Summary
의 액체 기반 culturing 및 분배를위한 절차
Abstract
하이 스루풋 스크리닝 (HTS)은 생물 학적 과정의 화학 변조기를 식별에 대한 강력한 접근 방식이다. 그러나, 세포 배양 모델을 사용하여 화면에서 확인된 많은 화합물은 종종 생체내 1-2에 독성이나 pharmacologically 비활성으로 볼 수 있습니다. 전체 동물 모델에서 상영하는 것은 이러한 함정을 피하는데 도움이 및 약물 개발에 대한 경로를 합리화 수 있습니다.
C. 엘레간스 잘 HTS 적합 다세포 모델 생물이다. 그것은 작은 (<1mm)과 경제적 교양과 액체에 적절하게 사용하실 수 있습니다. C.가 엘레간스 또한 약물 모드의 액션 3 신속하고 상세한 신분증을 허용 가장 실험적으로 다루기 쉬운 동물 모델 중 하나입니다.
우리는 culturing에 대한 프로토콜을 설명하고 C의 형광 변종을 분배 화학 라이브러리 또는 특정 유전자의 표현을 변경할 환경 오염 물질의 검출에 높은 처리량 검사 엘레간스. 발달 동기 웜의 큰 번호, 액체 문화에 재배 수확, 씻어, 그리고 정의 밀도에서 중단됩니다. 웜는 다음 연동 액체 디스펜서를 사용하여 검정, 평평한 바닥 384 잘 접시에 추가됩니다. 화학 라이브러리 또는 테스트 샘플 (예, 물, 음식, 또는 토양)에서 작은 분자는 벌레와 우물에 추가할 수 있습니다. 생체내에서 실시간 형광 강도가 형광 microplate 판독기로 측정됩니다. 이 방법은 C.에 inducible 유전자에 적용할 수 있습니다 적당한 기자 사용할 수있는 엘레간스. 많은 inducible의 스트레스와 발달 transcriptional 경로는 잘 C.에 정의되어 있습니다 엘레간스와 GFP 유전자 변형 기자의 종자는 이미 4 많은 존재합니다. 적절한 형질 기자와 함께하면, 우리의 방법은 경로의 모듈 레이터를위한 화면이나 환경 오염에 대한 강력한 바이오 센서 assays을 개발하는 데 사용할 수 있습니다.
우리는 C를 증명 엘레간스 문화와 분배 프로토콜은 HTS 분석과 함께 우리는 C를 모니터하기 위해 개발된 엘레간스 모자 'N'칼라 전사 인자 SKN - 1. SKN - 1과 포유류의 homologue의 Nrf2 5-10 산화 스트레스와 생체 이물 중 cytoprotective 유전자를 활성화해야합니다. Nrf2는 암, neurodegeneration, 그리고 만성 염증과 같은 다양한 연령과 관련된 질환에서 포유류를 보호하고 주요 chemotherapeutic 대상 11-13되고있다. 우리의 분석은 -4 SKN - 1 대상 유전자 GST 14 GFP 유전자 변형 기자를 기반으로, 이것은 글루타티온 - S transferase 6 인코딩합니다. GST -4 기자도 SKN - 1을 활성화 및 아크릴 아미드와 메틸 수은과 같은 오염 물질의 15-16 낮은 수준을 감지하는 데 사용할 수있는 생체 이물 및 산화 화학 바이오 센서이다.
Protocol
1. 박테리아 웜 음식 준비
1 일
- 포화 E. 5 ML 추가 대장균 박테리아 OP50 문화 500 ML 끝내주는 국물은 50 μg / ML 스트렙토 마이신과 보충 37에 떨고 인큐베이터 (225 RPM) 숙박 성장 ° C.
날 2
- 20 분 동안 2,500 RCF에서 냉장 원심 분리기에서 만 50 ML 튜브 및 원심 분리기 박테리아에 하루 박테리아 문화를 분할.
