Summary
إجراءات لبناء زراعة السائل وصرف
Abstract
الفرز الفائق الإنتاجية (HTS) هو طريقة فعالة لتحديد جهري من العمليات البيولوجية الكيميائية. ومع ذلك ، غالبا ما توجد العديد من المركبات التي تم تحديدها في شاشات باستخدام نماذج ثقافة الخلية لتكون سامة أو غير نشط في الجسم الحي عقاقيري 1-2. يمكن الفرز في النماذج الحيوانية كلها تساعد على تجنب هذه المزالق وتبسيط مسار التنمية المخدرات.
ايليجانس جيم هو كائن نموذج متعددة الخلايا مناسبة تماما للHTS. انها صغيرة (<1 مم) ويمكن الاستغناء اقتصاديا وتربيتها في السوائل. جيم ايليجانس هي أيضا واحدة من أكثر النماذج الحيوانية الانقياد تجريبيا يتيح التعرف السريع والمفصل لوضع المخدرات مقابل عمل 3.
وصفنا بروتوكول للزراعة وصرفها من سلالات الفلورسنت C. ايليجانس الإنتاجية العالية لفحص المكتبات الكيميائية أو الكشف عن الملوثات البيئية التي تغير التعبير عن جينة معينة. تزرع أعداد كبيرة من الديدان متزامنة تنمويا في الثقافة السائل ، وحصادها ، وغسلها ، وعلقت في مناطق ذات كثافة المعرفة. ثم تضاف الديدان إلى الأسود ، لوحات 384 جيدا مسطحة باستخدام موزع تحوي السائل. يمكن إضافة جزيئات صغيرة من مكتبة الكيميائية أو عينات الاختبار (على سبيل المثال ، الماء ، الغذاء ، أو التربة) من الآبار مع الديدان في الجسم الحي ، ويقاس في الوقت الحقيقي مع كثافة مضان قارئ microplate مضان. ويمكن تكييف هذه الطريقة على أي الجينات محرض في C. ايليجانس التي مراسل مناسبة متاحة. وتعرف جيدا العديد من الإجهاد محرض والمسارات التنموية في الترانسكربتي C. ايليجانس والسلالات المعدلة وراثيا GFP مراسل موجودة بالفعل بالنسبة للكثيرين منهم 4. عندما يقترن المعدلة وراثيا للصحفيين ان المناسبة ، يمكن استخدام أسلوب لدينا للكشف عن جهري ممرا أو المقايسات لتطوير جهاز الاستشعار البيولوجي قوية للملوثات البيئية.
نحن لدينا تثبت C. ايليجانس الثقافة والاستغناء عن بروتوكول مع مقايسة HTS ضعنا لرصد C. 'ن' ايليجانس قبعة عامل النسخ طوق SKN - 1. SKN - 1 و Nrf2 لها نديد الثدييات تنشيط الجينات cytoprotective خلال الاكسدة وأجنبي بيولوجيا 5-10. Nrf2 الثدييات يحمي من الاضطرابات المتعلقة بالعمر عديدة مثل السرطان ، وتنكس عصبي ، والتهاب مزمن ، وأصبح هدفا رئيسيا الكيميائي 11-13. يستند على فحص لدينا مراسل GFP المعدلة وراثيا لSKN - 1 هدف الجينات GST -4 14 الذي يشفر 6 - S ترانسفيراز الجلوتاثيون. مراسل GST -4 هو أيضا جهاز الاستشعار البيولوجي للمواد الكيميائية وأجنبي بيولوجيا الاكسدة التي تنشط SKN - 1 ، ويمكن استخدامها للكشف عن مستويات منخفضة من الملوثات ، مثل الأكريلاميد وميثيل الزئبق 15-16.
Protocol
1. إعداد الطعام دودة البكتيرية
اليوم 1
- إضافة 5 مل من E. المشبعة القولونية مل مرق OP50 ثقافة البكتيرية إلى 500 رائع تستكمل مع الستربتوميسين ميكروغرام / مل 50 و تنمو في حاضنة تهتز (225 دورة في الدقيقة) ليلا 37 درجة مئوية.
اليوم 2
- انقسام بين عشية وضحاها ثقافة البكتيرية في أنابيب ten 50 مل والبكتيريا الطرد المركزي في أجهزة الطرد المركزي المبردة في RCF 2500 لمدة 20 دقيقة.
