Summary
Vi konstruerade en cell utan receptorbindning analys för att uppskatta bindningen av granulocyt-makrofag kolonistimulerande faktor (GM-CSF) till receptorer. Det ger oss möjlighet att utvärdera kompetitiv hämning av biotinylerad GM-CSF bindning till lösliga GM-CSF receptor alpha av GM-CSF autoantikroppar med utmärkt reproducerbarhet.
Abstract
Bakgrund: Tidigare visade vi att neutraliserande förmåga, men inte den koncentration av GM-CSF autoantikroppar var korrelerad med sjukdomens svårighetsgrad hos patienter med autoimmun pulmonell alveolär proteinosis (PAP) 1-3. Eftersom upphävandet av GM-CSF bioaktivitet i lungan är den troliga orsaken till autoimmuna PAP 4,5, det är lovande att mäta neutraliserande förmåga GM-CSF autoantikroppar för utvärdering av sjukdomens svårighetsgrad hos varje patient med PAP.
Hittills har neutraliserande förmåga GM-CSF autoantikroppar bedömts genom att utvärdera tillväxthämning av mänskliga benmärgsceller eller TF-1 celler stimuleras med GM-CSF 6-8. I bioassay systemet, dock är det ofta problematiskt att få tillförlitliga data samt att jämföra data från olika laboratorier, på grund av tekniska svårigheter att upprätthålla celler i ett konstant tillstånd.
Syfte: Att imitera GM-CSF bindning till GM-CSF receptor på cellens yta med hjälp av cellfria receptor-bindande-analys.
METODER: Transgenic silkesodlingssektorn teknik har tillämpats för att få en stor summa för rekombinanta lösliga GM-CSF receptor alfa (sGMRα) med hög renhet 9-13. Den rekombinanta sGMRα fanns i den hydrofila sericin lager av siden trådar utan att bli smält i siden proteiner, och därmed kan vi enkelt utdrag ur kokonger i god renhet med neutrala vattenlösningar 14,15. Lyckligtvis oligosackarid strukturer, som är avgörande för bindning med GM-CSF, är mer lik den struktur av mänskliga sGMRα än de som produceras av andra insekter eller jäst.
RESULTAT: Den cellfria analyssystem med sGMRα gav data med hög plasticitet och tillförlitlighet. GM-CSF bindning till sGMRα var dosberoende hämmas av polyklonal GM-CSF autoantikroppar på ett liknande sätt som det biologiska testet med TF-1 celler, vilket tyder på att vår nya cellfria analyssystem med sGMRα är mer användbart för mätning av neutraliserande aktivitet av GM-CSF autoantikroppar än bioassay systemet med TF-1 celler eller mänskliga benmärgsceller.
SLUTSATSER: Vi etablerade en cell utan analysen kvantifiera neutraliserande förmåga GM-CSF autoantikroppar.
Protocol
1. Produktion och rening av sGMRα
- Förstärk cDNA av sGMRα från mänsklig placenta cDNA bibliotek genom polymeraskedjereaktion (PCR).
- Lägg till 50 bas-5'-UTR sekvens av baculovirus polyhedrin slutet och 27 bas kodning RGS Hans-taggen till 3 "slut på PCR amplicon av en annan PCR.
- Sätt förstärkta PCR-produkten i en plasmid pMSG1.1MG.
- Injicera konstruera psGMR/M1.1MG med hjälpare vektorn pHA3PIG in ägg silkesfjärilsägg PND-W1 stam.
- Bakre de kläckts G0 larverna till fjärilar vid 25 ° C. Screen G1 embryon som erhållits genom parning mellan syskon eller med PND-W1 för MGFP uttryck i ögonen för att erhålla transgena silkesmaskar som bär sGMRα genen.
- Utdrag rekombinant sGMRα från kokonger av transgena silkesmaskar med fosfat-buffert som innehåller 500mm NaCl och rör vid 4 ° C i 24h.
- Centrifugera provet vid 20000 g för 15min att ta bort ett utfällningar.
- Applicera supernatanten till ett nickel affinitet kolumn.
- Tvätta kolonnen med 10 mM imidazol, 500mm NaCl och 20mm natriumfosfat, pH6.3 och eluera med en linjär lutning imidazol från 10mm till 250mm. Pool de fraktioner som innehåller renade sGMRα och dialyze mot fosfatbuffrad koksaltlösning (pH7.4) (PBS).