- LB의 국물에서 가만히 따르다 액체 선충류의 성장 미디어 (NGM)의 10 ML 각 박테리아 펠렛을 resuspend. 박테리아를 resuspend 15 분 동안 바닥 통에 수평으로 흔들어. NGM 버퍼를 만들려면, 1 패 탈이온수 및 압력솥에 3g NaCl를 추가합니다. 55 쿨 ° C 및 주문에 다음 멸균 솔루션을 추가 : 1 M CaCl 2, 1 M MgSO 4 개 중 1 개 ML, 1 M의 칼륨 나트륨, 산도 6.0의 25 ML 1 ML합니다.
- 20 분 동안 2,500 RCF에서 냉장 원심 분리기에 박테리아 문화를 원심 분리기.
- NGM 버퍼에서 가만히 따르다 및 박테리아 펠렛의 무게.
- 산탄, 나누어지는 박테리아 3 ML -20 15 ML 튜브, 그리고 가게에 집중 ° C.를 resuspend하는 NGM 버퍼의 동일한 볼륨 추가
2. 대규모 C. 엘레간스 액체 문화
우리는 유전자 변형 라인을 사용 VP596 (dvIs19 [pAF15 (GST - 4 : GFP : : NLS)]; vsIs33 [dop - 3 : RFP]) 2 형광 구성 운반 : SKN - 1을 모니터링하는 GFP 14 : Pgst -4를 : 활동 및 Pdop - 3 : RFP 17 웜 번호 정상화를위한 표준으로 제공합니다.
1 일
- 150 ML NGM 버퍼, 1.5 ML의 LB의 국물, 5 MG / ML 콜레스테롤 150 μl (에탄올)을, 100 MG / ML 스트렙토 마이신의 75 μl를 섞는다. 혼합 필터 - 소독 및 멸균 1리터 플라스크에 추가할 수 있습니다.
참고 : NGM 버퍼에 1 % LB의 국물을 추가하는 것이 유리하고 plasticware에 고집에서 벌레를 방지하는 데 도움이 있지만,이 금액은 박테리아의 성장을 지원하기 위해 충분하지 않습니다. - 표준 염소산 절차 18 벌레를 동기화할 수 있습니다. 최대 gravid 웜 0.5 ML에이 염소산 솔루션 5 ML (3.75 ML 멸균 물 1 ML 가정용 표백제, 250 μl 10 N NaOH)과 하나의 15 ML 튜브에서 처리할 수 있습니다. 멸균 물 출시 달걀을 씻고 NGM 버퍼 10 ML 그들을 resuspend.
- 계란 NGM 버퍼 100 배 (예, 10 ML 100 μl)의 샘플을 희석 세 별도 5 μl aliquots에 달걀의 개수를 계산합니다. 여러 200,000 (100 희석 요인이 X 2,000)의 평균 숫자는 계란의 총 수를 측정합니다.
- NGM 버퍼와 술병에 200,000에 2,000,000 계란 추가 20 100 RPM에서 문화를 흔들 ° C.
날 2
- 적어도 16 H 술병에 달걀을 추가한 후, 정지 웜 문화의 약 0.5 ML를 제거하는 살균 serological pipet을 사용합니다. 페트리 접시의 멸균 뚜껑에 Pipet 세 5 μl 방울. 벌레를 마비로 1~2분위한 -20 ° C의 냉장고에서 뚜껑을 놓습니다. 부화 웜의 총 수를 추정 30000 (150 ML / 5 μl) 5 μl를 여러 당 사는 부화 웜의 평균 개수를 계산합니다.
- 냉동 OP50 세균성 문화 (프로토콜 1.6)의 튜브를 해동하고 500,000 부화 웜 당 웜 문화에 50% OP50 3 ML를 추가합니다. 20 100 RPM에서 술병을 흔들어 ° C. 웜이 대략 51 시간 L4 유충 젊은 성인으로 개발할 것입니다. 박테리아의 OD600 처음에 2.200에 대해해야합니다. 흡광도에 의해 박테리아의 양을 모니터링하여 OD 600 이하 0.900에 떨어뜨리면 더 추가합니다.
