Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

खमीर में एक निगरानी Mitophagy के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी परख Saccharomyces cerevisiae

Published: July 18, 2011 doi: 10.3791/2779
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Biomedical Sciences, Monash University

Summary

एक मजबूत गिरावट और रीसाइक्लिंग के लिए खमीर रिक्तिका के अम्लीय लुमेन organelles की डिलीवरी की निगरानी दृष्टिकोण वर्णित है. विधि एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग दोहरी उत्सर्जन पीएच biosensor प्रतिदीप्ति, और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके व्यक्तिगत कोशिकाओं के दृश्य के साथ लक्ष्य organelles विशिष्ट लेबलिंग पर निर्भर करता है.

Abstract

भोजी सेलुलर घटकों के कारोबार के लिए विभिन्न स्थितियों की एक श्रृंखला के तहत महत्वपूर्ण है. यह एक आवश्यक homeostatic समारोह में कार्य करता है के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक गुणवत्ता नियंत्रण तंत्र है कि लक्ष्य और चुनिंदा organelles1-4 सहित सेलुलर सामग्री नीचा कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, क्षतिग्रस्त या mitochondria निरर्थक (1 छवि) भोजी के द्वारा, सेलुलर homeostasis और सेल अस्तित्व के लिए खतरा प्रतिनिधित्व कर सकते हैं का निपटारा नहीं ,. खमीर में, Saccharomyces cerevisiae, पोषक तत्वों के अभाव (जैसे, नाइट्रोजन भुखमरी) या नुकसान एक 5-9 mitophagy करार दिया प्रक्रिया में भोजी से mitochondria के चुनिंदा कारोबार को बढ़ावा कर सकते हैं.

हम एक सरल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी भोजी आकलन दृष्टिकोण का वर्णन. स्पष्टता के लिए हम अपने यहाँ वर्णन प्रतिबंधित करने के लिए दिखाने के लिए कैसे दृष्टिकोण करने के लिए खमीर कोशिकाओं में mitophagy पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. परख एक फ्लोरोसेंट संवाददाता, Rosella है, जो एक दोहरी उत्सर्जन अपेक्षाकृत पीएच स्थिर लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन पीएच संवेदनशील हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन से जुड़े शामिल biosensor है का उपयोग करता है. इस संवाददाता के संचालन पीएच में रिक्तिका (~ 5.0-5.5 पीएच) और mitochondria (~ 8.2 पीएच) के बीच जीवित कोशिकाओं में मतभेद पर निर्भर करता है. बढ़ती शर्तों के तहत, जंगली प्रकार की कोशिकाओं के mitochondria की एक तरह से विशेषता में दोनों लाल और हरे रंग वितरित प्रतिदीप्ति दिखा रहे हैं. प्रतिदीप्ति उत्सर्जन रिक्तिका के साथ संबद्ध नहीं है. जब नाइट्रोजन भुखमरी, एक शर्त है जो mitophagy लाल और हरे रंग प्रतिदीप्ति mitochondria लेबलिंग के अलावा में, लाती के अधीन कोशिकाओं को लाल रंग का संचय एक्ज़िबिट, लेकिन नहीं हरी प्रतिदीप्ति अम्लीय vacuolar रिक्तिका के लिए mitochondria की डिलीवरी प्रतिनिधित्व लुमेन में. लाल रंग के साथ कोशिकाओं स्कोरिंग, लेकिन नहीं हरे रंग का फ्लोरोसेंट vacuoles 5,10-12 कोशिकाओं में mitophagic गतिविधि का एक उपाय के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.

Protocol

उपयुक्त नियंत्रण खमीर उपभेदों का चयन

परख नेत्रहीन खमीर रिक्तिका में लाल प्रतिदीप्ति के संचय का मूल्यांकन experimenter पर निर्भर करता है. के रूप में इस तरह परख व्यक्तिपरक है और उपयुक्त नियंत्रण उपभेदों और विकास की स्थिति का चयन पर निर्भर करता है है. एक जंगली प्रकार नियंत्रण भोजी सामान्य उम्मीद के स्तर का संकेत करने के लिए प्रयोग किया जाता है. कोर भोजी जीन (जैसे, ATG3) की अभिव्यक्ति के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक तनाव अशक्त उपयुक्त है, जैसे उपभेदों सामग्री रिक्तिका उद्धार नहीं कर सकते हैं (जैसे, mitochondria, नाभिक)

1. खमीर कोशिकाओं के डीएनए प्लाज्मिड के साथ परिवर्तन

खमीर कोशिकाओं LiAcetate के साथ इलाज के द्वारा आसानी से परिवर्तन के लिए सक्षम बनाया जा सकता है. वाणिज्यिक किट (उदाहरण के लिए, EasyComp, Invitrogen) खरीदा जा सकता है और प्रकाशित प्रोटोकॉल 13 उपलब्ध हैं.