2. Biotinylation av rekombinant GM-CSF
- Ta bort sorbitol beredningen av dialys mot PBS.
- Tillsätt 1 ml 20mm kall natrium meta-periodate lösning vid 4 ° C till lösningen på is.
- Inkubera provet för 30min på is i mörkret.
- Tillsätt glycerol till lösning vid en slutlig koncentration av 15 mm.
- Dialyze lösningen mot 100mm natriumacetat buffert (pH5.5)
- Lägg biotin hydrazid till lösning vid en slutlig koncentration av 5mm och kontinuerligt agitera lösningen för 2h i rumstemperatur.
- Ta bort icke-reagerade material med dialys mot PBS, pH7.4.
3. En cell-fri GM-CSF receptor-ligand-bindande analys
- Coat en mikrotiterplatta med 50μl av monoklonala anti-polyHistidine antikroppar över natten vid 4 ° C.
- Tvätta fem gånger med 500μl av PBST.
- Tillsätt 100μl av en blockerande lösningen och inkubera i 3h vid 4 ° C.
- Tvätta fem gånger med 500μl av PBST.
- Tillsätt 50μl av sGMRα i den blockerande lösningen och inkubera över natten vid 4 ° C.
- Tvätta fem gånger med 500μl av PBST.
- Tillsätt 25μl av de prover som innehåller GM-CSF autoantikroppar och sedan 25μl av biotinylerad GM-CSF. Inkubera 1 timme vid 4 ° C för att bilda sGMRα-GM-CSF komplex.
- Tvätta fem gånger med 500μl av PBST.
- Tillsätt 50μl av 0,4 mm streptavidin alkaliska fosfataser i 1 timme vid 4 ° C för att upptäcka biotinylerad GM-CSF bunden sGMRα.
- Tvätta fem gånger med 500μl av PBST.
- Tillsätt 50μl av en kemiluminiscent substrat till lösningen och inkuberas i 1 timme i rumstemperatur.
- Med hjälp av en kemiluminiscens plattläsaren, upptäcka kemiluminiscens aktivitet.
4. Representativa resultat:
Det första steget i GM-CSF receptor signaltransduktion vägen är bindningen av GM-CSF för att GM-CSF receptor alpha på cellytan. Eftersom GM-CSF autoantikroppar specifikt binder GM-CSF och blockera dess bindning till receptorn in vitro 16,17, hypotes vi att autoantikroppar hämmar detta första reaktion genom att direkt binda till GM-CSF. Som tidigare beskrivits (ref. 9-15), tillämpade vi transgena silkesodlingssektorn teknik för att få en stor mängd rekombinant sGMRα med hög renhet.
När silkesmasken som härrör från rekombinant sGMRα lastades på SDS-PAGE under icke-reducerande förhållanden visade sGMRα både monomera (45 kDa) och dimeriskt (90 kDa) former, medan endast den monomera formen upptäcktes i reducerande miljö (Figur 1B) , vilket visar att den rekombinanta sGMRα var en blandning av monomerer och disulfide sammankopplade dimmers 18.
Använda cellfria system (Fig. 2A), utvärderade vi hämning av GM-CSF bindning till sGMRα av GM-CSF autoantikroppar (Fig. 2B och figur. 2C). Dessa metoder har beskrivits i referens 19 av Urano et al. Den tillväxthämning var nära korrelerad med bindande inhibition (r = 0,988, p = 0,002) vid olika koncentrationer av GM-CSF autoantikroppar (Fig. 3A) 19. På samma sätt var bindande hämning signifikant korrelerad med tillväxthämning. Det bindande hämning ökade i ett dosberoende sätt med GM-CSF autoantikroppar (Fig. 3B) 19. Dessa två parametrar för serum IgG-fraktioner från olika patienter korrelerade med varandra (r = 0,589 p = 0,006, bild. 3C). Varken bindande hämning eller tillväxthämning korrelerade med Kd-värden, och därmed var båda parametrar opåverkade av bindningsaffinitet 19. Följaktligen reproducerbarhet av data mellan bindande och growth hämning erhållits genom tre oberoende försök på tre olika prover har utvärderats. Variationskoefficienten visade att cellfria systemet var mer bra än bioassay (tabell 1).
