Un procedimiento de cultivo a base de líquido y dispensación de<em> C. elegans</em> Cepas que expresan proteínas fluorescentes reportero se describe que no requiere de equipos de selección caro. Este enfoque puede aplicarse a numerosas inducible<em> C. elegans</em> Genes para la detección de drogas o biosensores de contaminantes.
Selección de alto rendimiento (HTS) es un poderoso método para la identificación de moduladores químicos de los procesos biológicos. Sin embargo, muchos de los compuestos identificados en las pantallas usando modelos de cultivo celular se encuentran a menudo que son tóxicos o inactivos farmacológicamente in vivo 1-2. Proyección en modelos animales todo puede ayudar a evitar estos escollos y agilizar el camino hacia el desarrollo de fármacos.
C. elegans es un organismo multicelular modelo muy adecuado para HTS. Es pequeño (<1 mm) y puede ser económicamente culta y se distribuye en los líquidos. C. elegans es también uno de los modelos animales más manejables experimentalmente que permitan la identificación rápida y detallada de las drogas el modo de acción 3.
Se describe un protocolo para el cultivo y distribución de las cepas fluorescentes C. elegans para la selección de alto rendimiento de bibliotecas químicas o detección de contaminantes ambientales que alteran la expresión de un gen específico. Un gran número de gusanos de desarrollo sincronizado en un cultivo líquido, cosecha, lavado, y suspendió a una densidad definida. Los gusanos se añaden al negro, de fondo plano placas de 384 pocillos con un dispensador de líquidos peristáltica. Las moléculas pequeñas de una biblioteca de química o de las muestras de ensayo (por ejemplo, agua, alimentos o suelo) se pueden añadir a los pozos con los gusanos. En vivo y en tiempo real la intensidad de fluorescencia se mide con un lector de microplacas de fluorescencia. Este método se puede adaptar a cualquier gen inducible en C. elegans para que un periodista adecuados. Estrés inducible muchas vías de desarrollo y de la transcripción están bien definidos en C. elegans y las buenas prácticas agrarias reportero cepas transgénicas ya existen en muchos de ellos 4. Cuando se combina con los reporteros transgénicos corresponda, nuestro método puede ser utilizado para la detección de moduladores de la vía o el desarrollo de sólidas pruebas de biosensor de contaminantes ambientales.
Demostramos nuestro C. elegans la cultura y el protocolo de dispensación con un ensayo HTS que hemos desarrollado para controlar el C. factor de transcripción collar 'n' elegans tapa SKN-1. SKN-1 y su homólogo de mamíferos Nrf2 activar genes citoprotectores durante el estrés oxidativo y 10.5 xenobióticos. Nrf2 protege a los mamíferos a partir de numerosos trastornos relacionados con la edad como el cáncer, neurodegeneración y la inflamación crónica y se ha convertido en un importante objetivo de la quimioterapia 11-13. Nuestro análisis se basa en un reportero GFP transgénicos para la SKN-1 del gen objetivo -4 gst 14, que codifica un 6 glutatión-s-transferasa. El periodista gst -4 es también un biosensor para los productos químicos xenobióticos y de oxidación, que activan SKN-1 y se puede utilizar para detectar bajos niveles de contaminantes tales como la acrilamida y el metil-mercurio 15-16.
Se presenta un método para cultivar y distribuir grandes cantidades de nematodos transgénicos. El equipo utilizado para el cultivo de lombrices es el estándar para los laboratorios que realizan la clonación molecular y el manejo de líquidos y el equipo de fluorescencia es el estándar para los laboratorios de procesamiento de un gran número de microplacas. Otros métodos de dispensación de un gran número de vivir C. elegans requieren partículas caro equipo de clasificación 19. El Pgst-4…
The authors have nothing to disclose.
C. elegans transgénicos fueron proporcionados por el Centro de Genética Caenorhabditis (Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN). Este trabajo fue apoyado por el NIH R21 conceder NS0667678-01 a KS. Todos los autores participaron en la recolección, análisis e interpretación de datos. CKL, KS, y KPC participaron en la redacción y revisión del manuscrito.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
LB broth | Research Products International Corp. | L24066 | |
Terrific broth | Research Products International Corp. | T15100 | |
Synergy™ HT Multi-mode Microplate Reader | BioTek | Filters: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em | |
MicroFlo Select Dispenser | BioTek | ||
Worm dispensing flask | Southern Scientific Inc., Micanopy, FL | Custom assembled (352) 284-2531 | |
384 microplates | Greiner Bio-One | 5678-1209 | |
Breathable sealing tape | Nunc | 241205 | |
(5-hydroxy-p-naphthoqinone) Juglone | ACROS | 121640010 | Juglone is dissolved in DMSO |
DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
C. elegans transgenic strain | Author’s laboratory | VP596 | Pgst-4::GFP and Pdop-3::RFP |