Summary
我们设计了一个无细胞受体结合实验，以估计约束力的粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子（GM - CSF的）受体。它使我们能够评估竞争性抑制GM - CSF的抗体生物素标记的GM - CSF的可溶性GM - CSF受体α的结合，具有优良的重现性。
Abstract
背景：在此之前，我们表明，中和能力，但没有GM - CSF的抗体浓度是在患者自身免疫性肺泡蛋白沉积症（PAP）的1-3疾病的严重程度相关。废止的GM - CSF在肺癌的生物活性可能导致自身免疫性PAP 的 4,5，它是有前途的GM - CSF自身抗体的中和能力的评估与人民行动党在每个病人的病情轻重程度来衡量。
到现在为止，已评定的GM - CSF自身抗体的中和能力评估人类骨髓细胞或TF - 1 细胞 6-8与GM - CSF的刺激的生长抑制。然而，在生物测定系统，它往往是问题，以获得可靠的数据，以及比较来自不同实验室的数据，由于技术上的困难，保持在一个恒定的条件下的细胞。
目的：为了模仿GM - CSF，GM - CSF受体细胞表面上的具有约束力的使用无细胞受体结合测定。
方法：转基因家蚕技术是获得高纯度9-13的重组可溶性GM - CSF受体α（sGMRα）为大量的应用。重组sGMRα载而不融合丝蛋白在亲水丝胶丝线层，因此，我们可以很容易地从良好的纯度蚕茧14,15与中性水溶液中提取。幸运的是，寡糖的结构，这是与GM - CSF结合的关键，更类似于人类sGMRα的结构比其他昆虫或酵母生产。
结果：无细胞检测系统使用sGMRα取得的数据，具有很高的可塑性和可靠性。 GM - CSF的剂量依赖性绑定sGMRα以类似的方式使用TF - 1细胞的生物活性，抑制多克隆GM - CSF的抗体，这表明我们的新的无细胞检测系统使用sGMRα是中和活性的测量更为有用GM - CSF的自身抗体比使用TF - 1细胞或骨髓细胞的生物测定系统。
结论：我们建立了无细胞的检测，量化的GM - CSF抗体的中和能力。
Protocol
1。生产和净化的sGMRα
- 从人胎盘cDNA文库中扩增cDNA的聚合酶链反应（PCR）的sGMRα。
- 50基地5' - UTR序列杆状病毒多角月底和27基编码的RGS His - tag的3'末端的另一个PCR扩增PCR扩增。
- 插入质粒pMSG1.1MG的扩增的PCR产物。
- 注入鸡蛋蚕PND - W1株pHA3PIG助手载体的建设psGMR/M1.1MG。
- 后部孵化G0期幼虫蛾25 ° C。 G1的屏幕获得通过交配，兄弟姐妹之间或与PND - W1在眼里MGFP表达，获得转基因蚕轴承sGMRα基因的胚胎。
- 从转基因蚕的蚕茧中提取重组sGMRα与含有500MM氯化钠的磷酸盐缓冲和搅拌在4 ° 24小时的彗星。
- 20000克为15分钟离心样品删除沉淀。
- 应用上清镍亲和层析柱。
- 洗净咪唑10MM，500MM氯化钠和20mm磷酸钠，pH6.3，与咪唑从10mm到250mm的线性渐变洗脱列。池的分数包含对纯化sGMRα和透析磷酸盐缓冲液（PH7.4）（PBS）的。
2。生物素的重组GM - CSF的
- 删除对PBS透析山梨醇准备。
- 加入1ml至20mm的冷钠元碘酸溶液，在4 ° C的冰的解决方案。
- 孵育30分钟就在黑暗中的冰样本。
- 添加甘油的终浓度为15mm的解决方案。
- 透析对100MM醋酸钠缓冲液（PH5.5）的解决方案
- 生物素酰肼加入终浓度为5mm的解决方案，并不断搅动解决在室温2H。
- 取出透析对PBS，PH7.4未反应的物质。
3。不含细胞的GM - CSF受体配体结合法
- 大衣与单克隆抗多聚组氨酸抗体50μL一夜之间4微孔板° C。
- 用PBST500μL洗5次。
- 添加阻塞的解决方案和孵化为3h 4 ° C。100μL
- 用PBST500μL洗5次。
- 在封闭液中添加sGMRα50μL，4℃过夜孵育° C。
- 用PBST500μL洗5次。
- 样本含有GM - CSF的自身抗体和生物素化的GM - CSF的25μl加入25μl。孵育1h后在4 ° C至形成sGMRαGM - CSF复杂。
- 用PBST500μL洗5次。
- 添加0.4mm的链霉亲和素碱性磷酸酶1小时50μL4 ° C至检测生物素化的GM - CSF的约束sGMRα。
- 用PBST500μL洗5次。
- 解决方案，并在室温下孵育1h后加入化学发光底物50μL。
- 使用化学发光酶标仪，检测化学发光活动。
4。代表性的成果：
在GM - CSF受体信号转导通路的第一步是GM - CSF的结合，GM - CSF的受体细胞表面上的。因为GM - CSF的抗体特异性结合GM - CSF和块及其受体在体外16,17的约束力，我们推测，自身抗体抑制这种直接绑定到GM - CSF的第一反应。如前所述（编号9-15），我们应用转基因家蚕的技术来获得大量高纯度的重组sGMRα。
加载在SDS - PAGE非还原条件下，当蚕衍生的重组sGMRαsGMRα显示，两个单体（45 kDa）的和二聚体（90 kDa）的形式，而只有单体的形式还原条件下检测到（图1B） ，表明重组sGMRα混合单体和二硫键连接调光器18。
使用无细胞系统（图2A），我们评估sGMRα抑制GM - CSF的结合，GM - CSF的抗体（图2B和图2C）。浦野等，这些方法在参考文献19描述。结合抑制，不同浓度的GM - CSF的抗体（图3A）19（R = 0.988，P = 0.002）密切相关的生长抑制。同样，结合抑制与生长的抑制作用显着相关。结合抑制GM - CSF的自身抗体（图3B）19在剂量依赖性增加。这些来自不同患者的血清IgG组分两个参数相互呈正相关（R = 0.589 p = 0.006，图3c）。无论是结合抑制，也不生长抑制与Kd值，因此，这两个参数是通过具有约束力的亲和力 19日的影响。因此可重复性的约束力和G之间的数据通过三个独立的实验对三种不同的样品获得的rowth抑制了评估。的变异系数表示，更优良的生物活性（表1）无细胞系统。
