Summary
Hücre reseptör bağlayıcı tahlil reseptörlerine granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) bağlama tahmin etmek için tasarlanmıştır. Bu mükemmel tekrarlanabilirlik ile GM-CSF otoantikor çözünen GM-CSF reseptör alfa bağlayıcı biotinlenmiş GM-CSF yarışmalı inhibisyonu değerlendirmek için bize sağlar.
Abstract
ZEMİN: Daha önce, biz bu nötralize kapasitesi gösterdi ama GM-CSF otoantikor konsantrasyonu otoimmün pulmoner alveoler proteinozis (PAP) 1-3 olan hastalarda hastalığın şiddeti ile korelasyon. Akciğer GM-CSF biyoaktivite kaldırılması 4,5 otoimmün PAP için olası nedeni olarak, PAP ile her hastada hastalık şiddeti değerlendirmek için, GM-CSF otoantikorların nötralize kapasitesini ölçmek için umut verici .
Şimdiye kadar, GM-CSF otoantikorların nötralize kapasitesi, insan kemik iliği hücreleri ya da GM-CSF 6-8 ile uyarılan TF-1 hücreleri büyüme inhibisyonu değerlendirerek değerlendirilmiştir. Biyoassay sisteminde, ancak sabit bir durum hücrelerin korunmasında teknik zorluklar nedeniyle farklı laboratuvarlarda verileri karşılaştırmak için güvenilir verilerin yanı sıra, elde etmek için çoğu zaman sorunlu.
AMAÇ: GM-CSF hücre reseptör-bağlayıcı-assay kullanarak hücre yüzeyinde GM-CSF reseptör bağlayıcı taklit etmek için.
YÖNTEM: Transgenik ipekböceği teknolojisi, yüksek saflıkta 9-13 rekombinant çözünür, GM-CSF reseptör alfa (sGMRα) için büyük miktarda elde etmek için uygulandı. Rekombinant sGMRα ipek proteinleri erimiş olmadan ipek ipler hidrofilik serizin katmanlarda yer aldığını ve böylece, biz nötr sulu çözeltileri 14,15 ile kolayca iyi saflık koza elde edebilirsiniz. Neyse ki, GM-CSF ile bağlama için kritik olan oligosakkarit yapılar, diğer böcekler ya da mayalar tarafından üretilen dışında insan sGMRα yapılarını daha benzer.
Bulgular: sGMRα kullanarak hücre test sistemi, yüksek plastisite ve güvenilirliği ile veri vermiştir. SGMRα için bağlayıcı GM-CSF sGMRα kullanarak yeni hücre ücretsiz test sistemi nötralize aktivitesinin ölçümü için daha yararlı olduğunu belirterek, benzer bir şekilde TF-1 hücreleri kullanarak biyoassay poliklonal GM-CSF otoantikor tarafından inhibe doza bağımlı TF-1 hücre veya insan kemik iliği hücreleri kullanarak biyoassay sistemine göre GM-CSF otoantikorların.
Sonuç: GM-CSF otoantikor nötralize kapasitesi niceleme bir hücre ücretsiz tahlil kurdu.
Protocol
1. SGMRα üretimi ve saflaştırılması
- Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile insan plasenta cDNA kütüphanesi sGMRα, cDNA artırın.
- His-tag 3 'başka bir PCR PCR Amplikon sonuna kadar 50 baz bakülovirüs polyhedrin sonu 5'-UTR dizisi ve 27 baz kodlama RGS ekleyin.
- Çoğaltılan PCR ürününün bir plazmid pMSG1.1MG içine yerleştirin.
- Ipekböceği PND-w1 suşu yumurta içine pHA3PIG yardımcı vektörü ile yapı psGMR/M1.1MG enjekte edilir.
- 25 kelebekler Arka yumurtadan G0 larvaları ° C SGMRα geni taşıyan transgenik böceklerinin elde etmek için gözlerini MGFP ifade için kardeşler arasında ya da PND-w1 çiftleşme elde Ekran G1 embriyolar.
- 500mm NaCl içeren fosfat tamponu ile transgenik böceklerinin koza rekombinant sGMRα ayıklayın ve 4 karıştırın ° C 24 saat için.
- 15dk 20000 g örnek bir çökeltileri kaldırmak için santrifüjleyin.
- Nikel afiniteli bir sütun supernatant uygulayın.
- 10mM imidazol, 500mm NaCl ve 20mm Sodyum fosfat, pH6.3 ve 10mm den 250mm imidazol doğrusal bir degrade Zehir sütun yıkayın. (PH7.4) karşı saflaştırılmış sGMRα ve dialyze içeren kesirler Havuzu fosfat tamponlu salin solüsyonu (PBS).
