Summary
Una procedura per liquidi a base di coltura e distribuzione dei
Abstract
High-throughput screening (HTS) è un approccio potente per identificare modulatori chimici dei processi biologici. Tuttavia, molti composti identificati nel schermi utilizzando modelli di coltura cellulare si trovano spesso ad essere tossici o farmacologicamente attive in vivo 1-2. Lo screening in modelli animali tutto può aiutare ad evitare queste trappole e semplificare il percorso per lo sviluppo di farmaci.
C. elegans è un organismo pluricellulare modello adatto per HTS. Si tratta di piccole dimensioni (<1 mm) e può essere economicamente colto e dispensati in liquidi. C. elegans è anche uno dei modelli animali più docili sperimentalmente che consentono la determinazione rapida e dettagliata dei farmaci modalità d'azione 3.
Abbiamo descritto un protocollo per la coltura e l'erogazione ceppi fluorescenti di C. elegans per high-throughput screening di librerie chimiche o rilevamento di contaminanti ambientali che alterano l'espressione di un gene specifico. Un gran numero di vermi evolutivamente sincronizzati sono cresciuti in coltura liquida, raccolte, lavate, e sospeso ad una densità definita. I worm sono poi aggiunti al nero, dal fondo piatto a 384 pozzetti utilizzando un dosatore peristaltico liquido. Piccole molecole da una biblioteca chimica o campioni (per esempio, acqua, cibo, o suolo) possono essere aggiunti ai pozzetti con i vermi. In vivo, in tempo reale intensità di fluorescenza viene misurata con un lettore di fluorescenza per micropiastre. Questo metodo può essere adattato a qualsiasi gene inducibile in C. elegans per i quali un giornalista idonei. Lo stress inducibile molti e di sviluppo percorsi trascrizionale sono ben definiti in C. elegans GFP e reporter di ceppi transgenici esistono già per molti di loro 4. Quando combinato con i giornalisti appropriato transgenico, il nostro metodo può essere usato per individuare modulatori percorso o per sviluppare robuste analisi biosensore per i contaminanti ambientali.
Dimostriamo il nostro C. elegans, la cultura e la dispensazione di protocollo con un dosaggio HTS abbiamo sviluppato per monitorare la C. trascrizione elegans cap 'n' fattore collare SKN-1. SKN-1 e il suo omologo di mammifero Nrf2 attivare i geni citoprotettivo durante lo stress ossidativo e xenobiotici 5-10. Nrf2 mammiferi protegge da numerose malattie legate all'età come il cancro, neurodegenerazione, e l'infiammazione cronica ed è diventato uno dei principali bersagli chemioterapici 11-13. La nostra analisi si basa su un reporter GFP transgenico per il SKN-1 gene bersaglio -4 gst 14, che codifica per una glutatione s-transferasi 6. Il reporter gst -4 è anche un biosensore per le sostanze chimiche xenobiotiche e ossidativo che attivano SKN-1 e può essere utilizzato per rilevare i bassi livelli di contaminanti quali acrilamide e il metilmercurio 15-16.
Protocol
1. Preparazione dei cibi verme batterica
Giorno 1
- Aggiungere 5 ml di saturi E. coli OP50 coltura batterica di 500 ml di brodo Terrific integrata con 50 mg / ml di streptomicina e crescere in un incubatore agitazione (225 rpm) durante la notte a 37 ° C.
2 ° giorno
- Suddividere la cultura batterica durante la notte in dieci provette da 50 ml e batteri centrifuga in una centrifuga refrigerata a 2.500 rcf per 20 minuti.
- Decantare brodo LB e risospendere ogni pellet batterico in 10 ml di liquidi crescita nematode (NGM). Agitare orizzontalmente in un piano shaker per 15 minuti per risospendere i batteri. Per fare tampone NGM, aggiungere 3 g di NaCl a 1 L di acqua deionizzata e autoclave. Raffreddare a 55 ° C e aggiungere in ordine le seguenti soluzioni sterili: 1 ml di 1 M CaCl 2, 1 ml di 1 M MgSO 4, e 25 ml di 1 M di potassio fosfato, pH 6,0.
- Centrifugare la coltura batterica in una centrifuga refrigerata a 2.500 rcf per 20 minuti.
- Decantare il tampone in NGM e pesare il pellet batterico.
- Aggiungere un volume equivalente di tampone NGM per risospendere il pellet, aliquota 3 ml di concentrato di batteri in provette da 15 ml, e conservare a -20 ° C.
2. Su larga scala C. elegans coltura liquida
Noi usiamo una linea transgenica VP596 (dvIs19 [pAF15 (gst-4:: GFP:: NLS)]; vsIs33 [dop-3:: RFP]) portando due costrutti fluorescenti: Pgst -4:: GFP 14 a monitorare SKN-1 attività e PDOP-3:: RFP 17 a servire come standard per la normalizzazione verme numero.
Giorno 1
- Mescolare 150 ml NGM tampone, 1,5 ml di brodo LB, 150 ml di 5 mg / ml colesterolo (in etanolo), e 75 ml di 100 mg / ml di streptomicina. Filtro-sterilizzare la miscela e aggiungere in un matraccio 1 litro sterile.