3. 웜 수집 및 분배
일 사
- 표준 NGM의 한천 플레이트에 정지 웜 문화의 약 0.5 ML를 전송하는 살균 serological pipet을 사용합니다. 대부분의 L4 유충이나 젊은 성인되었는지 확인하기 위해 stereomicroscope있는 벌레를 볼 수 있습니다. L4 유충은 신체의 중앙에 복부 분명 자리를합니다. 청소년 약간 크고 분명 자리를 없을 것입니다.
- 무균 50 ML 튜브에 웜 문화를 붓고하고 benchtop에서 테스트 튜브 랙에 튜브를 놓으십시오. 웜은 약 10 분 동안 정착을 허용합니다. 흡인이나 pipetting하여 표면에 뜨는를 제거합니다.
참고 : 그들이 느린보다 L4 유충 젊은 성인을 해결하기 때문에이 단계는 안깐 계란이나 개발하지 않았 웜을 제거하는 것이 중요합니다. - 1 % LB의 국물 (NGM + LB) 박테리아를 제거하는 3-4 회와 NGM 버퍼와 단일 50 ML 튜브 및 세척에 모든 벌레를 수집합니다.
참고 : 이것은 최고 30 초 500 RCF에서 벌레를 수집하고 신선한 NGM + LB 버퍼로 뜨는을 대체하여 스윙 - 양동이 원심 분리기에서 이루어집니다. - 세척 후, 50 ML에 + NGM와 LB 버퍼를 튜브를 작성 및 사용자 정의 벌레 분배 플라스크에 붓는다. 작은 저어 표시줄을 추가하고 벌레가 정지 계속 저어. 일 카운트세 5 μl 방울의 벌레의 전자 번호는 위에서 지적했다. 당신이 5 μl 드롭 (~ 2.5-3.0 웜 / μl) 당 12-15 벌레를 얻을 때까지 NGM + LB로 희석.
참고 : 20 ML (60,000 웜)의 최소 분배 술병과 디스펜서 카세트 죽음의 공간을 채우기 위해 필요합니다. 각 384 잘 플레이트는 약 35,000 웜 또는 중지 웜의 11.5 ML이 필요합니다. - 10 μl 분배 카세트를로드하고 70 % 에탄올과 프라이밍하여 소독. 멸균 물을 마중물하여 에탄올을 씻어.
- 단지 그 움직임을 방해하지 않고 교도소 표시줄 위에 있도록 술병에 분배 카세트의 끝에 삽입합니다. 벌레가 전체 술병에 걸쳐 중단 남아 있는지 확인합니다. 프로그램 디스펜서 2 사전 펄스 낮은 속도로 분배합니다. 프라임 및 정지 웜 중 적어도 10 ML을 실행합니다. 튜브에 정착에서 벌레를 방지하기 위해 신속하게 필요한 번호판을 입력합니다.
- 숨 테이프로 번호판을 밀봉합니다.
- 귀하의 분석에 적합한 온도 인큐베이터에서 흔들림 플랫폼에서 접시를 놓습니다. 접시를 쌓아하지 마십시오.
4. 형광 분석
- 적절한 방출 및 여기 파장 (; RFP 540/25ex 590/35em GFP 485/20ex 528/20em 우리의 분석을위한 필터)와 각 우물의 형광 강도를 측정하기위한 microplate 판독기에 대상 접시를 놓습니다.
- GFP / RFP의 비율을 계산하고 개별 치료에서 파생 형광 강도의 정확한 배 차이를 결정하는 제어 우물 (활성화 화합물 제외)의 수치로 정상화.