Figur 1. Flödesschema av förfarandet för produktion av sGMRα använda transgena silkesmaskar. A) Strukturer av omvandlingen vektorer 9-11. B) SDS-PAGE och Coomassie Brilliant Blue-färgning av det renade sGMRα i att minska och icke-reducerande förhållanden. sGMRα, lösliga GM-CSF receptor alpha, MGFP, monster grönt fluorescerande proteinet, BmNPVpol5'-UTR, 5'-oöversatta regionen sekvens av Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus polyhedrin, SV40 Polya, SV40 Polya signalsekvensen, P 3xP3, 3xP3 promotor, P ser1, ser1 promotor, FiBL Polya, fibroin L-kedjan Polya signalsekvensen, HR3, Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus HR3 förstärkare.
Figur 2. Omfattats av cellfria analyssystem. A) Ett konkurrenskraftigt bindande analysen med sGMRα producerats av silkesmaskar. B) Effekt av neutraliserande och icke-neutraliserande antikroppar på bindande hämning av cellfria system. C) Skillnaden av bindande hämning mellan olika koncentrationer av neutraliserande antikroppar och icke-neutraliserande antikroppar. GM-CSF, granulocyt-makrofag kolonistimulerande faktor, sGMRα, lösligt GM-CSF receptor alpha, Hans, RGS-His-taggen, AP, alkaliska fosfataser.
Figur 3. GM-CSF bindande hämning till sGMRα av effekten av GM-CSF polyklonala antikroppar eller serum IgG-fraktioner från patienter med autoimmun PAP. A) Förhållandet mellan bindande hämning och tillväxthämning av GM-CSF autoantikroppar. B) Bindande hämning vid olika koncentrationer av GM-CSF autoantikroppar. C) Förhållandet mellan IC 50 för procent bindande hämning procent tillväxthämning av serum IgG-fraktioner 19. IC 50, 50% hämmande koncentration, GM-CSF, granulocyt-makrofag kolonistimulerande faktor.
| Exempel på | En | B | C |
| Inter-analys | |||
| # Bestämningar | 3 | 3 | 3 |
| Medelvärde (% bindande hämning) | 61,6 | 63,8 | 69,7 |
| Medelvärde (% tillväxthämning) | 21,0 | 73,4 | 82,8 |
| Variationskoefficient (%) (% bindande hämning) | 6,0 | 5,6 | 8,3 |
| Variationskoefficient (%) (% tillväxthämning) | 64,4 | 18,3 | 10,4 |
Båda analyserna har utförts vid 5 ng / ml av GM-CSF och en koncentration lika med GM-CSF autoantikroppar.
Tabell 1. Jämförelse av koefficienten variationer procent bindande och hämningar tillväxt uppnås genom tre oberoende försök.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den cellfria analysen uppskattade neutraliserande förmåga GM-CSF autoantikroppar med utmärkt reproducerbarhet och snabbhet. Det bindande hämning av GM-CSF autoantikroppar eller patientens serum IgG fraktioner utvärderades av denna analys. De data som visade ett samband mellan den bindande hämning av cellfria assay och tillväxthämning av biologiska testsystem med TF-1 celler, respektive. Den bioassay har i stor utsträckning utnyttjats, men hyste svårt att jämföra data mellan olika anläggningar och olika punkter tid, som vi kan undvika genom att använda det nya systemet.
GM-CSF binder till sGMRα med låg affinitet och bilda en binär komplex 20. Nyligen genomförda studier har visat att det mänskliga GM-CSF binder till GM-CSF receptor alfa och GM-CSF receptor beta bildar ett dodecameric komplex med hög affinitet på cellytan 21. Således skulle en analys baserat på ternära komplex bestående av monomer GM-CSF receptor alfa och dimeriskt GM-CSF receptor beta vara en framtida kandidat för att förbättra cellfria analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi är mycket tacksamma till K. Nakagaki, Dr H. Ishii, Dr K. Suzuki, A. Yamagata, K. Oofusa för deras värdefulla bidrag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| human placenta cDNA library | Takara | ||
| Nickel affinity column | GE Healthcare | 17-5247-01 | |
| biotin hydrazide (EZ-Link Biotin Hydrazide) | PIERCE | 21339 | |
| rhGM-CSF (leukine) | Genzyme Corporation | ||
| Nunc Immobilizer Amino | Nalge Nunc International | 436007 | |
| Monoclonal Anti-polyHistidine antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | H1029 | 0.2ml |
| blocking solution (StabilCoat) | Surmodics | SC01-1000 | 1000ml |
| ZyMAX Streptavidin-AP Conjugate | Invitrogen | 43-8322 | |
| CDP-Star Ready-to-Use With Sapphire-II | Applied Biosystems | T2214 | |
| chemiluminescence plate reader | BERTHOLD TECHNOLOGIES | TriStar LB 941 |
References
- Arai, T. Serum neutralizing capacity of GM-CSF reflects disease severity in a patient with pulmonary alveolar proteinosis successfully treated with inhaled GM-CSF. Respir Med. 98, 1227-1230 (2004).
