Summary
עיצבנו assay תא ללא קולטן מחייב כדי לאמוד את הכריכה של גורם המושבה מגרה granulocyte-מקרופאג (GM-CSF) לקולטנים. זה מאפשר לנו להעריך עיכוב תחרותי של biotinylated GM-CSF מחייב מסיסים GM-CSF קולטן אלפא ידי GM-CSF autoantibody עם reproducibility מעולה.
Abstract
רקע: בעבר, הראינו כי יכולת נטרול אך לא את הריכוז של GM-CSF autoantibody היתה בקורלציה עם חומרת המחלה בחולים עם proteinosis אוטואימוניות מכתשיים ריאתי (PAP) 1-3. כפי וביטול bioactivity GM-CSF בריאה היא הגורם סביר PAP אוטואימוניות 4,5, הוא מבטיח למדוד את יכולת נטרול של GM-CSF נוגדנים עצמיים להערכת חומרת המחלה על כל חולה עם PAP.
עד עכשיו, יכולת נטרול של GM-CSF נוגדנים עצמיים כבר העריכו ידי הערכת עיכוב הצמיחה של האדם תאים במח העצם או TF-1 תאים מגורה עם GM-CSF 6-8. במערכת המבדק, לעומת זאת, הוא לעתים קרובות בעייתי לקבל נתונים אמינים כמו גם להשוות את הנתונים ממעבדות שונות, בשל קשיים טכניים בשמירה על תאים במצב קבוע.
המטרה: לחקות GM-CSF מחייב לקולטן GM-CSF על פני התא באמצעות קולטן תא-free-binding-assay.
שיטות: טראנסגנטי תולעי משי הטכנולוגיה יושמה לקבלת כמות גדולה של מסיס רקומביננטי GM-CSF קולטני אלפא (sGMRα) עם הטוהר גבוהה 9-13. SGMRα רקומביננטי היה הכלולים שכבות sericin הידרופילי של חוטי משי מבלי התמזגו את החלבונים משי, ולכן, אנחנו יכולים בקלות לחלץ מתוך פקעות של טוהר טוב עם תמיסות מימיות נייטרלי 14,15. למרבה המזל, מבנים oligosaccharide, אשר הם קריטיים עבור מחייב עם GM-CSF, דומים יותר מבני האדם sGMRα מאלה המיוצרים על ידי חרקים או שמרים אחרים.
תוצאות: מערכת תא ללא assay באמצעות sGMRα הניבו את הנתונים עם הפלסטיות אמינות גבוהה. GM-CSF מחייב sGMRα היה במינון dependently מעוכבים על ידי autoantibody polyclonal GM-CSF באופן דומה המבדק באמצעות TF-1 תאים, המציין כי חדש ללא התא שלנו assay המערכת באמצעות sGMRα שימושית יותר למדידת פעילות נטרול של GM-CSF נוגדנים עצמיים מאשר מערכת המבדק באמצעות TF-1 או תא אנושי לתאי מח עצם.
מסקנות: הקמנו assay תא ללא לכימות יכולת נטרול של GM-CSF autoantibody.
Protocol
1. הפקת וטיהור של sGMRα
- Amplify cDNA של sGMRα מספריית cDNA השליה האנושית על ידי שרשרת התגובה פולימראז (PCR).
- הוסף 50 בסיס 5'-UTR רצף של סוף polyhedrin baculovirus ו 27 RGS בסיס קידוד תג-שלו עד הסוף "3 עד amplicon PCR PCR על ידי אחר.
- הכנס את מוצר מוגבר PCR pMSG1.1MG לתוך פלסמיד.
- להזריק את psGMR/M1.1MG לבנות עם וקטור עוזר pHA3PIG לתוך הביצים של זן PND-W1 תולעי משי.
- אחורי בקעו G0 זחלי עש אל על 25 ° C. G1 מסך עוברים שהושגו ההזדווגות בין אחים או עם PND-W1 לביטוי MGFP בעיניים להשיג מהונדס תולעי משי נושאות את הגן sGMRα.
- תמצית רקומביננטי sGMRα מתוך פקעות של תולעי משי מהונדס עם חיץ, פוספט המכיל 500mm NaCl ומערבבים על 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
- צנטריפוגה מדגם ב 20000 g עבור 15min להסיר משקעים.
- החל supernatant לעמודה ניקל זיקה.
- לשטוף את העמודה עם imidazole 10mm, 500mm NaCl פוספט נתרן 20mm, pH6.3, ו elute עם שיפוע ליניארי של imidazole מ 10mm ל 250mm. בריכת שברים המכיל את sGMRα מטוהרים dialyze נגד פוספט שנאגרו מלוחים (pH7.4) (PBS).
