Summary
Se diseñó un ensayo de receptor de la célula-unión libre con el fin de estimar la unión de granulocitos y macrófagos factor estimulante de colonias (GM-CSF) a los receptores. Que nos permite evaluar la inhibición competitiva de biotina GM-CSF unión a los receptores alfa soluble GM-CSF por GM-CSF autoanticuerpos con una excelente reproducibilidad.
Abstract
ANTECEDENTES: Anteriormente, hemos demostrado que la capacidad de neutralizar, pero no la concentración de GM-CSF autoanticuerpos se correlaciona con la severidad de la enfermedad en pacientes con proteinosis alveolar pulmonar autoinmune (PAP) 1-3. Como la derogación de GM-CSF en la bioactividad de pulmón es la causa probable de PAP 4,5 autoinmune, es prometedor para medir la capacidad de neutralización de anticuerpos GM-CSF para evaluar la gravedad de la enfermedad en cada paciente con PAP.
Hasta ahora, la capacidad de neutralización de anticuerpos GM-CSF ha sido evaluado mediante la evaluación de la inhibición del crecimiento de las células de la médula ósea o la TF-1 las células estimuladas con GM-CSF 6-8. En el sistema de bioensayo, sin embargo, es a menudo problemático obtener datos fiables, así como para comparar los datos de diferentes laboratorios, debido a las dificultades técnicas en el mantenimiento de las células en un estado constante.
OBJETIVO: Para imitar GM-CSF unión a receptores de GM-CSF en la superficie celular utilizando células libres de unión al receptor-ensayo.
Métodos transgénicos gusano de seda se ha aplicado la tecnología para la obtención de una gran cantidad de soluble recombinante alfa del receptor de GM-CSF (sGMRα) de alta pureza 13.09. El sGMRα recombinante estaba contenido en las capas sericina hidrofílico de hilos de seda sin ser fusionadas a las proteínas de la seda, y por lo tanto, es fácil extraer de los capullos de buena pureza con soluciones acuosas neutras 14,15. Afortunadamente, las estructuras de oligosacáridos, que son críticos para la unión con GM-CSF, son más similares a las estructuras de sGMRα humanos que las producidas por otros insectos o levaduras.
Resultados: El sistema de ensayo libre de células con sGMRα dado los datos con alta plasticidad y la fiabilidad. Unión a sGMRα GM-CSF fue dosis-dependiente inhibido por policlonal GM-CSF autoanticuerpos en una forma similar a los bioensayos con la TF-1 en las células, lo que indica que nuestra libre de células nuevo sistema de ensayo utilizando sGMRα es más útil para la medición de la actividad neutralizante de GM-CSF autoanticuerpos que el sistema de bioensayo con TF-1 de células o células humanas de médula ósea.
Conclusiones: Se estableció un ensayo libre de células cuantificar la capacidad de neutralización de GM-CSF autoanticuerpos.
Protocol
1. Producción y purificación de sGMRα
- Amplificar cDNA de sGMRα de placenta humana biblioteca de cDNA por reacción en cadena de polimerasa (PCR).
- Añadir 50 bases 5'-UTR secuencia de final de baculovirus polihedrina y 27 RGS base de codificación de su etiqueta en el extremo 3 'a la amplificación de PCR por otro PCR.
- Inserte la amplificación de PCR en un pMSG1.1MG plásmido.
- Inyectar el psGMR/M1.1MG construir con el vector de ayuda pHA3PIG en los huevos de gusanos de seda PND-w1 cepa.
- Trasera del cascarón G0 larvas de las polillas a 25 ° C. Seleccionar embriones G1 obtenido en el apareamiento entre hermanos o con PND-w1 para la expresión MGFP en los ojos para obtener los gusanos de seda transgénicos que llevan el gen sGMRα.
- Extracto recombinante sGMRα de los capullos de gusanos de seda transgénicos con tampón fosfato que contiene NaCl 500 mm y se agita a 4 ° C durante 24 horas.
- Centrifugar la muestra a 20000 g durante 15 minutos para eliminar un precipitado.
- Aplicar sobrenadante a una columna de afinidad de níquel.
- Lavar la columna con 10 mM imidazol, NaCl 500 mm y fosfato de sodio 20 mM, pH6.3, y eluir con un gradiente lineal de imidazol de 10 mm a 250 mm. Piscina de las fracciones que contiene el sGMRα purificada y diálisis frente a tampón fosfato salino (pH 7,4) (PBS).