इस प्रोटोकॉल में हम जंगली प्रकार तनाव BY4741 (his3Δ1 एक leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 मैट), और विलोपन उत्परिवर्ती (जैसे, atg3 Δ) उपभेदों से व्युत्पन्न, एक अलग गैर जरूरी जीन के प्रत्येक कमी अभिव्यक्ति की एक व्यापक पुस्तकालय के कुछ सदस्यों का उपयोग करें. विलोपन तनाव पुस्तकालय भोजी Rosella आधारित जांच का उपयोग कर जांच के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है. 12 लाख टन - Rosella: इस प्रोटोकॉल में कार्यरत संवाददाता mitochondria के लिए मीट्रिक टन-Rosella (छवि 2A), pAS1NB द्वारा इनकोडिंग है.

निम्न चरणों का पालन कोशिकाओं के उपयोग पर आधारित हैं सक्षम EasyComp परिवर्तन किट का उपयोग कर और -80 पर डिग्री सेल्सियस सुविधाजनक उपयोग के लिए जमे हुए संग्रहीत.

  1. कमरे के तापमान के लिए खमीर कोशिकाओं को जोड़ने से पहले 30 मिनट के समाधान III (EasyComp परिवर्तन किट) संतुलित.
  2. एक बाँझ 1.7 मिलीलीटर प्लास्टिक स्नैप - टोपी microcentrifuge ट्यूब: प्लाज्मिड संवाददाता एन्कोडिंग डीएनए (pAS1NB मीट्रिक टन-Rosella) (~ 100 एनजी / μl) के 2-2.5 μl जोड़ें.
  3. सक्षम खमीर कोशिकाओं और कोमल pipetting द्वारा मिश्रण के हौसले thawed निलंबन के 5 μl जोड़ें.
  4. समाधान III की 50 μl (EasyComp परिवर्तन किट) और मिश्रण करने के भंवर में जोड़ें. 1.5) या मैन्युअल उंगली से ट्यूब flicking द्वारा जोरदार हर 15 मिनट के एक भंवर मिश्रक का उपयोग कर मिश्रण के साथ 28-30 ° C से कम 1 घंटे के लिए परिवर्तन प्रतिक्रियाओं को सेते हैं.
  5. ध्यान से एक YMM अगर विकास हिस्टडीन के साथ पूरक की थाली, methionine और uracil परिवर्तन मिश्रण हस्तांतरण, और धीरे अगर की सतह के चारों ओर एक बाँझ कांच स्प्रेडर के साथ कोशिकाओं को वितरित. खमीर कोशिकाओं को इस स्तर पर कमजोर कर रहे हैं और कोमल हैंडलिंग transformants की उपज में वृद्धि कर सकते हैं.
  6. 28-30 ° C में 2 से 4 दिनों के लिए या कालोनियों व्यास में 2-3 मिमी के बारे में दिखाई देते हैं जब तक विकास प्लेटें सेते हैं.

2. खमीर कोशिकाओं में Rosella की अभिव्यक्ति की पुष्टि

विस्तृत प्रयोगों पर embarking से पहले सही स्थानीयकरण और Rosella के कुशल अभिव्यक्ति की पुष्टि होना चाहिए.