- صب مرق قبالة LB وresuspend كل بيليه الجرثومي في 10 مل من السائل وسائط النمو الخيطية (NGM). هزة أفقيا في الكلمة شاكر لمدة 15 دقيقة لresuspend البكتيريا. لجعل NGM العازلة ، إضافة 3 غرام كلوريد الصوديوم في الماء منزوع الأيونات وL 1 الأوتوكلاف. تبرد إلى 55 درجة مئوية وإضافة في النظام العقيم الحلول التالية : 1 مل من CaCl M 1 2 ، 1 مل من MgSO M 1 4 ، و 25 مل من 1 فوسفات البوتاسيوم M ، 6.0 درجة الحموضة.
- الطرد المركزي ثقافة البكتيرية في جهاز للطرد المركزي المبردة في RCF 2500 لمدة 20 دقيقة.
- صب قبالة العازلة NGM وتزن بيليه البكتيرية.
- إضافة حجم مساو من المخزن إلى NGM resuspend الكريات ، قسامة 3 مل من تركيز البكتيريا إلى 15 مل الأنابيب ، وتخزين في -20 درجة مئوية.
2. على نطاق واسع C. ايليجانس ثقافة السائل
نستخدم خط VP596 المعدلة وراثيا (dvIs19 [pAF15 (GST - 4 : : GFP : NLS)] ؛ vsIs33 [DOP - 3 : : RFP]) تقل اثنين من بنيات فلوري : Pgst -4 : 14 GFP لرصد SKN - 1 النشاط وPDOP 3 : 17 RFP لتكون بمثابة معيار للتطبيع عدد دودة.
اليوم 1
- مزيج 150 مل NGM العازلة ، 1.5 مل مرق LB ، 150 ميكرولتر من الكولسترول ملغم / 5 مل (في الإيثانول) ، و 75 ميكرولتر من الستربتوميسين ملغ / 100 مل. فلتر تعقيم الخليط ويضاف إلى قارورة معقمة 1 ليتر.
ملاحظة : إضافة 1 ٪ لمرق LB العازلة NGM يساعد على منع الديدان من الالتصاق على الأواني الزجاجية وبلستيكور ، ولكن هذا المبلغ لا يكفي لدعم نمو البكتيريا. - تزامن مع الديدان الإجراء هيبوكلوريت معيار 18. يمكن معالجة ما يصل إلى 0.5 مل من الديدان حامل في أنبوب واحد مل 15 مع 5 مل من محلول هيبوكلوريت (3.75 مل من الماء المعقم ، 1 مل التبييض المنزلية ، و 250 ميكرولتر هيدروكسيد الصوديوم 10 N). غسل البيض إصداره مع الماء المعقم وresuspend منها في 10 مل من NGM العازلة.
- تمييع عينة من 100 أضعاف البيض في NGM عازلة (على سبيل المثال ، 100 ميكرولتر في 10 مل) ، وحساب عدد البيض في ثلاث aliquots 5 ميكرولتر منفصلة. متعددة متوسط عدد 200000 (100 × معامل التخفيف 2000) لتقدير العدد الكلي للبيض.
- إضافة 200000 إلى 2 مليون بيضة في قارورة مع NGM العازلة وتهز الثقافة عند 100 دورة في الدقيقة عند 20 درجة مئوية.
اليوم 2
- لا يقل عن 16 ساعة بعد إضافة البيض إلى القارورة ، واستخدام الماصة العقيمة المصلية لإزالة ما يقرب من 0.5 مل من ثقافة دودة مع وقف التنفيذ. الماصة three 5 قطرات ميكرولتر على غطاء العقيمة طبق بيتري. وضع غطاء في الثلاجة -20 درجة مئوية لمدة 1-2 دقائق على شل الديدان. حساب متوسط عدد الديدان تعيش مظلل بنسبة 5 ميكرولتر ثم متعددة 30000 (150 مل / 5 ميكرولتر) لتقدير العدد الكلي للديدان تفقس.