2. Biotinilación de GM-CSF recombinante
- Retire la preparación de sorbitol por diálisis contra PBS.
- Añadir 1 ml de 20 mM de sodio frío meta-peryodato solución a 4 ° C a la solución en hielo.
- Incubar la muestra durante 30 minutos sobre el hielo en la oscuridad.
- Agregar a la solución de glicerol a una concentración final de 15 mm.
- La solución de diálisis frente a tampón acetato de sodio 100 mM (pH 5,5)
- Añadir biotina hidrazida a la solución a una concentración final de 5 mM y continuamente agitar la solución durante 2 horas a temperatura ambiente.
- Retire el material que no ha reaccionado por diálisis contra PBS, pH 7,4.
3. Una célula sin GM-CSF receptor-ligando vinculante ensayo
- Un abrigo de placas de microtitulación con 50μl de anticuerpo monoclonal anti-anticuerpos polihistidina la noche a 4 ° C.
- Lavar cinco veces con 500μl de PBST.
- Agregar 100μl de una solución de bloqueo y se incuba durante 3 horas a 4 ° C.
- Lavar cinco veces con 500μl de PBST.
- Añadir 50μl de sGMRα en la solución de bloqueo y se incuba durante la noche a 4 ° C.
- Lavar cinco veces con 500μl de PBST.
- Añadir 25μl de las muestras que contienen GM-CSF autoanticuerpos y 25μl de biotina GM-CSF. Incubar durante 1h a 4 ° C para formar sGMRα-GM-CSF complejo.
- Lavar cinco veces con 500μl de PBST.
- Añadir 50μl de 0,4 mm de fosfatasa alcalina estreptavidina durante 1 hora a 4 ° C para detectar la biotina GM-CSF obligado sGMRα.
- Lavar cinco veces con 500μl de PBST.
- Añadir 50μl de un sustrato quimioluminiscente para la solución y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente.
- El uso de un lector de placas de quimioluminiscencia, detectar la actividad de quimioluminiscencia.
4. Los resultados representativos:
El primer paso en la vía de transducción de GM-CSF receptor de señal es la unión de GM-CSF a la alfa del receptor de GM-CSF en la superficie celular. Debido a que GM-CSF autoanticuerpos se une específicamente al GM-CSF y bloquear su unión al receptor in vitro 16,17, la hipótesis de que los anticuerpos inhiben esta primera reacción uniéndose directamente a GM-CSF. Como se describió previamente (Ref. 9-15), se aplicó la tecnología de transgénicos del gusano de seda para obtener una gran cantidad de sGMRα recombinante de alta pureza.
Cuando el gusano de seda de origen recombinante sGMRα fue cargada en el SDS-PAGE en condiciones no reductoras, el sGMRα mostró tanto monomérica (45 kDa) y diméricas (90 kDa), las formas, mientras que sólo la forma monomérica se detectó en condiciones reductoras (fig. 1B) , lo que indica que la sGMRα recombinante era una mezcla de monómeros y reguladores disulfuro vinculados 18.
Utilizando el sistema libre de células (Fig. 2A), se evaluó la inhibición de la GM-CSF unión a sGMRα por GM-CSF autoanticuerpos (Fig. 2B y 2C fig.). Estos métodos se describe en la referencia 19 por Urano et al. La inhibición del crecimiento se correlaciona estrechamente con la inhibición de la unión (r = 0,988, p = 0,002) en diversas concentraciones de los autoanticuerpos GM-CSF (Fig. 3) 19. Del mismo modo, la inhibición de la unión se correlacionó significativamente con la inhibición del crecimiento. La inhibición de la unión aumenta de manera dosis-dependiente de GM-CSF autoanticuerpos (Fig. 3B) 19. Estos dos parámetros para el suero de las fracciones IgG de los distintos pacientes se correlacionaron entre sí (r = 0,589 p = 0,006, fig. 3C). Ni inhibición de la unión ni la inhibición del crecimiento correlacionado con los valores de Kd, y por lo tanto, ambos parámetros no se vieron afectados por la afinidad de unión 19. Por lo tanto la reproducibilidad de los datos entre la unión y la grecimiento inhibición obtenidos a través de tres experimentos independientes en tres diferentes muestras se evaluó. El coeficiente de variación indica que el sistema libre de células fue más excelente que el de bioensayo (tabla 1).