  1. बाँझ toothpicks का उपयोग परिवर्तन और अलग बाँझ मिलीलीटर 1.7 स्नैप - टोपी प्लास्टिक microcentrifuge ट्यूब में 50 बाँझ पानी के μl में थाली resuspend कोशिकाओं से प्रत्येक तनाव 5 एकल कालोनियों के लिए चयन करें.
  2. प्लेस अलग लेबल कांच खुर्दबीन स्लाइड (76 x 26 मिमी) पर 10 प्रत्येक कक्ष निलंबन के μl और एक वर्ग coverslip (22 x 22 मिमी) के साथ सेल निलंबन को कवर.
  3. तुरंत प्रतिदीप्ति उत्सर्जन के लिए कोशिकाओं एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग (जैसे, ओलिंप FluoView FV500) की जांच. मजबूत हरे और लाल प्रतिदीप्ति और mitochondrial स्थानीयकरण (छवि 2B और 2C) के ठेठ लेबलिंग के लिए देखो .
  4. प्रत्येक प्रतिदीप्ति के लिए इस तरह की जांच कॉलोनी के शेष एक ताजा YMM विकास की थाली पर inoculated होना चाहिए.
  5. 2 दिनों के लिए 28-30 डिग्री सेल्सियस पर सेते प्लेटें कॉलोनी तक व्यास में लगभग 2-3 मिमी.

3. सेल विकास और भोजी की प्रेरण

भोजी स्थिर चरण में प्रवेश, कार्बन स्रोत, rapamycin के प्रशासन, या नाइट्रोजन भुखमरी में परिवर्तन सहित विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों के एक नंबर का उपयोग कर प्रेरित किया जा सकता है. हम नियमित रूप से mitophagy प्रेरित विधि के रूप में नाइट्रोजन भुखमरी का उपयोग करें.

  1. विकास इथेनॉल युक्त मध्यम और उचित auxotrophic खुराक के 10 मिलीलीटर में एक ही कॉलोनी टीका लगाना.
  2. 28-30 ° C पर लगभग 48 घंटे के लिए कक्षीय मिलाते (200 आरपीएम) के साथ खमीर संस्कृतियों सेते हैं. कोशिकाओं मध्य लॉग विकास के चरण में होना चाहिए.
  3. बाँझ 1.7 मिलीलीटर कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 2,000 XG पर centrifugation से स्नैप - टोपी प्लास्टिक अपकेंद्रित्र ट्यूबों में डुप्लिकेट 1ml संस्कृति के नमूने से गोली कोशिकाओं. ध्यान हटाने और सेल गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
  4. कोशिकाओं 1 मिलीलीटर resuspension द्वारा बाँझ आसुत जल centrifugation द्वारा पीछा के साथ तीन बार धो अवशिष्ट मीटर दूरedium.
  5. तीसरे धोने के बाद मध्यम विकास या नाइट्रोजन भुखमरी माध्यम के 100 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend.
  6. ताजा वृद्धि मध्यम या 10 मिलीलीटर मध्यम नाइट्रोजन भुखमरी के 10 मिलीलीटर में resuspended कोशिकाओं को पुनः - टीका लगाना. 6-12 घंटे के लिए कक्षीय झटकों के साथ सेते mitophagy की प्रेरण की अनुमति. बाद भुखमरी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा देखने के लिए कोशिकाओं को तैयार करते हैं.

नोट: CMAC - Arg साथ रिक्तिका के लेबल

जब पहली बार परख स्थापना Rosella के प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी रिक्तिका को प्रसव के अंतर्गत पुष्टि करने के लिए उपयोगी है. हालांकि खमीर रिक्तिका एक बड़े organelle स्थान जिसका अक्सर आसानी से संचारित प्रकाश छवियों, खमीर के कुछ उपभेदों में और कुछ विकास शर्तों के तहत रिक्तिका खंडित और कठिन को खोजने के लिए किया जा सकता है के संदर्भ द्वारा निर्धारित किया जा सकता है.

रिक्तिका coumarin आधारित CMAC Arg (7 अमीनो 4 chloromethylcoumarin, एल arginine एमाइड) जैसे रिक्तिका डाई का उपयोग आसानी से किया जा लेबल कर सकते हैं. रिक्तिका के उज्ज्वल नीले रंग प्रतिदीप्ति लेबलिंग में डाई परिणामों पर vacuolar proteases की कार्रवाई की. नीले उत्सर्जन आसानी से 11 Rosella के लाल और हरे रंग का उत्सर्जन से प्रतिष्ठित किया जा सकता है . CMAC - Arg के साथ लेबल के लिए नियमित रूप से प्रदर्शन किया जा की जरूरत नहीं करता, लेकिन यह जो स्थान और खमीर में रिक्तिका की उपस्थिति के साथ परिचित नहीं हैं के लिए सिफारिश की है.

