Summary
Abbiamo progettato una cella priva di test legame recettore al fine di valutare il legame di granulociti-macrofagi colony-stimulating factor (GM-CSF) ai recettori. Ci permette di valutare inibizione competitiva del biotinilato GM-CSF legame al recettore alfa solubili GM-CSF da GM-CSF autoanticorpi con eccellente riproducibilità.
Abstract
SFONDI: In precedenza, abbiamo dimostrato che la capacità di neutralizzare, ma non la concentrazione di GM-CSF autoanticorpi è stata correlata con la gravità della malattia nei pazienti con autoimmuni proteinosi alveolare polmonare (PAP) 1-3. Come abrogazione di GM-CSF bioattività nel polmone è la causa probabile per PAP autoimmuni 4,5, è promettente per misurare la capacità neutralizzante di GM-CSF autoanticorpi per valutare la gravità della malattia in ogni paziente con PAP.
Fino ad oggi, la capacità neutralizzante di GM-CSF autoanticorpi è stata valutata mediante la valutazione della inibizione della crescita di cellule di midollo osseo umano o TF-1 cellule stimolate con GM-CSF 6-8. Nel sistema biologico, tuttavia, è spesso problematico ottenere dati affidabili e di confrontare i dati provenienti da diversi laboratori, a causa delle difficoltà tecniche nel mantenimento delle cellule in una condizione costante.
OBIETTIVO: Per simulare GM-CSF legame con GM-CSF recettore sulla superficie cellulare tramite cell-free recettoriale-test.
METODI: baco da seta transgenici tecnologia è stata applicata per ottenere una grande quantità di ricombinante solubile GM-CSF recettore alfa (sGMRα) con elevata purezza 9-13. Il sGMRα ricombinante era contenuta negli strati sericina idrofila di fili di seta, senza essere fuse alle proteine della seta, e quindi, si può facilmente estrarre dai bozzoli in purezza buona con neutro soluzioni acquose 14,15. Fortunatamente, le strutture oligosaccaridi, che sono critici per il legame con GM-CSF, sono più simili alle strutture di sGMRα umane rispetto a quelle prodotte da altri insetti o lieviti.
RISULTATI: La cella priva di sistema di analisi utilizzando sGMRα dato i dati con elevata plasticità e affidabilità. Vincolanti per sGMRα GM-CSF è stato dose-dipendente inibita da policlonali GM-CSF autoanticorpi in maniera simile al test biologico con cellule TF-1, indicando che il nostro nuovo sistema di test cell-free utilizzando sGMRα è più utile per la misurazione di attività neutralizzante di GM-CSF autoanticorpi rispetto al sistema biologico utilizzando TF-1 di cellule umane o cellule del midollo osseo.
CONCLUSIONI: Abbiamo stabilito una cella priva di test quantificare la capacità neutralizzante di GM-CSF autoanticorpi.
Protocol
1. Produzione e purificazione di sGMRα
- Amplifica cDNA di sGMRα da placenta umana biblioteca di cDNA mediante reazione a catena della polimerasi (PCR).
- Aggiungere 50 di base 5'-UTR sequenza di fine baculovirus polyhedrin e 27 RGS base di codifica His-tag per terminare il 3 'per l'amplicone PCR da un altro PCR.
- Inserire il prodotto amplificato di PCR in un pMSG1.1MG plasmide.
- Iniettare il psGMR/M1.1MG costruire con il vettore helper pHA3PIG in uova di baco da seta PND-w1 ceppo.
- Posteriore nati G0 larve di lepidotteri a 25 ° C. Schermo embrioni G1 ottenuto con l'accoppiamento tra fratelli o con PND-w1 MGFP di espressione negli occhi di ottenere bachi da seta transgenici recanti il gene sGMRα.
- Estratto ricombinante sGMRα da bozzoli di bachi da seta transgenici con tampone contenente fosfato-500mm NaCl e mescolare a 4 ° C per 24 ore.
- Centrifugare campione a 20000 g per 15 minuti per rimuovere un precipitati.
- Applicare supernatante in una nichel-affinità delle colonne.
- Lavare la colonna con 10 mM imidazolo, 500mm e fosfato di sodio NaCl 20 mM, pH6.3, ed eluire con un gradiente lineare di imidazolo da 10mm a 250mm. In comune le frazioni contenenti i sGMRα purificata e Dializzare contro PBS (pH7.4) (PBS).
2. Biotinilazione ricombinante di GM-CSF
- Rimuovere preparazione sorbitolo con la dialisi contro PBS.