Figura 1. Diagrama de flujo del procedimiento para la producción de transgénicos sGMRα con gusanos de seda. A) Las estructuras de las 09.11 vectores de transformación. B) SDS-PAGE y Coomassie Brilliant Blue-tinción de la sGMRα purificada virtud de la reducción y las condiciones no reductoras. sGMRα, soluble GM-CSF receptor alfa; MGFP, el monstruo de la proteína verde fluorescente, BmNPVpol5'-UTR, 5 'no traducida secuencia de la región de Bombyx mori poliedrosis nuclear virus polihedrina; SV40 poliA, SV40 secuencia señal poliA; P 3xP3, 3xP3 promotor; P SER1, SER1 promotor; FiBL poliA, fibroína L-secuencia de la cadena de señal poliA, HR3, Bombyx mori poliedrosis nuclear virus HR3 potenciador.
Figura 2. Esquema del sistema de ensayo libre de células. A) Un ensayo de unión competitiva con sGMRα producida por gusanos de seda. B) Efecto de los anticuerpos neutralizantes y no neutralizantes en la inhibición de la unión de células sin sistema. C) La diferencia de la inhibición de la unión entre las diferentes concentraciones de anticuerpos neutralizantes y los anticuerpos no neutralizantes. GM-CSF, granulocitos y macrófagos factor estimulante de colonias; sGMRα, soluble GM-CSF receptor alfa, Su, RGS-Su-etiqueta; AP, la fosfatasa alcalina.
Figura 3. GM-CSF inhibición de la unión de sGMRα por efecto de GM-CSF anticuerpos policlonales o el suero de las fracciones IgG de los pacientes con PAP autoinmunes. A) Relación entre la inhibición de la unión y la inhibición del crecimiento de GM-CSF autoanticuerpos. B) inhibición de la unión a varias concentraciones de GM-CSF autoanticuerpos. C) La relación entre IC 50 por ciento de inhibición de unión y la inhibición del crecimiento por ciento en el suero de las fracciones IgG 19. IC 50, 50% de la concentración inhibitoria; GM-CSF, granulocitos y macrófagos factor estimulante de colonias.
| Muestra | A | B | C |
| Inter-ensayo | |||
| Número de determinaciones | 3 | 3 | 3 |
| El valor medio (% inhibición de la unión) | 61.6 | 63.8 | 69.7 |
| El valor medio (% de inhibición del crecimiento) | 21.0 | 73.4 | 82.8 |
| Coeficiente de variación (%) (% inhibición de la unión) | 6.0 | 5.6 | 8.3 |
| Coeficiente de variación (%) (% de inhibición del crecimiento) | 64.4 | 18.3 | 10.4 |
Ambos ensayos se realizaron a 5 ng / ml de GM-CSF y una concentración igual a GM-CSF autoanticuerpos.
Tabla 1. Comparación de coeficiente de variación entre el enlace por ciento y las inhibiciones del crecimiento obtenida a través de tres experimentos independientes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El ensayo libre de células calcula la capacidad de neutralización de GM-CSF autoanticuerpos con una excelente reproducibilidad y rapidez. La inhibición de la unión de GM-CSF o fracciones de autoanticuerpos en suero de los pacientes IgG se evaluó en este ensayo. Los datos mostraron una correlación entre la inhibición de la unión de la prueba libre de células y la inhibición del crecimiento de un bioensayo con células TF-1, respectivamente. El bioensayo ha sido ampliamente utilizado, pero albergaba las dificultades en la comparación de datos entre las diferentes instalaciones y diferentes puntos de tiempo, lo que se puede evitar mediante el uso de este nuevo sistema.
GM-CSF se une a sGMRα con baja afinidad y forman un complejo de 20 binario. Estudios recientes han demostrado que el GM-CSF humano se une a GM-CSF receptor alfa y GM-CSF beta del receptor de la formación de un complejo dodecameric con alta afinidad en la superficie celular 21. Por lo tanto, un sistema de ensayo basado en complejos ternarios que consta de monómero de GM-CSF receptor alfa y GM-CSF dimérica del receptor beta sería un sistema futuro candidato para mejorar el ensayo libre de células.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Estamos muy agradecidos a K. Nakagaki, el Dr. H. Ishii, el Dr. K. Suzuki, Yamagata A., Oofusa K. por su valiosa contribución.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| human placenta cDNA library | Takara | ||
| Nickel affinity column | GE Healthcare | 17-5247-01 | |
| biotin hydrazide (EZ-Link Biotin Hydrazide) | PIERCE | 21339 | |
| rhGM-CSF (leukine) | Genzyme Corporation | ||
| Nunc Immobilizer Amino | Nalge Nunc International | 436007 | |
| Monoclonal Anti-polyHistidine antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | H1029 | 0.2ml |
| blocking solution (StabilCoat) | Surmodics | SC01-1000 | 1000ml |
| ZyMAX Streptavidin-AP Conjugate | Invitrogen | 43-8322 | |
| CDP-Star Ready-to-Use With Sapphire-II | Applied Biosystems | T2214 | |
| chemiluminescence plate reader | BERTHOLD TECHNOLOGIES | TriStar LB 941 |
References
- Arai, T. Serum neutralizing capacity of GM-CSF reflects disease severity in a patient with pulmonary alveolar proteinosis successfully treated with inhaled GM-CSF. Respir Med. 98, 1227-1230 (2004).