2. Rekombinant GM-CSF, biyotinilasyon
- PBS karşı diyaliz sorbitol hazırlık çıkarın.
- 4 20mm soğuk sodyum meta-periyodat çözüm ° C buz üzerinde çözüm 1ml ekleyin.
- Için örnek karanlıkta buz üzerinde 30 dk inkübe edin.
- 15mm son bir konsantrasyonda çözüm gliserol ekleyin.
- 100 mM sodyum asetat tamponu (pH5.5) karşı çözüm Dialyze
- 5mM son bir konsantrasyonda çözüm biotin hydrazide ekleyin ve oda sıcaklığında 2 saat için çözüm sürekli ajitasyon.
- PBS, pH7.4 karşı diyaliz olmayan tepki malzeme çıkarın.
3. Bir hücre GM-CSF reseptör-ligand bağlayıcı test
- 4 gece anti-polyHistidine monoklonal antikor 50μl Coat mikrotiter plate ° C
- PBST, 500μl beş kez yıkayın.
- 4 3h engelleyici bir çözüm ve inkübe ° C 100μl ekle
- PBST, 500μl beş kez yıkayın.
- Engelleme çözüm sGMRα, 50μl ekleyin ve 4 gece inkübe ° C
- PBST, 500μl beş kez yıkayın.
- GM-CSF otoantikor ve biotinlenmiş GM-CSF 25μl içeren örnekleri 25μl ekle. 1s için 4 ° C'de sGMRα-GM-CSF kompleks oluşturacak şekilde.
- PBST, 500μl beş kez yıkayın.
- 1 saat için 0.4 streptavidin alkalen fosfataz 50μl 4 ° C biotinlenmiş GM-CSF sınır sGMRα algılamak için.
- PBST, 500μl beş kez yıkayın.
- Çözüm için bir kemilüminesan substrat 50μl ve 1s oda sıcaklığında inkübe.
- Kemilüminesans plaka okuyucu kullanarak, kemilüminesans faaliyeti algılar.
4. Temsilcisi Sonuçlar:
GM-CSF reseptör sinyal iletim yolağı ilk adım hücre yüzeyinde GM-CSF, GM-CSF reseptör alfa bağlayıcıdır. GM-CSF otoantikor özellikle GM-CSF bağlar ve in vitro 16,17 reseptör bağlanma blok Çünkü otoantikorlar GM-CSF doğrudan bağlanarak bu ilk tepkisi inhibe ettiği hipotezini. (Ref. 9-15), daha önce açıklandığı gibi yüksek saflıkta ile rekombinant sGMRα büyük miktarda elde etmek için transgenik ipekböceği teknolojisi uygulanır.
Ipekböceği edilen rekombinant sGMRα düşürücü olmayan koşullar altında SDS-PAGE yüklü iken, sadece monomerik formu azaltarak koşulları altında tespit iken sGMRα (Şekil 1B), her iki monomerik (45 kDa) ve dimerik (90 kDa) formları gösterdi monomerlerin ve disülfit bağlantılı dimmer 18 rekombinant sGMRα bir karışımı olduğunu gösterir.
Kullanarak, hücre sistemi (Şekil 2A), GM-CSF otoantikorlar (Şekil 2B ve Şekil 2C) tarafından sGMRα, GM-CSF bağlama inhibisyonu değerlendirildi. Bu yöntemler URANO ve arkadaşları tarafından 19 referans tarif edildi. Büyüme inhibisyonu GM-CSF otoantikor (Şekil 3A) 19 çeşitli konsantrasyonlarda bağlayıcı inhibisyonu (r = 0,988, p = 0.002) ile yakından ilişkili oldu. Benzer şekilde, bağlayıcı inhibisyonu önemli ölçüde büyüme inhibisyonu ile korele bulunmuştur. Bağlayıcı inhibisyonu GM-CSF otoantikorlar (Şekil 3B) 19 doza bağımlı bir şekilde artmıştır . Bu iki parametre farklı hastadan alınan serum IgG fraksiyonları birbirleriyle korele idi (r = 0.589 p = 0.006, Şekil 3C). Ne bağlayıcı inhibisyonu ne de büyüme inhibisyonu Kd değerleri ile ilişkili ve bu nedenle, her iki parametre afinitesi 19 etkilenmemiştir . Sonuç olarak tekrarlanabilirlik bağlayıcı ve g arasında veriüç bağımsız üç farklı örnekleri üzerinde deneyler yoluyla elde rowth inhibisyonu değerlendirildi. Varyasyon katsayısı hücre sistemi biyoassay (Tablo 1) daha mükemmel olduğunu belirtti.