- Aggiungere 1 ml di 20 mM freddo sodio meta-periodato soluzione a 4 ° C per la soluzione su ghiaccio.
- Incubare il campione per 30 minuti sul ghiaccio nel buio.
- Aggiungere alla soluzione di glicerolo ad una concentrazione finale di 15 mm.
- Dializzare la soluzione tampone contro 100mM acetato di sodio (pH5.5)
- Aggiungi idrazide biotina alla soluzione ad una concentrazione finale di 5 mm e continuamente agitare la soluzione per 2 ore a temperatura ambiente.
- Rimuovere il materiale non ha reagito con la dialisi contro PBS, pH7.4.
3. Una cellula priva di GM-CSF recettore-ligando-binding assay
- Cappotto micropiastra con 50μl di anticorpo monoclonale anti-polyHistidine anticorpi notte a 4 ° C.
- Lavare cinque volte con 500μl di PBST.
- Aggiungere 100μl di una soluzione di saturazione e incubare per 3 ore a 4 ° C.
- Lavare cinque volte con 500μl di PBST.
- Aggiungere 50μl di sGMRα nella soluzione di blocco e incubare una notte a 4 ° C.
- Lavare cinque volte con 500μl di PBST.
- Aggiungere 25μl dei campioni contenenti GM-CSF autoanticorpi e poi 25μl di biotinilato GM-CSF. Incubare per 1h a 4 ° C per formare sGMRα-GM-CSF complesso.
- Lavare cinque volte con 500μl di PBST.
- Aggiungere 50μl di fosfatasi alcalina 0.4mm streptavidina per 1 ora a 4 ° C per rilevare la biotinilato GM-CSF legato sGMRα.
- Lavare cinque volte con 500μl di PBST.
- Aggiungere 50μl di un substrato chemiluminescente alla soluzione e incubati per 1h a temperatura ambiente.
- Utilizzando un lettore di piastre chemiluminescenza, rilevare l'attività chemiluminescenza.
4. Rappresentante dei risultati:
Il primo passo per il GM-CSF via di trasduzione del segnale del recettore è il legame di GM-CSF a GM-CSF alfa recettore sulla superficie delle cellule. Perché GM-CSF autoanticorpi lega in modo specifico GM-CSF e bloccare il suo legame al recettore in vitro 16,17, abbiamo ipotizzato che gli autoanticorpi inibire questa reazione prima direttamente vincolanti a GM-CSF. Come descritto in precedenza (rif. 9-15), abbiamo applicato la tecnologia transgenica baco da seta per ottenere una grande quantità di sGMRα ricombinante con elevata purezza.
Quando il baco da seta derivato sGMRα ricombinante è stato caricato su SDS-PAGE in condizioni non riducenti, l'ha dimostrato sia sGMRα monomerico (45 kDa) e dimerica (90 kDa) le forme, mentre solo la forma monomerica è stato rilevato in condizioni di riduzione (Figura 1B) , indicando che la sGMRα ricombinante era una miscela di monomeri e disolfuro-linked dimmer 18.
Utilizzando il sistema acellulare (Fig. 2A), abbiamo valutato l'inibizione di GM-CSF legame sGMRα da GM-CSF autoanticorpi (Fig. 2B e fig. 2C). Questi metodi sono stati descritti in riferimento 19 da Urano et al. L'inibizione della crescita è strettamente correlata con l'inibizione vincolante (r = 0,988, p = 0,002) a diverse concentrazioni del GM-CSF autoanticorpi (Fig. 3A) 19. Allo stesso modo, l'inibizione vincolante è risultata significativamente correlata con l'inibizione della crescita. L'inibizione vincolante aumentata in modo dose-dipendente da GM-CSF autoanticorpi (Fig. 3B) 19. Questi due parametri per le frazioni IgG sieriche di diversi pazienti sono stati correlati tra loro (r = 0,589 p = 0,006, fig. 3C). Né vincolante né inibizione della crescita correlata con i valori di Kd, e quindi, entrambi i parametri è stata influenzata dalla affinità di legame 19. Di conseguenza, la riproducibilità dei dati tra vincolanti e ginibizione rescita ottenuto attraverso tre esperimenti indipendenti su tre diversi campioni è stata valutata. Il coefficiente di variazione indicato che il sistema acellulare era più eccellente di quello del biologico (tabella 1).