- Tazawa, R. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and lung immunity in pulmonary alveolar proteinosis. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1142-1149 (2005).
- Inoue, Y. Characteristics of a large cohort of patients with autoimmune pulmonary alveolar proteinosis in Japan. Am J Respir Crit Care Med. 177, 752-762 (2008).
- Uchida, K. High-affinity autoantibodies specifically eliminate granulocyte-macrophage colony-stimulating factor activity in the lungs of patients with idiopathic pulmonary alveolar proteinosis. Blood. 103, 1089-1098 (2004).
- Sakagami, T. Human GM-CSF autoantibodies and reproduction of pulmonary alveolar proteinosis. N Engl J Med. 361, 2679-2681 (2009).
- Raines, M. Identification and molecular cloning of a soluble human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 8203-8207 (1991).
- Williams, W., VonFeldt, J., Rosenbaum, H., Ugen, K., Weiner, D. Molecular cloning of a soluble form of the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor alpha chain from a myelomonocytic cell line. Expression, biologic activity, and preliminary analysis of transcript distribution. Arthritis Rheum. 37, 1468-1478 (1994).
- Prevost, J. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and inflammatory stimuli up-regulate secretion of the soluble GM-CSF receptor in human monocytes: evidence for ectodomain shedding of the cell surface GM-CSF receptor alpha subunit. J Immunol. 169, 5679-5688 (2002).
- Iizuka, M. Production of a recombinant mouse monoclonal antibody in transgenic silkworm cocoons. FEBS J. 276, 5806-5820 (2009).
- Iizuka, M., Tomita, M., Shimizu, K., Kikuchi, Y., Yoshizato, K. Translational enhancement of recombinant protein synthesis in transgenic silkworms by a 5'-untranslated region of polyhedrin gene of Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus. J Biosci Bioeng. 105, 595-603 (2008).
- Zou, W., Ueda, M., Yamanaka, H., Tanaka, A. Construction of a combinatorial protein library displayed on yeast cell surface using DNA random priming method. J Biosci Bioeng. 92, 393-396 (2001).
- Tamura, T. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat Biotechnol. 18, 81-84 (2000).
- Tomita, M. Transgenic silkworms produce recombinant human type III procollagen in cocoons. Nat Biotechnol. 21, 52-56 (2003).
- Ogawa, S., Tomita, M., Shimizu, K., Yoshizato, K. Generation of a transgenic silkworm that secretes recombinant proteins in the sericin layer of cocoon: production of recombinant human serum albumin. J Biotechnol. 128, 531-544 (2007).
- Tomita, M. A germline transgenic silkworm that secretes recombinant proteins in the sericin layer of cocoon. Transgenic Res. 16, 449-465 (2007).
- Kitamura, T. Idiopathic pulmonary alveolar proteinosis as an autoimmune disease with neutralizing antibody against granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 190, 875-880 (1999).
- Tanaka, N. Lungs of patients with idiopathic pulmonary alveolar proteinosis express a factor which neutralizes granulocyte-macrophage colony stimulating factor. FEBS Lett. 442, 246-250 (1999).
- Brown, C., Pihl, C., Murray, E. Oligomerization of the soluble granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor: identification of the functional ligand-binding species. Cytokine. 9, 219-225 (1997).
- Urano, S. A cell-free assay to estimate the neutralizing capacity of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor autoantibodies. J Immunol Methods. 360, 141-148 (2010).
- Hayashida, K. Molecular cloning of a second subunit of the receptor for human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF): reconstitution of a high-affinity GM-CSF receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9655-9659 (1990).
- Hansen, G. The structure of the GM-CSF receptor complex reveals a distinct mode of cytokine receptor activation. Cell. 134, 496-507 (2008).