Şekil 1 transgenik böceklerinin kullanarak sGMRα üretimi için prosedürün Akış şeması. A) dönüşüm vektörleri 9-11 Yapıları. B) SDS-PAGE ve Coomassie azaltılması ve azaltıcı olmayan koşullar altında saflaştırılmış sGMRα Brillant Blue boyama. sGMRα, çözünür GM-CSF reseptör alfa; MGFP, canavar yeşil flüoresan protein BmNPVpol5'-UTR, Bombyx mori nükleer polyhedrosis virüs polyhedrin 5'-çevrilmemiş bölge sırası; SV40 Polya, SV40 Polya sinyal dizisi, P 3xP3, 3xP3 organizatörü, P ser1 ser1 organizatörü; fibL Polya, fibroin L-zincir Polya sinyal dizisi; hr3, Bombyx mori nükleer polyhedrosis virüs hr3 arttırıcı.
Şekil 2 hücre test sistemi şeması. A) İpek böceği tarafından üretilen sGMRα kullanarak rekabet bağlayıcı assay. B) Etkisi nötralize ve non-nötralize edici antikorlar hücre sistemi ile bağlayıcı inhibisyonu. C) nötralize edici antikorlar ve non-nötralize edici antikorlar çeşitli konsantrasyonlarda arasında bağlayıcı inhibisyonu fark. GM-CSF, granülosit makrofaj koloni-uyarıcı faktör; sGMRα, çözünür GM-CSF reseptör alfa; Onun, RGS-His-tag; AP, alkalin fosfataz.
Şekil 3 sGMRα GM-CSF, GM-CSF poliklonal antikorlar veya otoimmün PAP olan hastalarda serum IgG kesirler etkisi bağlayıcı inhibisyonu . A) GM-CSF otoantikor bağlayıcı inhibisyonu ve büyüme inhibisyonu arasındaki ilişki. GM-CSF otoantikor çeşitli konsantrasyonlarda B) Cilt inhibisyonu. C), yüzde bağlayıcı inhibisyonu serum IgG kesirler 19 ve yüzde büyüme inhibisyonu için IC 50 arasında ilişki . IC 50,% 50 inhibitör konsantrasyon; GM-CSF, granülosit-makrofaj koloni-uyarıcı faktör.
| Örnek | A | B | C |
| Inter-assay | |||
| # Tespitler | 3 | 3 | 3 |
| Ortalama değer (% bağlayıcı inhibisyonu) | 61,6 | 63,8 | 69,7 |
| Ortalama değer (% büyüme inhibisyonu) | 21,0 | 73,4 | 82,8 |
| Varyasyon katsayısı (%) (% bağlayıcı inhibisyonu) | 6,0 | 5,6 | 8,3 |
| Varyasyon katsayısı (%) (% büyüme inhibisyonu) | 64,4 | 18,3 | 10,4 |
Her iki Testler 5 ng / ml, GM-CSF ve GM-CSF otoantikor eşit bir konsantrasyon yapıldı.
Tablo 1 üç bağımsız deneyler yoluyla elde edilen yüzde bağlama ve büyüme inhibisyon arasındaki varyasyon katsayısı karşılaştırılması .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hücre ücretsiz test GM-CSF otoantikorların mükemmel tekrarlanabilirlik ve hızla nötralize kapasitesi tahmin edilmektedir. GM-CSF otoantikorlar veya hastanın serum IgG kesirler bağlayıcı inhibisyon testi ile değerlendirildi. Veri hücre testinin bağlayıcı inhibisyonu ve TF-1 hücreleri, sırasıyla kullanarak biyoassay büyüme inhibisyonu arasında bir korelasyon gösterdi. Biyoassay yaygın olarak kullanılan, ancak farklı tesis ve biz bu yeni sistem kullanarak önleyebilirsiniz farklı zaman noktaları arasında veri karşılaştırarak zorluklar beslemişlerdir olmuştur.
GM-CSF sGMRα için düşük afinite ile bağlanır ve ikili bir kompleks 20 formu. Son çalışmalar, insan GM-CSF, GM-CSF reseptör alfa ve GM-CSF reseptör beta hücre yüzeyinde 21 yüksek afinite ile dodecameric kompleksi oluşturan bağlar olduğunu göstermiştir . Böylece, monomerik GM-CSF reseptör alfa ve dimerik GM-CSF reseptör beta oluşan üçlü kompleksler dayalı bir test sistemi, hücre test geliştirmek için gelecekte aday sistemi olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa etmek için bir şey var.