2. Biotinylation רקומביננטי של GM-CSF
- הסר הכנה סורביטול ידי דיאליזה נגד PBS.
- הוסף 1ml של 20mm פתרון קר נתרן מטא periodate ב 4 ° C לפתרון על הקרח.
- דגירה המדגם עבור 30 דקות על הקרח בחושך.
- הוסף גליצרול לפתרון בריכוז הסופי של 15mm.
- Dialyze הפתרון נגד המאגר אצטט 100mm נתרן (pH5.5)
- הוסף hydrazide ביוטין לפתרון בריכוז הסופי של 5mm ברציפות להתסיס את הפתרון עבור 2h בטמפרטורת החדר.
- הסר את החומר הלא הגיבו דיאליזה נגד PBS, pH7.4.
3. תא ללא GM-CSF קולטן ליגנד מחייב assay
- מעיל microtiter צלחת עם 50μl של נוגדנים חד שבטיים אנטי polyHistidine לילה בשעה 4 ° C.
- לשטוף חמש פעמים עם 500μl של PBST.
- הוסף 100μl פתרון חסימת דגירה עבור 3h ב 4 ° C.
- לשטוף חמש פעמים עם 500μl של PBST.
- הוסף 50μl של sGMRα בפתרון חסימת דגירה לילה בשעה 4 ° C.
- לשטוף חמש פעמים עם 500μl של PBST.
- הוסף 25μl של דגימות המכילות GM-CSF autoantibody ואז 25μl biotinylated של GM-CSF. דגירה עבור 1h ב 4 ° C כדי ליצור sGMRα-GM-CSF מורכבים.
- לשטוף חמש פעמים עם 500μl של PBST.
- הוסף 50μl של phosphatase streptavidin 0.4mM אלקליין עבור 1hour ב 4 ° C כדי לזהות את biotinylated GM-CSF מחויב sGMRα.
- לשטוף חמש פעמים עם 500μl של PBST.
- הוסף 50μl של המצע chemiluminescent לפתרון וטופחו במשך 1h בטמפרטורת החדר.
- באמצעות קורא צלחת chemiluminescence, לזהות את פעילות chemiluminescence.
4. נציג תוצאות:
הצעד הראשון במסלול GM-CSF אות קולטן התמרה הוא מחייב של GM-CSF אלפא GM-CSF קולטן על פני התא. בגלל GM-CSF autoantibody במיוחד נקשר GM-CSF ולחסום מחייב שלו לקולטן במבחנה 16,17, אנו משערים כי נוגדנים עצמיים לעכב את התגובה הראשונה על ידי ישירות מחייב GM-CSF. כפי שתואר קודם לכן (Ref. 15/09), אנו ליישם טכנולוגיה מהונדס תולעי משי כדי להשיג כמות גדולה של sGMRα רקומביננטי עם טוהר גבוהה.
כאשר תולעי משי הנגזרות sGMRα רקומביננטי הועמס על PAGE-SDS תחת אי - הפחתת התנאים, הראה sGMRα הן monomeric (45 KDA) ו dimeric (90 KDA) טפסים, בעוד רק את הטופס monomeric זוהה בתנאים צמצום (איור 1B) , המציין sGMRα רקומביננטי היתה תערובת של מונומרים ו דיסולפיד צמודות dimmers 18.
שימוש במערכת תא חופשי (איור 2 א), אנו העריכו את עיכוב של GM-CSF מחייב sGMRα על ידי GM-CSF נוגדנים עצמיים (איור 2B ו איור. 2C). שיטות אלה תוארו על ידי התייחסות 19 Urano et al. עיכוב הצמיחה היתה בקורלציה הדוק עם עיכוב מחייב (r = 0.988, p = 0.002) בריכוזים שונים של autoantibody GM-CSF (איור 3A) 19. כמו כן, עיכוב הכריכה היה בקורלציה משמעותית עם עיכוב הצמיחה. עיכוב מחייב גדל באופן תלוי מינון על ידי GM-CSF נוגדנים עצמיים (איור 3 ב) 19. אלו שני פרמטרים עבור שברים סרום IgG מחולים שונים היו מתואמים זה לזה (r = 0.589 p = 0.006, איור. 3C). לא עיכוב ולא מחייב עיכוב גדילה בקורלציה עם ערכים Kd, ולכן הפרמטרים הן לא הושפעו על ידי זיקה מחייבת 19. כתוצאה מכך שחזור של נתונים בין מחייב gעיכוב rowth שהושג באמצעות שלושה ניסויים עצמאיים על שלושה מדגמים שונים הוערך. מקדם השונות ציינו כי מערכת תא חופשי היה מצוין יותר מזה של המבדק (לוח 1).