NOTA: L'aggiunta di brodo LB 1% a tampone NGM aiuta a prevenire i vermi si attacchino al vetro e di plastica, ma questa somma non è sufficiente a sostenere la crescita dei batteri. - Sincronizzare i vermi con la procedura di ipoclorito di serie 18. Fino a 0,5 ml di vermi gravido possono essere elaborati in un unico tubo 15 ml con 5 ml di soluzione di ipoclorito (3,75 ml di acqua sterile, 1 ml di candeggina per uso domestico, e 250 microlitri 10 N NaOH). Lavare le uova rilasciato con acqua sterile e risospendere in 10 ml di tampone NGM.
- Diluire un campione delle uova a 100 volte in NGM tampone (ad esempio, 100 l in 10 ml) e contare il numero di uova in tre distinte aliquote 5 microlitri. Multiplo del numero medio da 200.000 (100 fattore di diluizione x 2.000) per stimare il numero totale di uova.
- Aggiungi 200.000 a 2 milioni di uova al pallone con il tampone NGM e agitare la cultura a 100 rpm a 20 ° C.
2 ° giorno
- Almeno 16 h dopo l'aggiunta di uova al pallone, usare una pipetta sterile sierologico per rimuovere circa 0,5 ml di cultura verme sospeso. Pipettare 5 gocce tre microlitri sul coperchio sterile di una piastra di Petri. Mettere il coperchio in un congelatore di -20 ° C per 1-2 minuti per paralizzare i vermi. Contare il numero medio di vivere vermi nati per 5 microlitri e poi più di 30.000 (150 ml / 5 microlitri) per stimare il numero totale di vermi nati.
- Scongelare un tubetto di surgelati OP50 coltura batterica (protocollo 1.6) e aggiungere 3 ml di 50% OP50 nella cultura verme vermi ogni 500.000 nati. Agitare il pallone a 100 rpm a 20 ° C. Worm si svilupperà in L4 e giovani adulti in circa 51 ore. L'OD600 di batteri dovrebbe essere di circa 2,200 all'inizio. Monitorare la quantità di batteri mediante assorbimento e aggiungere di più se il diametro esterno 600 scende al di sotto 0,900.
3. Worm raccolta e distribuzione
4 ° giorno
- Utilizzare una pipetta sterile sierologica per il trasferimento di circa 0,5 ml della cultura verme sospeso per una piastra standard agar NGM. Vedi i vermi con un stereomicroscopio per assicurarsi che la maggior parte sono L4 larve o giovani adulti. L4 avrà un posto ventrale chiara nel mezzo del corpo. I giovani adulti sarà leggermente più grande e non avrà un posto libero.
- Versare la cultura verme in sterili provette da 50 ml e posto i tubi in un rack provetta sul bancone. Lasciare che il worm decantare per circa 10 minuti. Eliminare il surnatante tramite aspirazione o pipettaggio.
NOTA: questo passaggio può essere importante per rimuovere le uova non schiuse o worm che non si è sviluppata perché si accontentano più lento di L4 e giovani adulti. - Raccogliere tutti i vermi in un unico tubo da 50 ml e lavare con tampone NGM con brodo LB 1% (NGM LB +) 3-4 volte a rimuovere i batteri.
NOTA: Questo è fatto meglio in un secchio oscillante-centrifuga attraverso la raccolta di vermi a 500 rcf per 30 secondi e sostituendo il surnatante con freschi NGM + buffer di LB. - Dopo il lavaggio, riempire il tubo con NGM + tampone LB a 50 ml e versare in una bottiglia verme personalizzate di erogazione. Aggiungere un piccolo bar mescolare e mescolare per mantenere i vermi sospeso. Conte °indirizzo e numero di worm in tre 5 gocce microlitri come sopra indicato. Diluire con LB NGM + fino ad ottenere 12-15 worm per 5 goccia microlitri (~ 2,5-3,0 worm / mL).
NOTA: un minimo di circa 20 ml (60.000 worm) è necessaria per riempire lo spazio morto del pallone di erogazione e cassetta dispenser. Ogni 384 pozzetti richiede circa 35.000 worm o 11,5 ml di vermi sospeso. - Carico di 10 microlitri cassetta di erogazione e sterilizzare in fondo con etanolo al 70%. Sciacquare l'etanolo da fondo con acqua sterile.
- Inserire l'estremità della cassetta di erogazione nel pallone in modo che sia appena sopra la barra di mescolare senza interrompere il suo movimento. Assicurarsi che il worm rimane sospeso per tutto il fiasco intero. Programmare il dispenser per erogare a bassa velocità con 2 pre-impulsi. Primo ed eseguire almeno 10 ml di vermi sospeso. Riempire le piastre in base alle esigenze rapidamente per evitare che i vermi da stabilirsi nel tubo.
- Sigillare i piatti con del nastro adesivo traspirante.
- Posizionare le piastre su una piattaforma di agitazione in un incubatore alla temperatura appropriata per la propria analisi. Non impilare i piatti.