- Tazawa, R. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and lung immunity in pulmonary alveolar proteinosis. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1142-1149 (2005).
- Inoue, Y. Characteristics of a large cohort of patients with autoimmune pulmonary alveolar proteinosis in Japan. Am J Respir Crit Care Med. 177, 752-762 (2008).
- Uchida, K. High-affinity autoantibodies specifically eliminate granulocyte-macrophage colony-stimulating factor activity in the lungs of patients with idiopathic pulmonary alveolar proteinosis. Blood. 103, 1089-1098 (2004).
- Sakagami, T. Human GM-CSF autoantibodies and reproduction of pulmonary alveolar proteinosis. N Engl J Med. 361, 2679-2681 (2009).
- Raines, M. Identification and molecular cloning of a soluble human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 8203-8207 (1991).
- Williams, W., VonFeldt, J., Rosenbaum, H., Ugen, K., Weiner, D. Molecular cloning of a soluble form of the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor alpha chain from a myelomonocytic cell line. Expression, biologic activity, and preliminary analysis of transcript distribution. Arthritis Rheum. 37, 1468-1478 (1994).
- Prevost, J. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and inflammatory stimuli up-regulate secretion of the soluble GM-CSF receptor in human monocytes: evidence for ectodomain shedding of the cell surface GM-CSF receptor alpha subunit. J Immunol. 169, 5679-5688 (2002).
- Iizuka, M. Production of a recombinant mouse monoclonal antibody in transgenic silkworm cocoons. FEBS J. 276, 5806-5820 (2009).
- Iizuka, M., Tomita, M., Shimizu, K., Kikuchi, Y., Yoshizato, K. Translational enhancement of recombinant protein synthesis in transgenic silkworms by a 5'-untranslated region of polyhedrin gene of Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus. J Biosci Bioeng. 105, 595-603 (2008).
- Zou, W., Ueda, M., Yamanaka, H., Tanaka, A. Construction of a combinatorial protein library displayed on yeast cell surface using DNA random priming method. J Biosci Bioeng. 92, 393-396 (2001).
- Tamura, T. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat Biotechnol. 18, 81-84 (2000).
- Tomita, M. Transgenic silkworms produce recombinant human type III procollagen in cocoons. Nat Biotechnol. 21, 52-56 (2003).
- Ogawa, S., Tomita, M., Shimizu, K., Yoshizato, K. Generation of a transgenic silkworm that secretes recombinant proteins in the sericin layer of cocoon: production of recombinant human serum albumin. J Biotechnol. 128, 531-544 (2007).
- Tomita, M. A germline transgenic silkworm that secretes recombinant proteins in the sericin layer of cocoon. Transgenic Res. 16, 449-465 (2007).
- Kitamura, T. Idiopathic pulmonary alveolar proteinosis as an autoimmune disease with neutralizing antibody against granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 190, 875-880 (1999).
- Tanaka, N. Lungs of patients with idiopathic pulmonary alveolar proteinosis express a factor which neutralizes granulocyte-macrophage colony stimulating factor. FEBS Lett. 442, 246-250 (1999).
- Brown, C., Pihl, C., Murray, E. Oligomerization of the soluble granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor: identification of the functional ligand-binding species. Cytokine. 9, 219-225 (1997).
- Urano, S. A cell-free assay to estimate the neutralizing capacity of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor autoantibodies. J Immunol Methods. 360, 141-148 (2010).
- Hayashida, K. Molecular cloning of a second subunit of the receptor for human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF): reconstitution of a high-affinity GM-CSF receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9655-9659 (1990).
- Hansen, G. The structure of the GM-CSF receptor complex reveals a distinct mode of cytokine receptor activation. Cell. 134, 496-507 (2008).
