Summary
We ontwierpen een cel-vrije receptor binding assay om de binding van granulocyt-macrofaag kolonie-stimulerende factor (GM-CSF) te schatten aan de receptoren. Het stelt ons in staat te evalueren competitieve remming van gebiotinyleerd GM-CSF binding aan oplosbare GM-CSF receptor alfa door GM-CSF autoantilichaam met uitstekende reproduceerbaarheid.
Abstract
ACHTERGRONDEN: Eerder hebben we aangetoond dat het neutraliseren van capaciteit, maar niet de concentratie van GM-CSF autoantilichaam was gecorreleerd met de ernst van de ziekte bij patiënten met auto pulmonale alveolaire proteïnose (PAP) 1-3. Als intrekking van GM-CSF bioactiviteit in de longen is de waarschijnlijke oorzaak voor auto-PAP 4,5, is het belooft de neutraliserende capaciteit van GM-CSF autoantilichamen maat voor het evalueren van de ernst van de ziekte in elke patiënt met PAP.
Tot nu toe is het neutraliseren van de capaciteit van GM-CSF autoantilichamen is beoordeeld door het evalueren van de groeiremming van menselijke beenmergcellen of TF-1 cellen gestimuleerd met GM-CSF 6-8. In de bioassay-systeem, is het echter vaak problematisch om betrouwbare gegevens en de gegevens te vergelijken van verschillende laboratoria, als gevolg van de technische problemen bij het handhaven van de cellen in een constante toestand.
DOELSTELLING: Het GM-CSF na te bootsen binding aan GM-CSF-receptor op het celoppervlak behulp van cel-vrije receptor-bindende-assay.
METHODEN: Transgene zijderups techniek was toegepast voor het verkrijgen van een groot bedrag voor recombinant oplosbaar GM-CSF receptor alpha (sGMRα) met een hoge zuiverheid 9-13. Het recombinante sGMRα werd opgenomen in de hydrofiele sericine lagen van de zijden draden zonder gefuseerd aan de zijde proteïnen, en dus kunnen we gemakkelijk van de cocons in goede zuiverheid extract met een neutrale waterige oplossingen 14,15. Gelukkig is de oligosaccharide structuren, die kritisch zijn voor de binding met GM-CSF, zijn meer vergelijkbaar met de structuur van de menselijke sGMRα dan die welke door andere insecten of gisten.
Resultaten: De cel-vrije assay systeem met behulp van sGMRα leverde de gegevens met hoge plasticiteit en betrouwbaarheid. GM-CSF binding aan sGMRα was dosis-afhankelijk geremd door polyklonaal GM-CSF autoantilichaam op een vergelijkbare manier aan de bioassay met behulp van TF-1-cellen, wat aangeeft dat onze nieuwe cel-vrije assay systeem met behulp van sGMRα is nuttiger voor het meten van neutraliserende activiteit van GM-CSF autoantilichamen dan de biologische systeem met behulp van TF-1 cel of een menselijke beenmergcellen.
Conclusies: We hebben een celvrije assay het kwantificeren van de neutraliserende capaciteit van GM-CSF autoantilichaam.
Protocol
1. Productie en zuivering van sGMRα
- Amplify cDNA van sGMRα uit menselijke placenta cDNA-bibliotheek van polymerase chain reaction (PCR).
- Voeg 50 base 5'-UTR volgorde van baculovirus polyhedrine-end en 27 voet codering RGS His-tag aan het 3 'einde van de PCR-amplicon door een andere PCR.
- Plaats de geamplificeerde PCR-product in een plasmide pMSG1.1MG.
- Injecteer het construct psGMR/M1.1MG met de helper vector pHA3PIG in eieren van zijderupsen PND-w1 stam.
- De achterzijde van de uitgekomen larven G0 te motten bij 25 ° C. Scherm G1 embryo's verkregen door voortplanting tussen broers en zussen of met PND-w1 voor MGFP uitdrukking in de ogen te verkrijgen transgene zijderupsen met het sGMRα gen.
- Extract recombinant sGMRα uit de cocons van transgene zijderupsen met fosfaat-buffer met 500mm NaCl toe en roer bij 4 ° C voor 24 uur.
- Centrifugeer monster op 20000 g voor 15 min tot verwijderen van een neerslag.
- Van toepassing supernatant aan een nikkel-affiniteitskolom.
- Was de kolom met 10mm imidazol, 500mm en 20mm NaCl Natriumfosfaat, pH6.3, en elueren met een lineaire gradiënt van imidazool van 10mm tot 250mm. Zwembad de fracties die het gezuiverde sGMRα en dialyze tegen fosfaat-gebufferde zoutoplossing (pH 7,4) (PBS).