4. Analisi di fluorescenza
- Posizionare la piastra segnale in un lettore di micropiastre per misurare l'intensità di fluorescenza di ogni bene con la lunghezza d'onda appropriata di emissione e di eccitazione (Filtri per i nostri test: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em).
- Calcolare il rapporto di GFP / RFP e normalizzare con le letture dei pozzi di controllo (senza attivare composto) per determinare la differenza esatta piega l'intensità di fluorescenza derivati da trattamenti individuali.
5. Rappresentante dei risultati:
Il nostro SKN-1 test utilizza un ceppo cromosomicamente integrato giornalista doppio (VP596). Come mostrato nella Figura 1, il numero di worm è ben correlata al volume erogato. Come mostrato nelle figure 2A e 2B, totale GFP e RFP fluorescenza per bene è altamente riproducibile da pozzetto a pozzetto su una piastra ben 384. Come mostrato nella Figura 2C, non-indotta Pgst-4:: GFP fluorescenza è linearmente correlata alla PDOP-3:: RFP attraverso 384 pozzetti. Se espresso come rapporto di GFP / RFP, fluorescenza diventa altamente riproducibili da pozzetto a pozzetto attraverso una piastra ben 384 (confrontare coefficiente di variazione dalla figura 2D a 2A) che dimostrano la capacità del PDOP-3:: reporter RFP per ridurre la variabilità. Come mostrato nella Figura 3, l'induzione di rispetto GFP a RFP con un SKN-1 attivazione xenobiotici (38 mM juglone) è robusto e altamente riproducibile su un piatto ben 384.
Figura 1. Numero di vermi rispetto al volume erogato. I worm sono stati diluiti a circa 2/μl e dispensati in un piatto ben 24 per il conteggio manuale con uno stereomicroscopio. N = 8 pozzetti per volume.
Figura 2. Fluorescenza totale di vermi dispensato in un piatto ben 384 è riproducibile. I worm sono stati diluiti a circa microlitri 2.5/μl e 30 è stato dispensato in tutti i pozzetti di una piastra ben 384. GFP (A) e RFP (B) fluorescenza di tutti i pozzetti aveva un coefficiente di variazione inferiore al 9%. (C) GFP fluorescenza è fortemente correlato alla RFP fluorescenza. (D) calcolo del rapporto tra GFP di RFP ridotto il coefficiente di variazione al di sotto del 6% (A, B e D) Le linee continue indicano i mezzi e le linee tratteggiate indicano tre deviazioni standard al di sopra o al di sotto della media.
. Figura 3 Attivazione di Pgst-4:: GFP è robusto e coerente. Circa il 75 L4 worm sono state erogate in tutti i pozzetti di una piastra ben 384 e 38 mM juglone è stato aggiunto in ogni colonna. GFP e RFP fluorescenza è stata misurata dopo 21 h di incubazione. La media del rapporto relativo fluorescenza di ogni controllo (1,0) e juglone pozzi (8,9) sono contrassegnati da linee continue. Tre deviazioni standard sopra la media dei controlli e al di sotto della media juglone sono segnati con linee spezzate.
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Discussion
Vi presentiamo un metodo per la coltura e l'erogazione un gran numero di nematodi transgenici. Le attrezzature utilizzate per la coltura worm è standard per i laboratori che effettuano la clonazione molecolare e la gestione dei liquidi e delle attrezzature fluorescenza è standard per i laboratori di lavorazione un gran numero di micropiastre. Altri metodi di dispensare un gran numero di vivere C. elegans richiedono costosi impianti di smistamento delle particelle 19. Il Pgst-4:: GFP test può essere usato per individuare modulatori piccola molecola di fattori cap 'n' trascrizione collare e di rilevare contaminanti xenobiotici e antiossidante in campioni ambientali e alimentari 14,16. Robusto inducibile transgenico reporter GFP sono disponibili per una vasta gamma di percorsi e stimoli ambientali 4, e quindi il nostro metodo dovrebbe essere applicabile a modulatori sviluppo di percorsi diversi e di individuare un ampio spettro di contaminanti.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
C. elegans transgeni sono stati forniti dalla genetica Caenorhabditis Center (University of Minnesota, Minneapolis, MN). Questo lavoro è stato sostenuto da NIH R21 concedere NS0667678-01 a KS. Tutti gli autori hanno partecipato alla raccolta, analisi e interpretazione dei dati. CKL, KS, e KPC ha partecipato alla stesura e alla revisione del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB broth | Research Products International Corp. | L24066 | |
| Terrific broth | Research Products International Corp. | T15100 | |
| Synergy HT Multi-mode Microplate Reader | BioTek | Filters: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em | |
| MicroFlo Select Dispenser | BioTek | ||
| Worm dispensing flask | Southern Scientific Inc., Micanopy, FL | Custom assembled(352) 284-2531 | |
| 384 microplates | Greiner Bio-One | 5678-1209 | |
| Breathable sealing tape | Nalge Nunc international | 241205 | |
| (5-hydroxy-p-naphthoqinone)Juglone | Acros Organics | 121640010 | Juglone is dissolved in DMSO |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| C. elegans transgenic strain | Author’s laboratory | VP596 | Pgst-4::GFP and Pdop-3::RFP |
References
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