Summary
液体ベースの培養および調剤のための手順
Abstract
ハイスループットスクリーニング（HTS）は、生物学的プロセスの化学的モジュレーターを同定するための強力なアプローチです。しかし、細胞培養モデルを使用して画面で識別される多くの化合物はしばしば生体 1-2 の毒性または薬理学的に不活性であることがわかっている。全体の動物モデルでのスクリーニングは、これらの落とし穴を回避し、薬剤開発へのパスを効率化できます。
C. elegansはよくHTSに適した多細胞モデル生物です。それは小さい（<1 mm）と経済的に培養し、液体中で省略することができる。C.は虫はまた、薬物モードのアクション3の迅速かつ詳細な識別を可能にする最も実験的に扱いやすい動物モデルの一つです。
我々は、培養のためのプロトコルを記述し、Cの蛍光菌株を分注する化合物ライブラリーまたは特定の遺伝子の発現を変化させる環境汚染物質の検出のハイスループットスクリーニングのためのエレガンス 。発達同期ワームの多数は、液体培養で増殖収穫、洗浄、および定義された密度で懸濁する。ワームはその後、蠕動液体ディスペンサーを使用して黒、平底の384ウェルプレートに追加されます。化学物質のライブラリまたは試験サンプル（例えば、水、食物、または土壌）からの小分子は、ワームとのウェルに添加することができます。 生体内では 、リアルタイムの蛍光強度を蛍光マイクロプレートリーダーで測定される。このメソッドは 、Cの任意の誘導性遺伝子に適合させることができます適切なレポーターが使用可能なエレガンス 。多くの誘導性ストレスと発達転写経路はよくCで定義されています。 虫とGFPトランスジェニックレポーター株は、すでにその4の多くのために存在する。適切なトランスジェニック記者と組み合わせることで、私たちの手法は、経路の調節因子をスクリーニングするか、環境汚染物質のための堅牢なバイオアッセイを開発するために使用することができます。
私たちは、Cを示しています虫の文化と我々はCを監視するために開発されたHTSアッセイと調剤プロトコル虫キャップ'N'カラー転写因子SKN - 1。 SKN - 1とその哺乳類ホモログのNRF2は5-10酸化や生体異物のストレス時の細胞保護遺伝子を活性化する。 NRF2は、がん、神経変性疾患、および慢性炎症のような多数の加齢に伴う障害から哺乳類を保護し、主要な化学療法の標的11から13になっています。私たちのアッセイを-4 SKN - 1の標的遺伝子GST 14のGFPトランスジェニックレポーターに基づいて、これは、グルタチオン- Sトランスフェラーゼ6をエンコードします。 GST -4記者はまた、SKN - 1を活性化し、そのようなアクリルアミドとメチル水銀15から16のような汚染物質の低レベルを検出するために使用できる生体異物と酸化的化学物質のバイオセンサーです。
Protocol
1。細菌ワームの食品の調製
日1
- 飽和E. 5 mlを加え大腸菌 OP50細菌培養に500ミリリットルのTerrificブロス50μg/ mlのストレプトマイシンを補充し、37℃で振盪インキュベーター（225 rpm）で一晩で成長℃の
日2
- 20分2,500 rcfで冷却遠心機で10 50mlチューブと遠心分離機の細菌に一晩細菌培養を分割する。
- LBブロスからデカントし、液体の線虫の増殖培地（NGM）の10mlにそれぞれの細菌のペレットを再懸濁します。細菌を懸濁するために15分間床シェーカーに水平に振る。 NGMバッファを作成するには、1リットルの脱イオン水とオートクレーブに3グラムのNaClを加える。 55℃まで冷却し、ために、以下の滅菌溶液を追加する：1 M CaCl 2で 、1 M MgSO 4を 1 mlの、そして1 Mリン酸カリウム、pH6.0の25mlのを1ml。
- 20分2,500 rcfで冷却遠心機で細菌培養を遠心分離します。
- NGMのバッファoffデカントし、細菌ペレットの重量を量る。
- 、ペレットを再懸濁させるNGM等量のバッファーを追加して細菌のアリコートを3ミリリットル、15 mlチューブに集中し、-20℃で保存します。
2。大規模C. elegansの液体培養
我々はトランスジェニックラインを使用VP596（dvIs19 [pAF15（GST - 4：：GFP：：NLS）]; vsIs33 [DOP - 3：：RFP]）は、2つの蛍光構造運ん：SKN - 1を監視するためにGFP 14：Pgst -4：活動とPDOP - 3：：RFP 17ワームの数の正規化のための標準として機能する。
日1
- 150ミリリットルNGMバッファー、1.5 mlのLBブロス、5 mg / mlのコレステロールを150μl（エタノール）、および100 mg / mlストレプトマイシンの75μlを混合します。混合物をろ過滅菌し、1リットル無菌フラスコに加える。
注記：NGMバッファに1％のLBブロスを追加すると、ガラス器具やプラスチック容器に付着するのワームを防ぐのに役立ちますが、この量はバクテリアの成長をサポートするのに十分ではない。 - 標準的な次亜塩素酸の手順18でワームを同期させます。まで妊娠ワームの0.5mlには次亜塩素酸溶液5ml（3.75ミリリットル滅菌水、1mlの家庭用漂白剤、および250μlの10NのNaOH）でシングル15 mlチューブで処理することができます。滅菌水でリリースされた卵を洗うとNGMの緩衝液10mlに再懸濁します。