Acknowledgments
Biz, değerli katkılarından dolayı K. Nakagaki Dr H. Ishii, Dr. K. Suzuki, A. Yamagata, K. Oofusa müteşekkiriz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| human placenta cDNA library | Takara | ||
| Nickel affinity column | GE Healthcare | 17-5247-01 | |
| biotin hydrazide (EZ-Link Biotin Hydrazide) | PIERCE | 21339 | |
| rhGM-CSF (leukine) | Genzyme Corporation | ||
| Nunc Immobilizer Amino | Nalge Nunc International | 436007 | |
| Monoclonal Anti-polyHistidine antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | H1029 | 0.2ml |
| blocking solution (StabilCoat) | Surmodics | SC01-1000 | 1000ml |
| ZyMAX Streptavidin-AP Conjugate | Invitrogen | 43-8322 | |
| CDP-Star Ready-to-Use With Sapphire-II | Applied Biosystems | T2214 | |
| chemiluminescence plate reader | BERTHOLD TECHNOLOGIES | TriStar LB 941 |
References
- Arai, T. Serum neutralizing capacity of GM-CSF reflects disease severity in a patient with pulmonary alveolar proteinosis successfully treated with inhaled GM-CSF. Respir Med. 98, 1227-1230 (2004).
- Tazawa, R. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and lung immunity in pulmonary alveolar proteinosis. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1142-1149 (2005).
- Inoue, Y. Characteristics of a large cohort of patients with autoimmune pulmonary alveolar proteinosis in Japan. Am J Respir Crit Care Med. 177, 752-762 (2008).
- Uchida, K. High-affinity autoantibodies specifically eliminate granulocyte-macrophage colony-stimulating factor activity in the lungs of patients with idiopathic pulmonary alveolar proteinosis. Blood. 103, 1089-1098 (2004).
- Sakagami, T. Human GM-CSF autoantibodies and reproduction of pulmonary alveolar proteinosis. N Engl J Med. 361, 2679-2681 (2009).
- Raines, M. Identification and molecular cloning of a soluble human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 8203-8207 (1991).
- Williams, W., VonFeldt, J., Rosenbaum, H., Ugen, K., Weiner, D. Molecular cloning of a soluble form of the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor alpha chain from a myelomonocytic cell line. Expression, biologic activity, and preliminary analysis of transcript distribution. Arthritis Rheum. 37, 1468-1478 (1994).
- Prevost, J. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and inflammatory stimuli up-regulate secretion of the soluble GM-CSF receptor in human monocytes: evidence for ectodomain shedding of the cell surface GM-CSF receptor alpha subunit. J Immunol. 169, 5679-5688 (2002).
- Iizuka, M. Production of a recombinant mouse monoclonal antibody in transgenic silkworm cocoons. FEBS J. 276, 5806-5820 (2009).
- Iizuka, M., Tomita, M., Shimizu, K., Kikuchi, Y., Yoshizato, K. Translational enhancement of recombinant protein synthesis in transgenic silkworms by a 5'-untranslated region of polyhedrin gene of Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus. J Biosci Bioeng. 105, 595-603 (2008).
- Zou, W., Ueda, M., Yamanaka, H., Tanaka, A. Construction of a combinatorial protein library displayed on yeast cell surface using DNA random priming method. J Biosci Bioeng. 92, 393-396 (2001).
- Tamura, T. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat Biotechnol. 18, 81-84 (2000).
- Tomita, M. Transgenic silkworms produce recombinant human type III procollagen in cocoons. Nat Biotechnol. 21, 52-56 (2003).
- Ogawa, S., Tomita, M., Shimizu, K., Yoshizato, K. Generation of a transgenic silkworm that secretes recombinant proteins in the sericin layer of cocoon: production of recombinant human serum albumin. J Biotechnol. 128, 531-544 (2007).
- Tomita, M. A germline transgenic silkworm that secretes recombinant proteins in the sericin layer of cocoon. Transgenic Res. 16, 449-465 (2007).
- Kitamura, T. Idiopathic pulmonary alveolar proteinosis as an autoimmune disease with neutralizing antibody against granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 190, 875-880 (1999).
- Tanaka, N. Lungs of patients with idiopathic pulmonary alveolar proteinosis express a factor which neutralizes granulocyte-macrophage colony stimulating factor. FEBS Lett. 442, 246-250 (1999).
- Brown, C., Pihl, C., Murray, E. Oligomerization of the soluble granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor: identification of the functional ligand-binding species. Cytokine. 9, 219-225 (1997).
- Urano, S. A cell-free assay to estimate the neutralizing capacity of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor autoantibodies. J Immunol Methods. 360, 141-148 (2010).
- Hayashida, K. Molecular cloning of a second subunit of the receptor for human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF): reconstitution of a high-affinity GM-CSF receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9655-9659 (1990).
- Hansen, G. The structure of the GM-CSF receptor complex reveals a distinct mode of cytokine receptor activation. Cell. 134, 496-507 (2008).