5. 대표 결과 :
우리 SKN - 1 검정은 chromosomally 통합 듀얼 기자 변형 (VP596)를 사용합니다. 그림 1에서와 같이, 웜의 숫자가 잘 적절 볼륨에 상관 있습니다. 뿐만 아니라 당 그림 2A와 2B, 총 GFP 및 RFP 형광을 표시하는 것은 우물에서 384 잘 접시에 잘 걸쳐 매우 재현할 수 있습니다. 384 우물에 걸쳐 RFP : GFP 형광은 선형 Pdop - 3 상호는 :으로 취소 유발 Pgst - 4 그림 2C에 표시됩니다. : 다양성을 줄이기 위해 RFP 기자 : GFP / RFP의 비율로 표현하면, 형광은 Pdop - 3의 능력을 보여주는 384 잘 접시 (2A에 2D 그림에서 변이 계수를 비교)에 걸쳐 우물에서 잘 고도로 재현할됩니다. 그림 3과 RFP에 GFP의 상대의 유도에 표시된 SKN - 1 생체 이물 활성화가 (38 μm의 juglone) 강력하고 384 잘 접시에 걸쳐 고도로 재현할 수있다.
그림 1. 볼륨 대 벌레 수시키지. 웜 약 2/μl로 희석하고 stereomicroscope와 함께 수동으로 계산을위한 24 잘 접시에 적절했다. N 볼륨 당 = 8 웰스.
그림 2. 384 잘 접시에 적절 웜 총 형광 다시 재현할 수 있습니다. 웜가 약 2.5/μl 30 μl에 희석되었습니다 것은 384 자 판 매 자로 적절했다. 모든 웰스의 GFP (A)와 RFP (B) 형광 9 % 이하의 유사 계수를했다. (C) GFP 형광은 매우 RFP 형광을 서로 관련됩니다. (D) RFP에 GFP의 비율을 계산하면 6% 아래 편차의 계수를 감소 (A, B, 및 D) 고체 라인 수단을 표시하고 깨진 라인이 3 개의 표준 편차 평균 위 또는 아래를 나타냅니다.
. Pgst - 4 그림 3 활성화 : GFP는 강력하고 일관성이다. 약 75 L4 벌레가 384 잘 접시와 38 μm의의 juglone의 모든 우물에 적절했다하는 것은 다른 모든 항목에 추가되었습니다. GFP 및 RFP 형광은 부화 21 H 후에 측정되었다. 말은 상대 형광 모든 컨트롤의 비율 (1.0)와 juglone 웰스 (8.9)은 고체 라인으로 표시됩니다. 컨트롤 위에 3 개의 표준 편차 뜻과 의미 juglone 아래 깨진 라인으로 표시됩니다.
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Discussion
우리는 culturing위한 방법을 제시하고 유전자 변형 nematodes 많은 숫자를 분배. culturing 벌레에 사용되는 장비는 분자 복제를 수행 실험실을위한 표준이며, 액체 처리 및 형광 장비 microplates 많은 숫자를 처리 실험실에 대한 표준입니다. 라이브 C. 다수의 분배의 다른 방법 엘레간스 장비 19 정렬 비싼 입자가 필요합니다. Pgst - 4 : GFP 분석은 뚜껑 'N'칼라 전사 요소의 작은 분자 변조기를위한 화면으로, 환경 및 식품 시료 14,16의 생체 이물 및 산화제 오염 물질을 감지하는 데 사용할 수 있습니다. 강력한 inducible 유전자 변형 GFP 기자는 경로 및 환경 자극 4 넓은 범위에서 사용할 수 있으며, 따라서 우리의 방법은 여러 경로의 개발 모듈 레이터에 적용되어야하며 오염 물질의 광범위한 스펙트럼을 감지합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
C. 엘레간스 transgenes은 Caenorhabditis 유전학 센터 (미네소타, 미네 아 폴리스 대학, MN)에 의해 제공되었다. 이 작품은 NIH R21 부여 KS로 NS0667678 - 01에 의해 지원되었다. 모든 저자는 수집, 분석 및 데이터 해석에 참가했습니다. CKL, KS 및 KPC는 원고를 작성하고 수정에 참여했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB broth | Research Products International Corp. | L24066 | |
| Terrific broth | Research Products International Corp. | T15100 | |
| Synergy HT Multi-mode Microplate Reader | BioTek | Filters: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em | |
| MicroFlo Select Dispenser | BioTek | ||
| Worm dispensing flask | Southern Scientific Inc., Micanopy, FL | Custom assembled(352) 284-2531 | |
| 384 microplates | Greiner Bio-One | 5678-1209 | |
| Breathable sealing tape | Nalge Nunc international | 241205 | |
| (5-hydroxy-p-naphthoqinone)Juglone | Acros Organics | 121640010 | Juglone is dissolved in DMSO |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| C. elegans transgenic strain | Author’s laboratory | VP596 | Pgst-4::GFP and Pdop-3::RFP |
References
- Simeonov, A. Quantitative high-throughput screen identifies inhibitors of the Schistosoma mansoni redox cascade. PLoS Negl Trop Dis. 2, e127-e127 (2008).