2. Biotinylatie van recombinant GM-CSF
- Verwijder sorbitol voorbereiding door dialyse tegen PBS.
- Voeg 1 ml van 20mm koude natrium meta-perjodaat oplossing bij 4 ° C aan de oplossing op het ijs.
- Incubeer het monster voor 30min op het ijs in het donker.
- Voeg glycerol aan de oplossing bij een uiteindelijke concentratie van 15 mm.
- Dialyze de oplossing tegen 100mm natriumacetaat buffer (pH 5,5)
- Voeg biotine hydrazide aan de oplossing bij een uiteindelijke concentratie van 5mm en voortdurend roeren de oplossing voor 2 uur bij kamertemperatuur.
- Verwijder de niet-gereageerde stof door dialyse tegen PBS, pH 7,4.
3. Een cel-vrije GM-CSF receptor-ligand-binding assay
- Coat een microtiterplaat met 50μl van monoklonale anti-polyhistidine antilichaam overnacht bij 4 ° C.
- Was vijf keer met 500μl van PBST.
- Voeg 100μl van een blokkerende oplossing en incubeer gedurende 3 uur bij 4 ° C.
- Was vijf keer met 500μl van PBST.
- Voeg 50μl van sGMRα in de blokkering oplossing en incubeer overnacht bij 4 ° C.
- Was vijf keer met 500μl van PBST.
- Voeg 25μl van de monsters met GM-CSF autoantilichaam en dan 25μl van gebiotinyleerd GM-CSF. Incubeer 1 uur bij 4 ° C tot sGMRα-GM-CSF complex te vormen.
- Was vijf keer met 500μl van PBST.
- Voeg 50μl van 0,4 mm streptavidine alkalische fosfatase voor een uur bij 4 ° C om de gebiotinyleerde GM-CSF gebonden sGMRα detecteren.
- Was vijf keer met 500μl van PBST.
- Voeg 50μl van een chemiluminescent substraat aan de oplossing en geïncubeerd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Met behulp van een chemiluminescentie plaat lezer, op te sporen de chemiluminescentie activiteit.
4. Representatieve resultaten:
De eerste stap in de GM-CSF receptor signaaltransductie route is de binding van GM-CSF aan GM-CSF receptor alpha op het celoppervlak. Omdat GM-CSF autoantilichaam specifiek bindt GM-CSF en blokkeren de binding aan de receptor in vitro 16,17, hebben we de hypothese dat de auto-antistoffen deze eerste reactie van rechtstreeks bindend in GM-CSF te remmen. Zoals eerder beschreven (Ref. 9-15), passen we transgene zijderups technologie om een grote hoeveelheid recombinant sGMRα te verkrijgen met een hoge zuiverheid.
Als de zijderups-afgeleide recombinant sGMRα werd geladen op SDS-PAGE onder niet-reducerende omstandigheden, het sGMRα toonde zowel monomere (45 kDa) en dimere (90 kDa) vormen, terwijl slechts de monomere vorm werd ontdekt onder reducerende omstandigheden (Figuur 1B) , wat aangeeft dat het recombinante sGMRα was een mengsel van monomeren en disulfide-linked dimmers 18.
Met behulp van de cel-free-systeem (Fig. 2A), hebben we de remming van GM-CSF binding aan sGMRα door GM-CSF autoantilichamen (Fig. 2B en Fig. 2C). Deze methoden werden beschreven in referentie 19 door Urano et al.. De groeiremming was nauw gecorreleerd met de binding inhibitie (r = 0,988, p = 0,002) bij verschillende concentraties van de GM-CSF autoantilichaam (Fig. 3A) 19. Ook was de bindende remming significant gecorreleerd met de groei-inhibitie. De binding remming verhoogd in een dosis-afhankelijke manier door GM-CSF autoantilichamen (Fig. 3B) 19. Deze twee parameters voor de serum IgG fracties van verschillende patiënten werden gecorreleerd met elkaar (r = 0,589 p = 0,006, Fig. 3C). Niet bindend, noch inhibitie remming van de groei gecorreleerd met Kd-waarden, en dus beide parameters werden niet beïnvloed door bindingsaffiniteit 19. Bijgevolg reproduceerbaarheid van gegevens tussen binding en gROEI remming verkregen door middel van drie onafhankelijke experimenten op drie verschillende monsters werd geëvalueerd. De variatiecoëfficiënt gaf aan dat de cel-vrij systeem is meer goed dan die van bioassay (tabel 1).