4. CMAC Arg साथ रिक्तिका के लेबल

  1. इमेजिंग के लिए पहले बढ़ या नाइट्रोजन की कमी से जूझ कोशिकाओं CMAC Arg (100 मिमी अंतिम एकाग्रता) जोड़ें. CMAC - Arg समाधान अग्रिम में तैयार किया जा सकता है, लेकिन के रूप में समाधान प्रकाश के प्रति संवेदनशील है यह प्रकाश में जोखिम से संरक्षित किया जाना चाहिए.
  2. 30 मिनट के लिए कक्षीय मिलाते (200 आरपीएम) के साथ 28-30 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  3. कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 2,000 XG पर centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं.
  4. सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
  5. कोशिकाओं centrifugation द्वारा पीछा करने के लिए अवशिष्ट मध्यम और अतिरिक्त CMAC Arg डाई हटाने के resuspension द्वारा तीन बार धो बाँझ आसुत पानी के साथ.
  6. माउंट इमेजिंग के लिए कोशिकाओं के रूप में नीचे वर्णित है.

5. बढ़ते लेजर confocal स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी के लिए जीना खमीर कोशिकाओं (CLSM)

  1. 1 मध्यम विकास और नाइट्रोजन भुखमरी माध्यम के अलग मिलीलीटर aliquots में 70 डिग्री सेल्सियस पर incubating से कम पिघलने बिंदु agarose के 2 मिलीग्राम पिगलो पिघला हुआ agarose 70 पर बनाए रखा है डिग्री सेल्सियस
  2. गोली धीरे कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 2,000 XG पर centrifugation द्वारा प्रत्येक सेल संस्कृति के 1 मिलीलीटर aliquots में कोशिकाओं और supernatants त्यागें.
  3. कोशिकाओं 5.2 चरण में 1 मिलीलीटर के रूप बाँझ resuspension और centrifugation द्वारा आसुत जल के साथ तीन बार धोएं.
  4. बाँझ आसुत जल के 100 μl में धोया कोशिकाओं Resuspend.
  5. लेबल गिलास खुर्दबीन स्लाइड (76 x 26 मिमी) पर पिघला हुआ agarose की कोशिकाओं हाजिर 20 μl माउंट.
  6. तुरंत agarose बिस्तर पर धोया सेल निलंबन के 10 μl हाजिर.
  7. Coverslip (22 x 22 मिमी) के साथ agarose बिस्तर कवर. कोशिकाओं agarose सतह भर में coverslip नीचे फैल जाएगा.
  8. इमेजिंग के दौरान निर्जलीकरण और coverslip के आंदोलन को रोकने के ध्यान से नेल पॉलिश की एक पतली फिल्म के साथ coverslip के किनारों को सील.
  9. जब नेल पॉलिश पूरी तरह से सूखा है (10 मिनट) स्लाइड प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी सावधान द्वारा देखने के लिए तैयार है: नेल पॉलिश खुर्दबीन उद्देश्यों को क्षति पैदा कर सकता है.
  10. कक्ष घुड़सवार इस तकनीक का उपयोग 1 घंटे के लिए किया जा सकता है बढ़ते के बाद मनाया.

6. Visualizing CLSM का उपयोग भोजी

कक्षों की आबादी में भोजी के स्तर को नियमित रूप से पहले लाल vacuolar प्रतिदीप्ति दिखा कोशिकाओं की संख्या का निर्धारण करके और भोजी की प्रेरण के बाद मूल्यांकन किया है. आदर्श रूप में भोजी की प्रगति भोजी की प्रेरण (3 छवि) के बाद चयनित समय बिंदुओं पर नजर रखी है . यह सबसे अच्छा द्विनेत्री माइक्रोस्कोप के माध्यम से visualizing द्वारा किया जाता है. यह महत्वपूर्ण है कि सही नियंत्रण (जैसे, Δ atg3 उत्परिवर्ती) कार्यरत हैं और है कि खुर्दबीन सेटिंग्स अलग नमूने (जैसे, तटस्थ घनत्व फिल्टर, फिल्टर चयन का उपयोग करने के लिए) देख के बीच अपरिवर्तित ही रहेंगे.

खमीर कोशिकाओं अपेक्षाकृत छोटे हैं एक अच्छी गुणवत्ता प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी (उदाहरण के लिए, ओलिंप FluoView FV500) उत्तेजना उत्सर्जन / GFP और / या pHluorin (हरी प्रतिदीप्ति उत्सर्जन) (FITC फिल्टर) और DsRed.T3 (लाल अलग दृश्य के लिए उपयुक्त फिल्टर के साथ सुसज्जित की आवश्यकता उत्सर्जन प्रतिदीप्ति) (TRITC फ़िल्टर).