- 卵NGMバッファーで100倍（例えば、10ml中の100μlの）のサンプルを希釈し、3つの独立した5μlのアリコートで卵の数を数えます。卵の総数を推定するために20万の平均数（100希釈率× 2,000）、複数の。
- NGMのバッファ付きフラスコに20万〜200万の卵を追加し、20℃100rpmで振とう培養℃に
日2
- フラスコに卵を追加した後、少なくとも16時間、中断されたワームの文化の約0.5 mlを削除するには、無菌の血清学的ピペットを使用してください。ペトリ皿の滅菌蓋の上にピペットで3つの5μlの滴。ワームを麻痺させる1〜2分間-20℃の冷凍庫にふたをする。孵化したワームの総数を推定するために30,000（150ミリリットル/ 5μl）を、5μlとし、複数の当たりのライブ孵化ワームの平均数を数える。
- 冷凍OP50細菌培養（議定書1.6）のチューブを融解、500,000斜線ワームあたりワームの文化に50パーセントOP50の3 mlを加える。 20℃で100rpmで振とうフラスコ℃をワームは、約51時間でL4幼虫や若い成人に発展する。細菌のOD600は、先頭に2.200程度にする必要があります。吸光度による細菌の量を監視し、OD 600が0.900を下回る場合は、よりを追加。
3。ワームの収集及び調剤
日4
- 標準NGM寒天培地にサスペンドワームの文化の約0.5 mlを転送するために滅菌血清ピペットを使用してください。ほとんどがL4幼虫や若い成人であることを確認するために実体顕微鏡でワームを見る。 L4幼虫は、体の真ん中で腹明確なスポットを持つことになります。若年成人は、わずかに大きく、明確なスポットを持っていないこととなります。
- 滅菌50 mlのチューブにワームの文化を注ぎ、ベンチ上で試験管ラックにチューブを置きます。ワームは、約10分間静することができます。吸引またはピペットで上清を取り除きます。
注：この手順は、彼らはL4幼虫や若い成人よりも遅い解決するため、開発していない卵からかえっていない卵やワームを除去することが重要になることができます。 - 単一の50 mlチューブに、すべてのワームを収集し、細菌を除去するために1％のLBブロス（NGM + LB）で3〜4回NGMバッファーで洗浄する。
注記：これは最高の30秒間に500 rcfで、ワームを収集し、新鮮なNGM + LBバッファーで上清を置き換えることにより、スイングローター遠心機で行われます。 - 洗浄後、50mlに+ NGMとLBのバッファーをチューブに充填し、カスタムワーム調剤フラスコに注ぐ。小さな攪拌棒を追加し、ワームが一時停止を維持するためにかき混ぜる。目を数える上に示した3つの5μlの滴のワームの電子の数。あなたが5μlの降下（約2.5〜3.0ワーム/μL）あたり12月15日ワームを得るまでNGM + LBで希釈する。
注記：約20ml（60,000ワーム）の最小値は、調剤フラスコとディスペンサーカセットのデッドスペースを埋めるために必要とされる。各384ウェルプレートは、約35,000ワームやサスペンドワームの11.5 mlを必要とします。 - 10μlの調剤カセットをロードし、70％エタノールでプライミングによって滅菌する。滅菌水でプライミングによってエタノールをすすいでください。
- それだけでその動きを中断することなく、攪拌棒の上になるようにフラスコに分注カセットの端を差し込みます。ワームが全体フラスコを通して中断されたままにいることを確認してください。 2プリパルスで低速度で分配するようにプログラムディスペンサー。素数とは、一時停止ワームの少なくとも10 mlを実行します。チューブにセトリングからワームを防ぐために迅速に、必要に応じてプレートを埋める。
- 通気性のテープでプレートをシールします。
- あなたのアッセイのための適切な温度でインキュベーター内で振とう台にプレートを置きます。プレートを積み重ねないでください。
4。蛍光分析
- 適切な発光と励起波長（：; RFP 540/25ex 590/35em GFP 485/20ex 528/20em私たちのアッセイのためのフィルタ）で各ウェルの蛍光強度を測定するためにマイクロプレートリーダーにターゲットプレートを置きます。
- GFP / RFPの比を計算し、個々の治療に由来する蛍光強度の正確な倍の差を決定するために対照ウェル（活性化化合物なし）の測定値で正規化する。
5。代表的な結果：
私たちのSKN - 1アッセイは、染色体に統合されたデュアルレポーター株（VP596）を使用しています。図1に示すように、ワームの数は、よく分注されたボリュームに相関している。図2Aおよび2Bに示すように、ウェルあたりの総GFPとRFPの蛍光は十分によく384ウェルプレート全体から高い再現性です。などの非誘導Pgst - 4、図2Cに示すように：：GFPの蛍光は、直線的にPDOP - 3と相関している：：384ウェル間のRFP。 ：ばらつきを低減するためのRFPレポーター：GFP / RFPの比として表現したとき、蛍光はPDOP - 3の能力を示す384ウェルプレート（図2Dから2Aへの係数の変化を比較する）を介してウェルからウェルに高い再現性となる。図3に示すように、SKN - 1生体異物活性化（38μMjuglone）とRFPに対する相対的なGFPの誘導は、堅牢で384ウェルプレートで高い再現性です。