Figura 1. Diagramma di flusso della procedura per la produzione di sGMRα utilizzando transgenici bachi da seta. A) Le strutture dei vettori di trasformazione 9-11. B) SDS-PAGE e Coomassie Brilliant Blue-colorazione del sGMRα purificata sotto riducendo e non riducendo le condizioni. sGMRα, GM-CSF solubile del recettore alfa; MGFP, mostro verde fluorescente proteine; BmNPVpol5'-UTR, 5'-non tradotta sequenza regione di Bombyx mori nucleare poliedrosi virus polyhedrin; polyA SV40, SV40 sequenza di segnali polyA P 3xP3, 3xP3 promotore; P ser1, ser1 promotore; FiBL polyA, fibroina L-catena sequenza di segnali polyA; hr3, Bombyx mori nucleare poliedrosi virus hr3 enhancer.
Figura 2. Schema del sistema acellulare test. A) Un saggio di legame competitivo con sGMRα prodotto da baco da seta. B) Effetto di anticorpi neutralizzanti e non neutralizzanti sulla inibizione vincolanti da parte delle cellule senza sistema. C) La differenza di inibizione vincolante tra diverse concentrazioni di anticorpi neutralizzanti e non-anticorpi neutralizzanti. GM-CSF, granulociti-macrofagi fattore stimolante le colonie; sGMRα, GM-CSF solubile del recettore alfa; suo, RGS-His-tag, AP, fosfatasi alcalina.
Figura 3. GM-CSF inibizione vincolante sGMRα per gli effetti di GM-CSF anticorpi policlonali o le frazioni IgG sieriche di pazienti con PAP autoimmuni. A) Relazione tra l'inibizione vincolanti e inibizione della crescita di GM-CSF autoanticorpi. B) inibizione rilegatura a diverse concentrazioni di GM-CSF autoanticorpi. C) Relazione tra IC 50 per cento inibizione vincolante e inibizione della crescita per cento dal frazioni IgG sieriche 19. IC 50, 50% di concentrazione di inibizione; GM-CSF, granulociti-macrofagi fattore stimolante le colonie.
| Campione | A | B | C |
| Inter-saggio | |||
| # Di determinazioni | 3 | 3 | 3 |
| Il valore medio (% di inibizione vincolante) | 61,6 | 63,8 | 69,7 |
| Valore medio (inibizione della crescita%) | 21,0 | 73,4 | 82,8 |
| Coefficiente di variazione (%) (% di inibizione vincolante) | 6.0 | 5,6 | 8,3 |
| Coefficiente di variazione (%) (inibizione della crescita%) | 64,4 | 18,3 | 10,4 |
Entrambi i test sono stati eseguiti a 5 ng / ml di GM-CSF e una concentrazione pari a GM-CSF autoanticorpi.
Tabella 1. Confronto del coefficiente di variazione tra vincolante per cento e le inibizioni di crescita ottenuto attraverso tre esperimenti indipendenti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Il cell-free saggio stimato la capacità neutralizzante di GM-CSF autoanticorpi con eccellente riproducibilità e rapidità. L'inibizione vincolante da GM-CSF autoanticorpi o frazioni siero del paziente IgG è stata valutata da questa analisi. I dati hanno mostrato una correlazione tra l'inibizione legame della cellula senza test e l'inibizione della crescita di un saggio biologico con cellule TF-1, rispettivamente. Il biologico è stato ampiamente utilizzato, ma nutrito difficoltà inerenti alla comparazione di dati tra strutture diverse e tempi diversi, che possiamo evitare utilizzando questo nuovo sistema.
GM-CSF sGMRα lega con bassa affinità e formano un complesso binario 20. Recenti studi hanno dimostrato che il GM-CSF umano si lega al GM-CSF recettore alfa e GM-CSF recettore beta formando un complesso dodecameric con alta affinità sulla superficie cellulare 21. Così, un sistema di analisi basato su complessi ternari costituiti da monomerici GM-CSF recettore alfa e dimerica GM-CSF recettore beta sarebbe un sistema candidato futuro per migliorare la cellula senza test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
Siamo molto grati a K. Nakagaki, Dr. H. Ishii, il Dr. K. Suzuki, A. Yamagata, K. Oofusa per i loro preziosi contributi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| human placenta cDNA library | Takara | ||
| Nickel affinity column | GE Healthcare | 17-5247-01 | |
| biotin hydrazide (EZ-Link Biotin Hydrazide) | PIERCE | 21339 | |
| rhGM-CSF (leukine) | Genzyme Corporation | ||
| Nunc Immobilizer Amino | Nalge Nunc International | 436007 | |
| Monoclonal Anti-polyHistidine antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | H1029 | 0.2ml |
| blocking solution (StabilCoat) | Surmodics | SC01-1000 | 1000ml |
| ZyMAX Streptavidin-AP Conjugate | Invitrogen | 43-8322 | |
| CDP-Star Ready-to-Use With Sapphire-II | Applied Biosystems | T2214 | |
| chemiluminescence plate reader | BERTHOLD TECHNOLOGIES | TriStar LB 941 |
References
- Arai, T. Serum neutralizing capacity of GM-CSF reflects disease severity in a patient with pulmonary alveolar proteinosis successfully treated with inhaled GM-CSF. Respir Med. 98, 1227-1230 (2004).