באיור 1. תרשים זרימה של תהליך הייצור של sGMRα מהונדס באמצעות תולעי משי. א) מבנים של וקטורים שינוי 9-11. ב) SDS-PAGE ו Coomassie מבריק מכתים כחול של sGMRα מטוהרים תחת צמצום ולא הפחתת התנאים. sGMRα, מסיסים GM-CSF קולטני אלפא; MGFP, מפלצת חלבון פלואורסצנטי ירוק; BmNPVpol5'-UTR, 5'-מתורגמים רצף של האזור Bombyx מורי גרעיני polyhedrosis וירוס polyhedrin; SV40 פולה, פולה SV40 רצף האות; P 3xP3, 3xP3 האמרגן, P ser1, ser1 מקדם; fibL פולה, fibroin L-שרשרת רצף פולה האות; hr3, Bombyx מורי גרעיני polyhedrosis וירוס hr3 משפר.
איור 2. Scheme של מערכת תא ללא assay. א) assay מחייב תחרותי באמצעות sGMRα המיוצר על ידי טוואי המשי. ב) השפעת נוגדנים מנטרלים ולא נטרול על עיכוב מחייב ידי מערכת התא חינם. ג) ההבדל של עיכוב מחייב בין ריכוזים שונים של נוגדנים מנטרלים ולא נוגדנים מנטרלים. GM-CSF, granulocyte-macrophage המושבה גורם מגרה; sGMRα, מסיסים GM-CSF קולטני אלפא;, שלו RGS שלו, תג: AP, phosphatase אלקליין.
איור 3. GM-CSF עיכוב מחייב sGMRα על ידי השפעה של GM-CSF נוגדנים polyclonal או שברים סרום IgG מחולים עם PAP אוטואימוניות. א) הקשר בין עיכוב מחייב עיכוב גדילה על ידי GM-CSF autoantibody. ב) עיכוב עקידת בריכוזים שונים של GM-CSF autoantibody. ג) הקשר בין IC 50 עבור עיכוב אחוז מחייב צמיחה עיכוב אחוז על ידי שברים IgG בסרום 19. IC 50, ריכוז מעכבות 50%, GM-CSF, granulocyte-macrophage המושבה גורם מגרה.
| מדגם | ב | ג | |
| Inter-assay | |||
| # של קביעות | 3 | 3 | 3 |
| ערך ממוצע (% עיכוב מחייב) | 61.6 | 63.8 | 69.7 |
| ערך ממוצע (צמיחה עיכוב%) | 21.0 | 73.4 | 82.8 |
| מקדם השונות (%) (% עיכוב מחייב) | 6.0 | 5.6 | 8.3 |
| מקדם השונות (%) (צמיחה עיכוב%) | 64.4 | 18.3 | 10.4 |
מבחני שניהם בוצעו 5 ng / ml של GM-CSF ו ריכוז שווה GM-CSF autoantibody.
טבלה 1. השוואה בין מקדם של וריאציות בין מחייב אחוזים עכבות הצמיחה שהושג באמצעות שלושה ניסויים עצמאיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Assay תא ללא העריכו את יכולת נטרול של GM-CSF נוגדנים עצמיים עם שחזור המהירות מעולה. עיכוב הכריכה על ידי GM-CSF או שברים נוגדנים עצמיים בסרום של החולה IgG הוערך על ידי assay זה. הנתונים הראו מתאם בין עיכוב המחייב של assay התא חינם ועל עיכוב הצמיחה של המבדק באמצעות TF-1 תאים, בהתאמה. המבדק נוצל באופן נרחב, אך טיפח קשיים בהשוואת הנתונים בין מתקנים שונים בנקודות זמן שונות, אשר אנו יכולים להימנע על ידי שימוש במערכת החדשה.
GM-CSF נקשר sGMRα עם זיקה נמוכה בצורה מורכבת 20 בינארית. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי האדם GM-CSF נקשר GM-CSF קולטן אלפא GM-CSF בטא רצפטור ויצרו מורכבות dodecameric עם זיקה גבוהה על פני התא 21. לפיכך, מערכת assay המבוסס על מתחמי משולשת המורכבת של קולטן GM-CSF monomeric אלפא GM-CSF dimeric בטא רצפטור תהיה מערכת מועמד בעתיד כדי לשפר את assay התא חינם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין לנו שום דבר לגלות.