図1。ボリュームに対するワームの数は、分注した。ワームは、約2/μlに希釈し、実体顕微鏡とマニュアルカウントのための24ウェルプレートに分注していた。体積当たりN = 8井戸。
図2は、384ウェルプレートに分注されたワームの総蛍光は再現可能です。ワームは、約2.5/μl、30μlに希釈し、384ウェルプレートの各ウェルに分注した。すべてのウェルのGFP（A）とRFP（B）蛍光は、9％以下の変動係数を持っていた。 （C）GFP蛍光は非常にRFP蛍光相関している。 （D）RFPにGFPの比率を計算するには、下記の6％に変動係数を減少させた（A、B、およびD）実線は、手段を示し、破線は平均値の上または下にある3つの標準偏差を示している。
。Pgst - 4の図3の活性化：：GFPは、堅牢で一貫性です。約75 L4ワームは、384ウェルプレートの全ウェルに分配され、38μMのjugloneは、他のすべての列に追加されました。 GFPとRFPの蛍光はインキュベーションの21時間後に測定した。すべてのコントロール（1.0）とjuglone井戸（8.9）の平均相対蛍光比を実線でマークされます。コントロール上の3つの標準偏差は意味とjuglone平均より破線でマークされます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
我々は、培養する方法を提示し、トランスジェニック線虫の多数を調剤。培養のワームに使用される機器は、分子のクローニングを行う検査室の標準であり、液体のハンドリングと蛍光装置は、マイクロプレートを大量に処理する研究室の標準です。ライブC.多数の調剤の他の方法虫は、機器19をソートする高価な粒子が必要です。 Pgst - 4：：GFPアッセイは、キャップ'n'をカラー転写因子の小分子モジュレーターをスクリーニングするために、環境や食品試料14,16の生体異物と酸化剤の汚染物質を検出するために使用することができます。堅牢な誘導性トランスジェニックGFPレポーターは、経路と環境刺激4の広い範囲で利用可能であるため、本手法は、多くの経路の開発変調器への適用可能でなければならず、汚染物質の広いスペクトルを検出する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
C. elegansの導入遺伝子は線虫遺伝学センター（ミネソタ大学、ミネアポリス、ミネソタ州）から提供された。この作品は、NIHのR21グラントKSへNS0667678 - 01によってサポートされていました。すべての著者は、収集、分析、およびデータの解釈にも参加。 CKL、KS、およびKPCは、原稿を書いたり、改訂に参加した。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB broth | Research Products International Corp. | L24066 | |
| Terrific broth | Research Products International Corp. | T15100 | |
| Synergy HT Multi-mode Microplate Reader | BioTek | Filters: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em | |
| MicroFlo Select Dispenser | BioTek | ||
| Worm dispensing flask | Southern Scientific Inc., Micanopy, FL | Custom assembled(352) 284-2531 | |
| 384 microplates | Greiner Bio-One | 5678-1209 | |
| Breathable sealing tape | Nalge Nunc international | 241205 | |
| (5-hydroxy-p-naphthoqinone)Juglone | Acros Organics | 121640010 | Juglone is dissolved in DMSO |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| C. elegans transgenic strain | Author’s laboratory | VP596 | Pgst-4::GFP and Pdop-3::RFP |
References
- Simeonov, A. Quantitative high-throughput screen identifies inhibitors of the Schistosoma mansoni redox cascade. PLoS Negl Trop Dis. 2, e127-e127 (2008).
- Giacomotto, J., Segalat, L. High-throughput screening and small animal models, where are we. Br J Pharmacol. 160, 204-216 (2010).