  1. एक 60x पानी उद्देश्य दृश्य का उपयोग गैर भूखे जंगली प्रकार एकांतर FITC और TRITC फिल्टर का उपयोग कोशिकाओं. जंगली प्रकार की कोशिकाओं कोशिकाओं है कि दोनों लाल और हरे रंग प्रतिदीप्ति दिखाने की परिधि में mitochondria की एक विशिष्ट सेलुलर वितरण प्रदर्शन करना चाहिए. ध्यान दें कि mitochondria के इस वितरण pinh पर निर्भर हैconfocal खुर्दबीन के ऑब्जेक्ट लिंकिंग एंड एम्बेडिंग सेटिंग. हम आम तौर पर एक कम 125 सुक्ष्ममापी की pinhole मूल्य है कि केवल mitochondria सेल की परिधि (छवि 2C) पर ऐसा स्थानीयकृत कि रिक्तिका 12 अस्पष्ट नहीं है डॉट्स की एक श्रृंखला के रूप में मनाया जा करने के लिए अनुमति देता है का उपयोग करें. यदि एक उच्च pinhole का मूल्य (200 सुक्ष्ममापी) प्रयोग किया जाता है यह ठेठ filamentous mitochondrial नेटवर्क की अनुमति देता है सेल भर में वितरित (और परिवर्तन आए) से 11 मनाया जा. कक्ष में कोई अन्य संरचनाओं fluorescently लेबल किया जाना चाहिए.
  2. समय बिंदुओं में से प्रत्येक के लिए क्रमिक रूप से कोशिकाओं को भुखमरी के माध्यम से हस्तांतरण निम्नलिखित देखने. एकांतर कल्पना हरे और लाल उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग. 6 घंटे भुखमरी समय बिंदु लाल प्रतिदीप्ति, लेकिन रिक्तिका में कोई इसी हरी उत्सर्जन discernable होना चाहिए. Vacuolar स्थानीयकरण अलग हो CMAC - Arg (छवि 2C) का उपयोग कर पुष्टि कर सकते हैं. देखें ~ 200 कोशिकाओं और है कि केवल रिक्तिका (यानी mitochondria की vacuolar तेज) में लाल प्रतिदीप्ति दिखाने संख्या गिनती.
  3. सभी समय अंक> 200 कोशिकाओं और फिर vacuolar संचय दिखा कोशिकाओं की साजिश प्रतिशत अवलोकन के लिए vacuolar संचय गिन लो.
  4. भोजी नकारात्मक नियंत्रण व्यक्त भुखमरी से पहले लाख टन Rosella और 6 घंटे भुखमरी के बाद कोशिकाओं की जांच.

7. प्रतिनिधि परिणाम:

यहाँ, हम ठेठ लाख टन Rosella, जंगली प्रकार और Δatg3 उत्परिवर्ती कोशिकाओं में व्यक्त का उपयोग करने के लिए प्राप्त परिणामों दिखा. इथेनॉल के साथ बढ़ रहा शर्तों के तहत कार्बन स्रोत के रूप में, दोनों के जंगली प्रकार और Δatg3 उत्परिवर्ती कोशिकाओं प्रतिदीप्ति (लाल और हरे रंग) खमीर कोशिकाओं में mitochondria के ठेठ का एक सेलुलर वितरण एक्ज़िबिट. लाल और हरे रंग प्रतिदीप्ति उत्सर्जन रिक्तिका (छवि 2B और 2C) में पता नहीं है . जब 6 घंटे के लिए और नाइट्रोजन भुखमरी के अधीन तब से परे, लाल और हरे रंग प्रतिदीप्ति mitochondria में इसी के अलावा, जंगली प्रकार की कोशिकाओं को भी लाल रंग का संचय एक्ज़िबिट, लेकिन vacuolar लुमेन में हरी प्रतिदीप्ति नहीं (छवि 2B; चित्र 3) . हालांकि, Δatg3 उत्परिवर्ती कोशिकाओं में लाल न तो और न ही हरी प्रतिदीप्ति vacuolar लुमेन (; चित्र 3 छवि 2C) में जम जाता है.