Acknowledgments
אנו מודים מאוד ק Nakagaki, ד"ר ח אישיאי, ד"ר ק 'סוזוקי, א Yamagata, ק Oofusa תרומות יקר שלהם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| human placenta cDNA library | Takara | ||
| Nickel affinity column | GE Healthcare | 17-5247-01 | |
| biotin hydrazide (EZ-Link Biotin Hydrazide) | PIERCE | 21339 | |
| rhGM-CSF (leukine) | Genzyme Corporation | ||
| Nunc Immobilizer Amino | Nalge Nunc International | 436007 | |
| Monoclonal Anti-polyHistidine antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | H1029 | 0.2ml |
| blocking solution (StabilCoat) | Surmodics | SC01-1000 | 1000ml |
| ZyMAX Streptavidin-AP Conjugate | Invitrogen | 43-8322 | |
| CDP-Star Ready-to-Use With Sapphire-II | Applied Biosystems | T2214 | |
| chemiluminescence plate reader | BERTHOLD TECHNOLOGIES | TriStar LB 941 |
References
- Arai, T. Serum neutralizing capacity of GM-CSF reflects disease severity in a patient with pulmonary alveolar proteinosis successfully treated with inhaled GM-CSF. Respir Med. 98, 1227-1230 (2004).
- Tazawa, R. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and lung immunity in pulmonary alveolar proteinosis. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1142-1149 (2005).
- Inoue, Y. Characteristics of a large cohort of patients with autoimmune pulmonary alveolar proteinosis in Japan. Am J Respir Crit Care Med. 177, 752-762 (2008).
- Uchida, K. High-affinity autoantibodies specifically eliminate granulocyte-macrophage colony-stimulating factor activity in the lungs of patients with idiopathic pulmonary alveolar proteinosis. Blood. 103, 1089-1098 (2004).
- Sakagami, T. Human GM-CSF autoantibodies and reproduction of pulmonary alveolar proteinosis. N Engl J Med. 361, 2679-2681 (2009).
- Raines, M. Identification and molecular cloning of a soluble human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 8203-8207 (1991).
- Williams, W., VonFeldt, J., Rosenbaum, H., Ugen, K., Weiner, D. Molecular cloning of a soluble form of the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor alpha chain from a myelomonocytic cell line. Expression, biologic activity, and preliminary analysis of transcript distribution. Arthritis Rheum. 37, 1468-1478 (1994).
- Prevost, J. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and inflammatory stimuli up-regulate secretion of the soluble GM-CSF receptor in human monocytes: evidence for ectodomain shedding of the cell surface GM-CSF receptor alpha subunit. J Immunol. 169, 5679-5688 (2002).
- Iizuka, M. Production of a recombinant mouse monoclonal antibody in transgenic silkworm cocoons. FEBS J. 276, 5806-5820 (2009).
- Iizuka, M., Tomita, M., Shimizu, K., Kikuchi, Y., Yoshizato, K. Translational enhancement of recombinant protein synthesis in transgenic silkworms by a 5'-untranslated region of polyhedrin gene of Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus. J Biosci Bioeng. 105, 595-603 (2008).
- Zou, W., Ueda, M., Yamanaka, H., Tanaka, A. Construction of a combinatorial protein library displayed on yeast cell surface using DNA random priming method. J Biosci Bioeng. 92, 393-396 (2001).
- Tamura, T. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat Biotechnol. 18, 81-84 (2000).
- Tomita, M. Transgenic silkworms produce recombinant human type III procollagen in cocoons. Nat Biotechnol. 21, 52-56 (2003).
- Ogawa, S., Tomita, M., Shimizu, K., Yoshizato, K. Generation of a transgenic silkworm that secretes recombinant proteins in the sericin layer of cocoon: production of recombinant human serum albumin. J Biotechnol. 128, 531-544 (2007).
- Tomita, M. A germline transgenic silkworm that secretes recombinant proteins in the sericin layer of cocoon. Transgenic Res. 16, 449-465 (2007).
- Kitamura, T. Idiopathic pulmonary alveolar proteinosis as an autoimmune disease with neutralizing antibody against granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 190, 875-880 (1999).
- Tanaka, N. Lungs of patients with idiopathic pulmonary alveolar proteinosis express a factor which neutralizes granulocyte-macrophage colony stimulating factor. FEBS Lett. 442, 246-250 (1999).
- Brown, C., Pihl, C., Murray, E. Oligomerization of the soluble granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor: identification of the functional ligand-binding species. Cytokine. 9, 219-225 (1997).
- Urano, S. A cell-free assay to estimate the neutralizing capacity of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor autoantibodies. J Immunol Methods. 360, 141-148 (2010).
- Hayashida, K. Molecular cloning of a second subunit of the receptor for human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF): reconstitution of a high-affinity GM-CSF receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9655-9659 (1990).
- Hansen, G. The structure of the GM-CSF receptor complex reveals a distinct mode of cytokine receptor activation. Cell. 134, 496-507 (2008).