- Artal-Sanz, M., de Jong, L., Tavernarakis, N. Caenorhabditis elegans: a versatile platform for drug discovery. Biotechnol J. 1, 1405-1418 (2006).
- WormBase [Internet]. , Available from: http://www.wormbase.org (2012).
- An, J. H., Blackwell, T. K. SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response. Genes Dev. 17, 1882-1893 (2003).
- Choe, K., Przybysz, A., Strange, K. The WD40 repeat protein WDR-23 functions with the CUL4/DDB1 ubiquitin ligase to regulate nuclear abundance and activity of SKN-1 in Caenorhabditis elegans. Mol Cell Biol. 29, 2704-2715 (2009).
- Hasegawa, K. Acrylamide-responsive genes in the nematode Caenorhabditis elegans. Toxicol. Sci. 101, 215-225 (2008).
- Tullet, J. M. A. Direct inhibition of the longevity-promoting factor SKN-1 by insulin-like signaling in C. elegans. Cell. 132, 1025-1038 (2008).
- Oliveira, R. P. Condition-adapted stress and longevity gene regulation by Caenorhabditis elegans SKN-1/Nrf. Aging Cell. , Forthcoming (2009).
- Park, S. -K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1. Aging Cell. 8, 258-269 (2009).
- Hayes, J. D., McMahon, M., Chowdhry, S., Dinkova-Kostova, A. T. Cancer chemoprevention mechanisms mediated through the Keap1-Nrf2 pathway. Antioxid Redox Signal. , (2010).
- Kwak, M. K., Kensler, T. W. Targeting NRF2 signaling for cancer chemoprevention. Toxicol Appl Pharmacol. 244, 66-76 (2010).
- Leiser, S. F., Miller, R. A. Nrf2 signaling, a mechanism for cellular stress resistance in long-lived mice. Mol Cell Biol. 30, 871-884 (2010).
- Link, C. D., Johnson, C. J. Reporter transgenes for study of oxidant stress in Caenorhabditis elegans. Methods Enzymol. 353, 497-505 (2002).
- Vanduyn, N., Settivari, R., Wong, G., Nass, R. SKN-1/Nrf2 inhibits dopamine neuron degeneration in a Caenorhabditis elegans model of methylmercury toxicity. Toxicol Sci. , (2010).
- Hasegawa, K. A rapid and inexpensive method to screen for common foods that reduce the action of acrylamide, a harmful substance in food. Toxicol Lett. 175, 82-88 (2007).
- Chase, D. L., Pepper, J. S., Koelle, M. R. Mechanism of extrasynaptic dopamine signaling in Caenorhabditis elegans. Nature Neuroscience. 7, 1096-1103 (2004).
- Hope, I. A. C. elegans, a Practical Guide. , Oxford University Press. (2005).
- Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. Methods Mol Biol. 351, 275-286 (2006).