- ذوبان الجليد أنبوب للثقافة OP50 المجمدة البكتيرية (البروتوكول 1.6) وإضافة 3 مل من 50 ٪ في الثقافة OP50 دودة لكل 500،000 الديدان مظلل. هز قارورة في 100 دورة في الدقيقة عند 20 درجة مئوية. وسوف تتطور الى الديدان L4 يرقات وصغار البالغين في 51 ساعة تقريبا. ينبغي أن يكون من البكتيريا OD600 عن 2.200 في البداية. رصد كمية البكتيريا التي الامتصاصية وإضافة المزيد إذا OD 600 تنخفض 0.900.
3. جمع الدودة والاستغناء
اليوم 4
- استخدام الماصة العقيمة المصلية لنقل حوالي 0.5 مل من ثقافة دودة علقت لوحة NGM آغار القياسية. عرض الديدان مع stereomicroscope للتأكد من أن معظمها L4 اليرقات أو صغار البالغين. سوف L4 اليرقات بقعة بطني واضحة في منتصف الجسم. وسوف يكون الشباب أكبر قليلا ، ولن يكون له بقعة واضحة.
- من أجل ثقافة دودة في أنابيب معقمة 50 ملم ووضع الأنابيب في أنبوب اختبار رف على الفوق. السماح للديدان لتسوية لمدة 10 دقائق تقريبا. إزالة طاف بواسطة الشفط أو pipetting.
ملاحظة : هذه الخطوة يمكن أن تكون هامة لإزالة بيض لم يفقس أو الديدان التي لم تتطور لأنها سوف تستقر L4 أبطأ من يرقات وصغار البالغين. - جمع كل الديدان في أنبوب واحد 50 مل وتغسل مع NGM العازلة مع مرق LB 1 ٪ (NGM + LB) 3-4 مرات لإزالة البكتيريا.
ملاحظة : يتم ذلك على أفضل وجه في جهاز للطرد المركزي الدلو المتأرجح من خلال جمع الديدان في 500 RCF لمدة 30 ثانية ، واستبدال طاف مع NGM الطازجة + LB العازلة. - بعد الغسيل ، وملء الأنبوب مع NGM إلى 50 مل + LB العازلة وتصب في قارورة دودة مخصصة صرفها. إضافة شريط صغير يحرك ويحرك للحفاظ على الديدان مع وقف التنفيذ. العد اله عدد من الديدان في ثلاث قطرات 5 ميكرولتر كما هو مبين أعلاه. تمييع مع LB + NGM حتى تحصل 12-15 الديدان انخفاض بنسبة 5 ميكرولتر (~ 2،5-3،0 الديدان / ميكرولتر).
ملاحظة : هناك حاجة إلى الحد الأدنى من حوالي 20 مل (60000 الديدان) لملء الفراغ القتلى من قارورة والاستغناء عن موزع الكاسيت. كل لوحة بشكل جيد يتطلب حوالي 384 35000 الديدان أو 11.5 مل من الديدان مع وقف التنفيذ. - تحميل 10 ميكرولتر الاستغناء الكاسيت وتعقيم بواسطة فتيلة مع الايثانول 70 ٪. شطف خارج الايثانول بحلول فتيلة مع الماء المعقم.
- إدراج نهاية الكاسيت صرفها في قارورة بحيث انها مجرد اثارة فوق العارضة دون تعطيل حركتها. تأكد من أن تظل معلقة في جميع أنحاء الديدان القارورة كلها. برنامج موزع على الاستغناء على سرعة منخفضة مع البقول قبل 2. رئيس وتشغيل ما لا يقل عن 10 مل من الديدان مع وقف التنفيذ. ملء صفائح بسرعة عند الحاجة لمنع الديدان من الاستقرار في الأنبوب.
- ختم الشريط مع لوحات للتنفس.
- وضع لوحات على منصة تهتز في حاضنة على درجة حرارة مناسبة للفحص الخاص بك. لا مكدس على لوحات.
4. تحليل مضان
- المكان المستهدف في لوحة قارئ microplate لقياس كثافة مضان كل جيدا مع الطول الموجي من الانبعاثات والإثارة المناسبة (فلاتر لمقايسة لدينا : GFP 485/20ex 528/20em ؛ RFP 540/25ex 590/35em).
- حساب نسبة GFP / RFP وتطبيع مع قراءات من آبار المراقبة (بدون تفعيل المجمع) لتحديد الفرق الدقيق أضعاف كثافة مضان المستمدة من علاجات فردية.