Figuur 1. Stroomschema van de procedure voor de productie van sGMRα met behulp van transgene zijderupsen. A) Structuren van de transformatievectoren 9-11. B) SDS-PAGE en Coomassie Brilliant Blue-kleuring van het gezuiverde sGMRα onder reducerende en niet-reducerende omstandigheden. sGMRα, oplosbare GM-CSF-receptor alfa; MGFP, monster groen fluorescerend eiwit; BmNPVpol5'-UTR, 5'-onvertaalde gebied volgorde van de Bombyx mori nucleaire polyhedrosis virus polyhedrine-, SV40 polyA, SV40 polyA signaalsequentie; P 3xP3, 3xP3 promotor; P ser1, ser1 promotor; FiBL polyA, fibroin L-keten polyA signaalsequentie, HR3, Bombyx mori nucleaire polyhedrosis virus HR3 enhancer.
Figuur 2. Schema van de cel-vrije assay systeem. A) Een concurrerende bindingstest met behulp van sGMRα geproduceerd door zijderups. B) Effect van neutraliserende en niet-neutraliserende antilichamen op de binding remming door cel-vrij systeem. C) Het verschil van de binding remming tussen de verschillende concentraties van neutraliserende antilichamen en niet-neutraliserende antilichamen. GM-CSF, granulocyt-macrofaag kolonie-stimulerende factor, sGMRα, oplosbare GM-CSF-receptor alpha, Zijn, RGS-His-tag, AP, alkalische fosfatase.
Figuur 3. GM-CSF binding remming om sGMRα door de effecten van GM-CSF polyklonale antilichamen of het serum IgG fracties van patiënten met een auto-PAP. A) Relatie tussen bindende inhibitie en groeiremming door GM-CSF autoantilichaam. B) Bindende remming bij verschillende concentraties van GM-CSF autoantilichaam. C) Relatie tussen de IC 50 voor procent binding remming en het percentage remming van de groei van het serum IgG fracties 19. IC 50, 50% remmende concentratie, GM-CSF, granulocyt-macrofaag kolonie-stimulerende factor.
| Monster | Een | B | C |
| Inter-assay | |||
| # Van de vaststellingen | 3 | 3 | 3 |
| Gemiddelde waarde (% binding remming) | 61,6 | 63,8 | 69,7 |
| Gemiddelde waarde (% groeiremming) | 21,0 | 73,4 | 82,8 |
| Coëfficiënt van variatie (%) (% binding remming) | 6.0 | 5.6 | 8.3 |
| Coëfficiënt van variatie (%) (% groeiremming) | 64,4 | 18,3 | 10,4 |
Beide testen werden uitgevoerd op 5 ng / ml van GM-CSF en een concentratie die gelijk is aan GM-CSF autoantilichaam.
Tabel 1. Vergelijking van de coëfficiënt van de variaties tussen procent binding en groei remmingen verkregen door middel van drie onafhankelijke experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De cel-vrije assay schatting gemaakt van de neutraliserende capaciteit van GM-CSF auto-antilichamen met een uitstekende reproduceerbaarheid en snelheid. De bindende remming door GM-CSF autoantilichamen of de patiënt serum IgG fracties werd geëvalueerd door deze test. Uit de gegevens bleek een correlatie tussen de binding inhibitie van de cel-vrije test en de groeiremming van een bioassay met behulp van TF-1 cellen, respectievelijk. De bioassay is op grote schaal gebruikt, maar koesterde moeilijkheden bij het vergelijken van gegevens tussen de verschillende faciliteiten en verschillende tijdstippen, die we kunnen vermijden door het gebruik van dit nieuwe systeem.
GM-CSF bindt aan sGMRα met een lage affiniteit en vormen een binaire complex 20. Recente studies hebben aangetoond dat de menselijke GM-CSF bindt aan GM-CSF receptor alfa en GM-CSF receptor beta vorming van een dodecameer complex met hoge affiniteit op het celoppervlak 21. Zo zou een test systeem op basis van ternaire complexen bestaande uit monomere GM-CSF receptor alfa en dimeer GM-CSF receptor beta worden een toekomstige kandidaat-systeem om de celvrije assay te verbeteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We zijn erg dankbaar K. Nakagaki, dr. H. Ishii, dr. K. Suzuki, A. Yamagata, K. Oofusa voor hun waardevolle bijdragen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| human placenta cDNA library | Takara | ||
| Nickel affinity column | GE Healthcare | 17-5247-01 | |
| biotin hydrazide (EZ-Link Biotin Hydrazide) | PIERCE | 21339 | |
| rhGM-CSF (leukine) | Genzyme Corporation | ||
| Nunc Immobilizer Amino | Nalge Nunc International | 436007 | |
| Monoclonal Anti-polyHistidine antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | H1029 | 0.2ml |
| blocking solution (StabilCoat) | Surmodics | SC01-1000 | 1000ml |
| ZyMAX Streptavidin-AP Conjugate | Invitrogen | 43-8322 | |
| CDP-Star Ready-to-Use With Sapphire-II | Applied Biosystems | T2214 | |
| chemiluminescence plate reader | BERTHOLD TECHNOLOGIES | TriStar LB 941 |
References
- Arai, T. Serum neutralizing capacity of GM-CSF reflects disease severity in a patient with pulmonary alveolar proteinosis successfully treated with inhaled GM-CSF. Respir Med. 98, 1227-1230 (2004).