- Giacomotto, J., Segalat, L. High-throughput screening and small animal models, where are we. Br J Pharmacol. 160, 204-216 (2010).
- Artal-Sanz, M., de Jong, L., Tavernarakis, N. Caenorhabditis elegans: a versatile platform for drug discovery. Biotechnol J. 1, 1405-1418 (2006).
- WormBase [Internet]. , Available from: http://www.wormbase.org (2012).
- An, J. H., Blackwell, T. K. SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response. Genes Dev. 17, 1882-1893 (2003).
- Choe, K., Przybysz, A., Strange, K. The WD40 repeat protein WDR-23 functions with the CUL4/DDB1 ubiquitin ligase to regulate nuclear abundance and activity of SKN-1 in Caenorhabditis elegans. Mol Cell Biol. 29, 2704-2715 (2009).
- Hasegawa, K. Acrylamide-responsive genes in the nematode Caenorhabditis elegans. Toxicol. Sci. 101, 215-225 (2008).
- Tullet, J. M. A. Direct inhibition of the longevity-promoting factor SKN-1 by insulin-like signaling in C. elegans. Cell. 132, 1025-1038 (2008).
- Oliveira, R. P. Condition-adapted stress and longevity gene regulation by Caenorhabditis elegans SKN-1/Nrf. Aging Cell. , Forthcoming (2009).
- Park, S. -K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1. Aging Cell. 8, 258-269 (2009).
- Hayes, J. D., McMahon, M., Chowdhry, S., Dinkova-Kostova, A. T. Cancer chemoprevention mechanisms mediated through the Keap1-Nrf2 pathway. Antioxid Redox Signal. , (2010).
- Kwak, M. K., Kensler, T. W. Targeting NRF2 signaling for cancer chemoprevention. Toxicol Appl Pharmacol. 244, 66-76 (2010).
- Leiser, S. F., Miller, R. A. Nrf2 signaling, a mechanism for cellular stress resistance in long-lived mice. Mol Cell Biol. 30, 871-884 (2010).
- Link, C. D., Johnson, C. J. Reporter transgenes for study of oxidant stress in Caenorhabditis elegans. Methods Enzymol. 353, 497-505 (2002).
- Vanduyn, N., Settivari, R., Wong, G., Nass, R. SKN-1/Nrf2 inhibits dopamine neuron degeneration in a Caenorhabditis elegans model of methylmercury toxicity. Toxicol Sci. , (2010).
- Hasegawa, K. A rapid and inexpensive method to screen for common foods that reduce the action of acrylamide, a harmful substance in food. Toxicol Lett. 175, 82-88 (2007).
- Chase, D. L., Pepper, J. S., Koelle, M. R. Mechanism of extrasynaptic dopamine signaling in Caenorhabditis elegans. Nature Neuroscience. 7, 1096-1103 (2004).
- Hope, I. A. C. elegans, a Practical Guide. , Oxford University Press. (2005).
- Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. Methods Mol Biol. 351, 275-286 (2006).