- Tazawa, R. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and lung immunity in pulmonary alveolar proteinosis. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1142-1149 (2005).
- Inoue, Y. Characteristics of a large cohort of patients with autoimmune pulmonary alveolar proteinosis in Japan. Am J Respir Crit Care Med. 177, 752-762 (2008).
- Uchida, K. High-affinity autoantibodies specifically eliminate granulocyte-macrophage colony-stimulating factor activity in the lungs of patients with idiopathic pulmonary alveolar proteinosis. Blood. 103, 1089-1098 (2004).
- Sakagami, T. Human GM-CSF autoantibodies and reproduction of pulmonary alveolar proteinosis. N Engl J Med. 361, 2679-2681 (2009).
- Raines, M. Identification and molecular cloning of a soluble human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 8203-8207 (1991).
- Williams, W., VonFeldt, J., Rosenbaum, H., Ugen, K., Weiner, D. Molecular cloning of a soluble form of the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor alpha chain from a myelomonocytic cell line. Expression, biologic activity, and preliminary analysis of transcript distribution. Arthritis Rheum. 37, 1468-1478 (1994).
- Prevost, J. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and inflammatory stimuli up-regulate secretion of the soluble GM-CSF receptor in human monocytes: evidence for ectodomain shedding of the cell surface GM-CSF receptor alpha subunit. J Immunol. 169, 5679-5688 (2002).
- Iizuka, M. Production of a recombinant mouse monoclonal antibody in transgenic silkworm cocoons. FEBS J. 276, 5806-5820 (2009).
- Iizuka, M., Tomita, M., Shimizu, K., Kikuchi, Y., Yoshizato, K. Translational enhancement of recombinant protein synthesis in transgenic silkworms by a 5'-untranslated region of polyhedrin gene of Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus. J Biosci Bioeng. 105, 595-603 (2008).
- Zou, W., Ueda, M., Yamanaka, H., Tanaka, A. Construction of a combinatorial protein library displayed on yeast cell surface using DNA random priming method. J Biosci Bioeng. 92, 393-396 (2001).
- Tamura, T. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat Biotechnol. 18, 81-84 (2000).
- Tomita, M. Transgenic silkworms produce recombinant human type III procollagen in cocoons. Nat Biotechnol. 21, 52-56 (2003).
- Ogawa, S., Tomita, M., Shimizu, K., Yoshizato, K. Generation of a transgenic silkworm that secretes recombinant proteins in the sericin layer of cocoon: production of recombinant human serum albumin. J Biotechnol. 128, 531-544 (2007).
- Tomita, M. A germline transgenic silkworm that secretes recombinant proteins in the sericin layer of cocoon. Transgenic Res. 16, 449-465 (2007).
- Kitamura, T. Idiopathic pulmonary alveolar proteinosis as an autoimmune disease with neutralizing antibody against granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 190, 875-880 (1999).
- Tanaka, N. Lungs of patients with idiopathic pulmonary alveolar proteinosis express a factor which neutralizes granulocyte-macrophage colony stimulating factor. FEBS Lett. 442, 246-250 (1999).
- Brown, C., Pihl, C., Murray, E. Oligomerization of the soluble granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor: identification of the functional ligand-binding species. Cytokine. 9, 219-225 (1997).
- Urano, S. A cell-free assay to estimate the neutralizing capacity of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor autoantibodies. J Immunol Methods. 360, 141-148 (2010).
- Hayashida, K. Molecular cloning of a second subunit of the receptor for human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF): reconstitution of a high-affinity GM-CSF receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9655-9659 (1990).
- Hansen, G. The structure of the GM-CSF receptor complex reveals a distinct mode of cytokine receptor activation. Cell. 134, 496-507 (2008).