- Tazawa, R. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and lung immunity in pulmonary alveolar proteinosis. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1142-1149 (2005).
- Inoue, Y. Characteristics of a large cohort of patients with autoimmune pulmonary alveolar proteinosis in Japan. Am J Respir Crit Care Med. 177, 752-762 (2008).
- Uchida, K. High-affinity autoantibodies specifically eliminate granulocyte-macrophage colony-stimulating factor activity in the lungs of patients with idiopathic pulmonary alveolar proteinosis. Blood. 103, 1089-1098 (2004).
- Sakagami, T. Human GM-CSF autoantibodies and reproduction of pulmonary alveolar proteinosis. N Engl J Med. 361, 2679-2681 (2009).
- Raines, M. Identification and molecular cloning of a soluble human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 8203-8207 (1991).
- Williams, W., VonFeldt, J., Rosenbaum, H., Ugen, K., Weiner, D. Molecular cloning of a soluble form of the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor alpha chain from a myelomonocytic cell line. Expression, biologic activity, and preliminary analysis of transcript distribution. Arthritis Rheum. 37, 1468-1478 (1994).
- Prevost, J. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and inflammatory stimuli up-regulate secretion of the soluble GM-CSF receptor in human monocytes: evidence for ectodomain shedding of the cell surface GM-CSF receptor alpha subunit. J Immunol. 169, 5679-5688 (2002).
- Iizuka, M. Production of a recombinant mouse monoclonal antibody in transgenic silkworm cocoons. FEBS J. 276, 5806-5820 (2009).
- Iizuka, M., Tomita, M., Shimizu, K., Kikuchi, Y., Yoshizato, K. Translational enhancement of recombinant protein synthesis in transgenic silkworms by a 5'-untranslated region of polyhedrin gene of Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus. J Biosci Bioeng. 105, 595-603 (2008).
- Zou, W., Ueda, M., Yamanaka, H., Tanaka, A. Construction of a combinatorial protein library displayed on yeast cell surface using DNA random priming method. J Biosci Bioeng. 92, 393-396 (2001).
- Tamura, T. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat Biotechnol. 18, 81-84 (2000).
- Tomita, M. Transgenic silkworms produce recombinant human type III procollagen in cocoons. Nat Biotechnol. 21, 52-56 (2003).
- Ogawa, S., Tomita, M., Shimizu, K., Yoshizato, K. Generation of a transgenic silkworm that secretes recombinant proteins in the sericin layer of cocoon: production of recombinant human serum albumin. J Biotechnol. 128, 531-544 (2007).
- Tomita, M. A germline transgenic silkworm that secretes recombinant proteins in the sericin layer of cocoon. Transgenic Res. 16, 449-465 (2007).
- Kitamura, T. Idiopathic pulmonary alveolar proteinosis as an autoimmune disease with neutralizing antibody against granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 190, 875-880 (1999).
- Tanaka, N. Lungs of patients with idiopathic pulmonary alveolar proteinosis express a factor which neutralizes granulocyte-macrophage colony stimulating factor. FEBS Lett. 442, 246-250 (1999).
- Brown, C., Pihl, C., Murray, E. Oligomerization of the soluble granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor: identification of the functional ligand-binding species. Cytokine. 9, 219-225 (1997).
- Urano, S. A cell-free assay to estimate the neutralizing capacity of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor autoantibodies. J Immunol Methods. 360, 141-148 (2010).
- Hayashida, K. Molecular cloning of a second subunit of the receptor for human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF): reconstitution of a high-affinity GM-CSF receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9655-9659 (1990).
- Hansen, G. The structure of the GM-CSF receptor complex reveals a distinct mode of cytokine receptor activation. Cell. 134, 496-507 (2008).
