंटीबॉडी neutralizing और गैर - एंटीबॉडी neutralizing के विभिन्न सांद्रता के बीच बंधन निषेध के अंतर सी. जीएम-CSF, granulocyte-बृहतभक्षककोशिका कॉलोनी उत्तेजक कारक, sGMRα, घुलनशील जीएम-CSF रिसेप्टर अल्फा, उनकी, RGS उनकी-टैग, एपी, alkaline फॉस्फेट.
चित्रा 3. जीएम-CSF जीएम-CSF पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी या autoimmune पीएपी के साथ रोगियों से सीरम आईजीजी भिन्न प्रभाव से sGMRα बंधन निषेध. ए) बाध्यकारी और जीएम-CSF autoantibody द्वारा विकास निषेध निषेध के बीच संबंध. बी) जीएम-CSF autoantibody के विभिन्न सांद्रता में बाध्यकारी निषेध. सी) प्रतिशत बाध्यकारी और सीरम आईजीजी 19 भिन्न द्वारा प्रतिशत वृद्धि निषेध निषेध के लिए आईसी 50 के बीच संबंध . आईसी 50, 50% निरोधात्मक एकाग्रता, जीएम-CSF, granulocyte-बृहतभक्षककोशिका कॉलोनी उत्तेजक कारक.
| नमूना | एक | बी | सी |
| अंतर - परख | |||
| # Determinations के | 3 | 3 | 3 |
| मीन मूल्य (% बंधन निषेध) | 61.6 | 63.8 | 69.7 |
| मीन मूल्य (% विकास निषेध) | 21.0 | 73.4 | 82.8 |
| विभिन्नता का गुणांक (%) (% बंधन निषेध) | 6.0 | 5.6 | 8.3 |
| विभिन्नता का गुणांक (%) (% की वृद्धि निषेध) | 64.4 | 18.3 | 10.4 |
दोनों assays 5 एनजी / एमएल और जीएम-CSF की एक जीएम-CSF autoantibody बराबर एकाग्रता में प्रदर्शन किया गया.
तालिका 1 प्रतिशत बंधन और विकास संकोच के बीच भिन्नरूपों तीन स्वतंत्र प्रयोगों के माध्यम से प्राप्त के गुणांक की तुलना.
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Discussion
सेल मुक्त परख उत्कृष्ट reproducibility और तेज़ी के साथ जीएम-CSF autoantibodies के को निष्क्रिय क्षमता का अनुमान है. जीएम-CSF autoantibodies या रोगी के सीरम आईजीजी भिन्न बंधन निषेध इस परख द्वारा मूल्यांकन किया गया था. डेटा सेल मुक्त परख के बंधन निषेध और TF 1-कोशिकाओं, क्रमशः का उपयोग bioassay के विकास निषेध के बीच एक संबंध दिखाया. bioassay व्यापक रूप से उपयोग किया गया है, लेकिन विभिन्न सुविधाओं और अलग समय अंक है, जो हम इस नई प्रणाली का उपयोग करके से बचने कर सकते हैं के बीच डेटा की तुलना में कठिनाइयों harbored.
जीएम-CSF कम आत्मीयता के साथ sGMRα को बांधता है और एक द्विआधारी जटिल 20 फार्म . हाल के अध्ययनों से दिखा दिया कि मानव जीएम-CSF जीएम-CSF रिसेप्टर अल्फा और जीएम-CSF रिसेप्टर सेल 21 की सतह पर उच्च आत्मीयता के साथ एक dodecameric जटिल बनाने बीटा को बांधता है . इस प्रकार, एक परख त्रिगुट monomeric जीएम-CSF रिसेप्टर अल्फा और dimeric रिसेप्टर जीएम-CSF बीटा से मिलकर परिसरों पर आधारित प्रणाली एक भविष्य के उम्मीदवार प्रणाली मुक्त परख सेल में सुधार होगा.
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Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम उनके बहुमूल्य योगदान के लिए लालकृष्ण Nakagaki, डा. एच. इशी, डा. के सुजुकी, ए यामागाटा, लालकृष्ण Oofusa बहुत आभारी हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| human placenta cDNA library | Takara | ||
| Nickel affinity column | GE Healthcare | 17-5247-01 | |
| biotin hydrazide (EZ-Link Biotin Hydrazide) | PIERCE | 21339 | |
| rhGM-CSF (leukine) | Genzyme Corporation | ||
| Nunc Immobilizer Amino | Nalge Nunc International | 436007 | |
| Monoclonal Anti-polyHistidine antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | H1029 | 0.2ml |
| blocking solution (StabilCoat) | Surmodics | SC01-1000 | 1000ml |
| ZyMAX Streptavidin-AP Conjugate | Invitrogen | 43-8322 | |
| CDP-Star Ready-to-Use With Sapphire-II | Applied Biosystems | T2214 | |
| chemiluminescence plate reader | BERTHOLD TECHNOLOGIES | TriStar LB 941 |
References
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