चित्रा 1
चित्रा 1, organelles और एक खमीर कोशिका में डिब्बों की योजना है . नीचे, एक खमीर कोशिका के एक दृश्य रिक्तिका केंद्रित विभिन्न organelles और डिब्बों के autophagic गिरावट का संकेत करने के लिए प्रस्तुत किया है. भोजी (उदाहरण के लिए, mitophagy, nucleophagy) के विभिन्न organelle विशिष्ट प्रकार के बीच मतभेद के कुछ (कार्गो चयन) घिरा हुआ सामग्री की विशिष्टता, विभिन्न intracellular की जरूरत है और बाह्य cues (उदाहरण के लिए, क्षति, भुखमरी), विशिष्ट संकेतों, ATG शामिल जीन और समय पर निर्भरता.

चित्रा 2a
चित्रा 2b
चित्रा 2c
चित्रा 2d
चित्रा 2. (ए) mt-Rosella के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. mitochondrial नेता अनुक्रम (साइट्रेट synthase के इस मामले में) mitochondrial मैट्रिक्स Rosella biosensor लक्ष्य प्रयोग किया जाता है. उत्तेजना और दोनों लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (DsRed.T3) और हरे रंग का फ्लोरोसेंट प्रोटीन (pHluorin) के लिए उत्सर्जन मॅक्सिमा संकेत कर रहे हैं. उच्च पीएच (mitochondrial 8.2 ~ पीएच) दोनों लाल और हरे रंग biosensor fluoresces, तथापि, (बी) कम पीएच (vacuolar 5.5 ~ पीएच) यह केवल लाल fluoresces में जंगली प्रकार और Δ atg3 उत्परिवर्ती कोशिकाओं को व्यक्त करने में अपेक्षित परिणाम की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व . mt-Rosella (सी) वास्तविक परिणाम बढ़ रही तहत जंगली प्रकार की कोशिकाओं और नाइट्रोजन भुखमरी की स्थिति के लिए CLSM द्वारा प्राप्त है. बाएं से दाएं: डीआईसी (इसके विपरीत में अंतर), आरएफपी (DsRed.T3) प्रतिदीप्ति उत्सर्जन, GFP (pHluorin) प्रतिदीप्ति उत्सर्जन, CMAC Arg प्रतिदीप्ति और मर्ज छवि (डी) Datg3 उत्परिवर्ती कोशिकाओं के लिए वास्तविक परिणाम के तहत प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त बढ़ रही है और नाइट्रोजन भुखमरी की स्थिति. बाएं से दाएं: डीआईसी (इसके विपरीत में अंतर), आरएफपी (DsRed.T3) उत्सर्जन प्रतिदीप्ति, GFP (pHluorin) प्रतिदीप्ति उत्सर्जन, CMAC Arg प्रतिदीप्ति और मर्ज छवि.

चित्रा 3
चित्रा 3. जंगली प्रकार और Δ atg3 उत्परिवर्ती कोशिकाओं, mt-Rosella व्यक्त और नाइट्रोजन भुखमरी के तहत हो, रिक्तिका में 48 घंटे के समय के पाठ्यक्रम पर लाल प्रतिदीप्ति दिखाने का प्रतिशत. रिक्तिका में लाल प्रतिदीप्ति के संचय दिखा कोशिकाओं का प्रतिशत 0, 6, 12, 24, और 48 घंटे में नाइट्रोजन भुखमरी शुरू करने के बाद दर्ज किया गया था.

Discussion

प्रतिनिधि छवि में प्रस्तुत छवियों में. 2B और 2C यह स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है कि organelle विशेष फ्लोरोसेंट पत्रकारों और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग mitochondrial / दोनों बढ़ रही है और नाइट्रोजन की कमी से जूझ कोशिकाओं में स्थानीयकरण वितरण का सबूत प्रदान करता है, और mitophagy visualized किया जा अनुमति देता है.

यह है कि इस विधि निम्न mitophagy के लिए आरक्षित नहीं है पर जोर दिया जाना है. अन्य सेलुलर घटकों या organelles (जैसे, ribosomes, लिपिड बूंदों, peroxisomes, endoplasmic जालिका और नाभिक) की भोजी उपयुक्त लेबलिंग के साथ नजर रखी जा सकता है. Rosella biosensor का निर्माण, सेल संस्कृति शर्तों और नाभिक का कारोबार (nucleophagy) के लिए विशिष्ट परिणाम का विवरण 11,12 सूचित किया गया है विधि का व्यापक आवेदन illustrating.