5. ممثل النتائج :
لدينا SKN - 1 مقايسة يستخدم متكامل صبغويا سلالة مراسل المزدوجة (VP596). كما هو مبين في الشكل 1 ، ويرتبط أيضا بعدد من الديدان إلى حجم الاستغناء. كما هو مبين في الأرقام 2A و 2B ، GFP الكلي ومضان RFP لكل بئر هو تكرار للغاية من جانب إلى جانب لوحة 384 في جميع أنحاء جيدا. كما هو مبين في الشكل 2C ، والأمم المتحدة التي يسببها Pgst - 4 : : يرتبط خطيا GFP لمضان PDOP - 3 : : RFP عبر 384 بئرا. عندما أعرب عن كنسبة من GFP / RFP ، مضان يصبح استنساخه للغاية من جانب إلى جانب لوحة 384 في جميع أنحاء جيدا (قارن معامل الاختلاف من 2D إلى الشكل 2A) مما يدل على قدرة PDOP - 3 : : RFP مراسل للحد من التقلبات. كما هو مبين في الشكل 3 ، وتحريض النسبية GFP لRFP مع SKN - 1 تفعيل أجنبي بيولوجيا (38 جغلون ميكرومتر) قوي للغاية وقابلة للتكرار عبر 384 لوحة جيدا.
الاستغناء عن الرقم 1. عدد الديدان مقابل وحدة التخزين. وكانت مخففة الديدان 2/μl تقريبا والى الاستغناء عن 24 لوحة العد اليدوي جيدا لمع stereomicroscope. N = 8 آبار في وحدة التخزين.
الشكل 2. مضان المجموع من الديدان إلى الاستغناء عن 384 لوحة وكذلك استنساخه. وكانت مخففة الديدان ميكرولتر 2.5/μl تقريبا و 30 والاستغناء تماما في كل لوحة 384 أيضا. وكان GFP (A) وطلب تقديم العروض (B) مضان جميع الآبار معامل التباين أقل من 9 ٪. (C) يرتبط ارتباطا عاليا GFP مضان لمضان RFP. (د) حساب نسبة GFP RFP لخفض معامل الاختلاف إلى أقل من 6 ٪ (A ، B ، D و) خطوط الصلبة تشير وسائل وخطوط كسر تحديد ثلاث الانحرافات المعيارية أعلى أو أدنى من المتوسط.
. الشكل 3 تفعيل Pgst - 4 : : GFP قوي وثابت. تم فيها الاستغناء عن حوالي 75 L4 الديدان في جميع الآبار من 384 لوحة جيدا و 38 ميكرومتر جغلون أضيف في كل عمود آخر. وقد تم قياس GFP ومضان RFP بعد 21 ساعة من الحضانة. يتم وضع علامة على نسب يعني مضان السيطرة النسبية للجميع (1.0) وجغلون الآبار (8.9) مع الخطوط الصلبة. ثلاثة انحرافات معيارية فوق وتحت السيطرة يعني يعني جغلون يتم وضع علامة مع خطوط مقطوعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نقدم طريقة لزراعة وتوزيع أعداد كبيرة من الديدان الخيطية جينيا. والمعدات المستخدمة لزراعة الديدان هو المعيار لأداء مختبرات الاستنساخ الجزيئي وسائل ومعدات مناولة الاستشعاع معيارية للمختبرات معالجة أعداد كبيرة من microplates. الأساليب الأخرى الاستغناء أعداد كبيرة من يعيش جيم ايليجانس الجسيمات تتطلب تكلفة معدات الفرز 19. ويمكن استخدام GFP مقايسة للكشف عن جهري جزيء صغير من العوامل 'ن' قبعة النسخ طوق للكشف عن الملوثات وأجنبي بيولوجيا وأكسدة في العينات البيئية والغذائية 14،16 : وPgst - 4 :. محرض قوي المعدلة وراثيا للصحفيين GFP تتوفر مجموعة واسعة من الطرق والمحفزات البيئية 4 ، وبالتالي لدينا وسيلة يجب أن تنطبق على جهري النامية من مسارات كثيرة ، وكشف عن مجموعة واسعة من الملوثات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقدمت جيم ايليجانس الجينات المحورة من قبل مركز علم الوراثة انواع معينة (جامعة مينيسوتا ، مينيابوليس ، مينيسوتا). وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح NS0667678 R21 - 01 إلى KS. وشارك جميع المؤلفين في مجال جمع وتحليل وتفسير البيانات. شارك CKL ، KS ، ومؤسسة البترول الكويتية في كتابة وتنقيح المخطوطات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB broth | Research Products International Corp. | L24066 | |
| Terrific broth | Research Products International Corp. | T15100 | |
| Synergy HT Multi-mode Microplate Reader | BioTek | Filters: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em | |
| MicroFlo Select Dispenser | BioTek | ||
| Worm dispensing flask | Southern Scientific Inc., Micanopy, FL | Custom assembled(352) 284-2531 | |
| 384 microplates | Greiner Bio-One | 5678-1209 | |
| Breathable sealing tape | Nalge Nunc international | 241205 | |
| (5-hydroxy-p-naphthoqinone)Juglone | Acros Organics | 121640010 | Juglone is dissolved in DMSO |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| C. elegans transgenic strain | Author’s laboratory | VP596 | Pgst-4::GFP and Pdop-3::RFP |
References
- Simeonov, A. Quantitative high-throughput screen identifies inhibitors of the Schistosoma mansoni redox cascade. PLoS Negl Trop Dis. 2, e127-e127 (2008).
- Giacomotto, J., Segalat, L. High-throughput screening and small animal models, where are we. Br J Pharmacol. 160, 204-216 (2010).
- Artal-Sanz, M., de Jong, L., Tavernarakis, N. Caenorhabditis elegans: a versatile platform for drug discovery. Biotechnol J. 1, 1405-1418 (2006).
- WormBase [Internet]. , Available from: http://www.wormbase.org (2012).
- An, J. H., Blackwell, T. K. SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response. Genes Dev. 17, 1882-1893 (2003).
- Choe, K., Przybysz, A., Strange, K. The WD40 repeat protein WDR-23 functions with the CUL4/DDB1 ubiquitin ligase to regulate nuclear abundance and activity of SKN-1 in Caenorhabditis elegans. Mol Cell Biol. 29, 2704-2715 (2009).
- Hasegawa, K. Acrylamide-responsive genes in the nematode Caenorhabditis elegans. Toxicol. Sci. 101, 215-225 (2008).
- Tullet, J. M. A. Direct inhibition of the longevity-promoting factor SKN-1 by insulin-like signaling in C. elegans. Cell. 132, 1025-1038 (2008).
- Oliveira, R. P. Condition-adapted stress and longevity gene regulation by Caenorhabditis elegans SKN-1/Nrf. Aging Cell. , Forthcoming (2009).
- Park, S. -K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1. Aging Cell. 8, 258-269 (2009).
- Hayes, J. D., McMahon, M., Chowdhry, S., Dinkova-Kostova, A. T. Cancer chemoprevention mechanisms mediated through the Keap1-Nrf2 pathway. Antioxid Redox Signal. , (2010).
- Kwak, M. K., Kensler, T. W. Targeting NRF2 signaling for cancer chemoprevention. Toxicol Appl Pharmacol. 244, 66-76 (2010).
- Leiser, S. F., Miller, R. A. Nrf2 signaling, a mechanism for cellular stress resistance in long-lived mice. Mol Cell Biol. 30, 871-884 (2010).
- Link, C. D., Johnson, C. J. Reporter transgenes for study of oxidant stress in Caenorhabditis elegans. Methods Enzymol. 353, 497-505 (2002).
- Vanduyn, N., Settivari, R., Wong, G., Nass, R. SKN-1/Nrf2 inhibits dopamine neuron degeneration in a Caenorhabditis elegans model of methylmercury toxicity. Toxicol Sci. , (2010).
- Hasegawa, K. A rapid and inexpensive method to screen for common foods that reduce the action of acrylamide, a harmful substance in food. Toxicol Lett. 175, 82-88 (2007).
- Chase, D. L., Pepper, J. S., Koelle, M. R. Mechanism of extrasynaptic dopamine signaling in Caenorhabditis elegans. Nature Neuroscience. 7, 1096-1103 (2004).
- Hope, I. A. C. elegans, a Practical Guide. , Oxford University Press. (2005).
- Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. Methods Mol Biol. 351, 275-286 (2006).