图1。sGMRα使用转基因蚕生产过程流程图。一）结构转化载体9-11。二）SDS - PAGE和考马斯亮蓝染色的减少和非还原条件下纯化sGMRα。 sGMRα，可溶性GM - CSF受体α; MGFP，怪物绿色荧光蛋白;，5' -非翻译区序列家蚕核型多角体病毒多角体BmNPVpol5' UTR区; SV40的多聚腺苷酸，SV40的多聚腺苷酸信号序列，P 3xP3，3xP3推动者， P ser1，ser1子; HR3， 有机农业研究所 ，素L -链多聚腺苷酸信号序列多聚腺苷酸; 家蚕核型多角体病毒HR3增强。
图2无细胞检测系统的计划。 A）竞争结合实验，使用由蚕生产sGMRα的。二）中和非中和抗体的影响，对无细胞系统的结合抑制。三）区别不同浓度的中和抗体和非中和抗体之间的结合抑制。 GM - CSF，粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子;sGMRα，可溶性GM - CSF受体α;他，RGS - His - tag的美联社，碱性磷酸酶。
图3，GM - CSF的结合抑制sGMRα由GM - CSF的多克隆抗体或自身免疫性PAP患者的血清IgG分数的影响。一）和GM - CSF的抗体结合抑制生长的抑制之间的关系。二）在不同浓度的GM - CSF抗体的结合抑制。三）集成电路50％的结合抑制和血清IgG 分数 19％的增长抑制之间的关系。 IC，50％抑制浓度50; GM - CSF，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。
| 样品 | 一 | 乙 | 彗星 |
| 批间 | |||
| ＃的测定 | 3 | 3 | 3 |
| 平均值（％结合抑制） | 61.6 | 63.8 | 69.7 |
| 平均值（％生长抑制） | 21.0 | 73.4 | 82.8 |
| 变异系数（％）（％约束力抑制） | 6.0 | 5.6 | 8.3 |
| 变异系数（％）（％的增长，抑制） | 64.4 | 18.3 | 10.4 |
两种检测均在5纳克/毫升的GM - CSF和GM - CSF的抗体的浓度等于。
表1％的约束性和增长禁忌之间的变化系数通过3次独立实验的比较。
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Discussion
无细胞检测估计具有优良的重现性和快速性的GM - CSF的自身抗体的中和能力。结合抑制GM - CSF的自身抗体或患者的血清IgG分数是评估这个实验。数据显示，结合抑制细胞免费检测和使用TF - 1细胞，分别为生物活性的生长抑制之间的关系。已被广泛使用的生物活性，但窝藏在比较数据之间不同的设施和不同的时间点，我们通过使用这个新的系统可避免的困难。
GM - CSF的结合sGMRα与低亲和力，并形成一个二进制的复杂20。最近的研究表明，人GM - CSF结合GM - CSF受体α和GM - CSF受体β，形成了高亲和力与细胞表面上的 21 dodecameric复杂。因此，基于单体GM - CSF受体α和GM - CSF受体β二聚体组成的三元复合物检测系统，将是未来的候选人的系统，以提高无细胞检测。
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Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
我们非常感谢他们的宝贵贡献，K. Nakagaki，博士阁下石井，铃木博士光，A.山形，光Oofusa。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| human placenta cDNA library | Takara | ||
| Nickel affinity column | GE Healthcare | 17-5247-01 | |
| biotin hydrazide (EZ-Link Biotin Hydrazide) | PIERCE | 21339 | |
| rhGM-CSF (leukine) | Genzyme Corporation | ||
| Nunc Immobilizer Amino | Nalge Nunc International | 436007 | |
| Monoclonal Anti-polyHistidine antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | H1029 | 0.2ml |
| blocking solution (StabilCoat) | Surmodics | SC01-1000 | 1000ml |
| ZyMAX Streptavidin-AP Conjugate | Invitrogen | 43-8322 | |
| CDP-Star Ready-to-Use With Sapphire-II | Applied Biosystems | T2214 | |
| chemiluminescence plate reader | BERTHOLD TECHNOLOGIES | TriStar LB 941 |
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