Organelle निगरानी भोजी के लिए विशिष्ट फ्लोरोसेंट संवाददाताओं का प्रयोग निर्माण डिजाइन के कई विचारों को मन में रखा करने की आवश्यकता है है. ये शामिल हैं: (1) चयन और उपयुक्त लक्ष्यीकरण संकेत organelle विशिष्ट लक्षित प्राप्त करने संलयन, एक उपयुक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ओं) के चयन (2), (3) मजबूत प्रतिदीप्ति उत्सर्जन, (4) सही organelle स्थानीयकरण और / या कक्ष के भीतर वितरण. एक बार संवाददाता organelle विशिष्ट सफलतापूर्वक किया गया है चुना खमीर मेजबान में व्यक्त विचार हो जाते हैं एक दूसरे समूह तनाव: (1) खमीर विकास की स्थिति, (2) सेल नमूना तैयार करने, (3) इमेजिंग पैरामीटर के रूप में यह महत्वपूर्ण है कि पैरामीटर चयनित CLSM के लिए (जैसे, तीव्रता, लेजर स्कैन दर और मोड, pinhole मूल्य, ज़ूम मूल्य, प्रयोग उद्देश्यों या सीसीडी कैमरा के लिए जोखिम) एक प्रयोग यह सुनिश्चित करना है कि तुलना नियंत्रण (बढ़ कोशिकाओं) और भूखे नमूने के बीच बनाया जा सकता है भर में रखा जाता है; ( 3) रिक्तिका में भोजी प्रेरण और सफल पत्रकार की डिलीवरी.

कुल मिलाकर, इस फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी विधि आसान है, अपेक्षाकृत तेजी से है, और जीन है कि विनियमित या भोजी मिलाना के लिए उपन्यास दवाओं है कि बढ़ाने या भोजी बाधित, और भी के लिए उच्च throughput प्रदर्शन के लिए संभावित आवेदन किया है.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

यह काम ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद अनुदान DP0986937 के द्वारा समर्थित किया गया था.

References

  1. Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 132, 27-42 (2008).
  2. Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451, 1069-1075 (2008).
  3. He, C., Klionsky, D. J. Regulation mechanisms and signaling pathways of autophagy. Annu. Rev. Genet. 43, 67-93 (2009).
  4. Kroemer, G., Mariño, G., Levine, B. Autophagy and the integrated stress response. Mol Cell. 40, 280-293 (2010).
  5. Camougrand, N., Kissová, I., Salin, B., Devenish, R. J. Monitoring mitophagy in yeast. Methods Enzymol. 451, 89-107 (2008).
  6. Yen, W. L., Klionsky, D. J. How to live long and prosper: autophagy, mitochondria, and aging. Physiology (Bethesda). 23, 248-262 (2008).
  7. Tolkovsky, A. M. Mitophagy. Biochim. Biophys. Acta. 1793, 1508-1515 (2009).
  8. Bhatia-Kissová, I., Camougrand, N. Mitophagy in yeast: actors and physiological roles. FEMS Yeast Res. 10, 1023-1034 (2010).
  9. Kanki, T., Klionsky, D. J. The molecular mechanism of mitochondria autophagy in yeast. Mol. Microbiol. 75, 795-800 (2010).
  10. Nowikovsky, K., Reipert, S., Devenish, R. J., Schweyen, R. J. Mdm38 protein depletion causes loss of mitochondrial K+/H+ exchange activity, osmotic swelling and mitophagy. Cell Death Differ. 14, 1647-1656 (2007).
  11. Devenish, R. J., Prescott, M., Turcic, K., Mijaljica, D. Monitoring organelle turnover in yeast using fluorescent protein tags. Methods Enzymol. 451, 109-131 (2008).
  12. Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4, 205-213 (2008).
  13. Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods Enzymol. 350, 87-96 (2002).

Tags

सेल बायोलॉजी 53 अंक भोजी माइक्रोस्कोपी mitochondria नाभिक खमीर,
खमीर में एक निगरानी Mitophagy के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी परख<em> Saccharomyces cerevisiae</em>
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Mijaljica, D., Prescott, M.,… More

Mijaljica, D., Prescott, M., Devenish, R. J. A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (53), e2779, doi:10.3791/2779 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter