Eine Fluoreszenz-Mikroskopie Assay zur Überwachung Mitophagy in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Summary

Ein robustes Konzept für die Lieferung von Organellen in den sauren Lumen der Hefe Vakuole für den Abbau und Recycling-Monitor beschrieben. Die Methode beruht auf der spezifischen Markierung von Zielorganellen mit einem genetisch kodierten Dual-Emissions-Fluoreszenz-pH-Biosensor und Visualisierung von einzelnen Zellen mittels Fluoreszenz-Mikroskopie.

Abstract

Autophagie ist für einen Umsatz von zellulären Komponenten wichtig unter einer Reihe von verschiedenen Bedingungen. Es dient ein wesentlicher homöostatische Funktion sowie ein Mechanismus der Qualitätskontrolle, die Ziel und kann selektiv abgebaut Zellmaterial einschließlich organelles1-4. Zum Beispiel, beschädigt oder redundant Mitochondrien (Abb. 1), nicht durch Autophagie, können eine Bedrohung für die zelluläre Homöostase und das Überleben der Zelle darstellen entsorgt. In der Hefe kann Saccharomyces cerevisiae, Nährstoffmangel (z. B. Stickstoff Hunger) oder Schäden selektive Umsatz der Mitochondrien durch Autophagie in einem Prozess bezeichnet mitophagy ^5-9 zu fördern.

Wir beschreiben eine einfache Fluoreszenzmikroskopie Ansatz zur Autophagie zu beurteilen. Aus Gründen der Übersichtlichkeit beschränken wir unsere Beschreibung hier, um zu zeigen, wie der Ansatz verwendet werden, um mitophagy in Hefezellen zu überwachen. Der Test verwendet eine fluoreszierende Reporter, Rosella, die ein Dual-Emissions-Biosensor mit einer relativ stabilen pH-rot fluoreszierendes Protein in Verbindung mit einem pH-sensitive grün fluoreszierenden Proteins ist. Der Betrieb dieser Reporter verlässt sich auf Unterschiede in der pH-Wert zwischen der Vakuole (pH ~ 5,0-5,5) und Mitochondrien (pH ~ 8,2) in lebenden Zellen. Unter Wachstumsbedingungen weisen Wildtyp-Zellen sowohl rote und grüne Fluoreszenz in einer Weise charakteristisch für die Mitochondrien verteilt. Fluoreszenzemission ist nicht mit der Vakuole verbunden. Wenn Stickstoff Hunger, eine Bedingung, die mitophagy induziert neben roten und grünen Fluoreszenz-Markierung der Mitochondrien unterzogen, weisen Zellen der Anhäufung von roten, nicht aber grüne Fluoreszenz, in den sauren vacuolar Lumen, die die Lieferung von Mitochondrien, die Vakuole. Scoring-Zellen mit roten, aber nicht grün fluoreszierenden Vakuolen kann als ein Maß für mitophagic Aktivität in Zellen ^5,10-12 verwendet werden.

Protocol

Auswahl geeigneter Kontrolle Hefestämme

Der Test beruht auf der Experimentator visuell Auswertung der Ansammlung von roten Fluoreszenz in der Hefe Vakuole. Als solcher ist der Test subjektiv und beruht auf der Auswahl der geeigneten Steuerung Stämme und Wachstumsbedingungen. Ein Wildtyp-Steuerung wird verwendet, um das Niveau der Autophagie in der Regel erwartet, zeigen. Als Negativ-Kontrolle eine Belastung null für die Expression eines der Kern-Autophagie-Genen (zB ATG3) ist geeignet, solche Stämme können nicht liefern Material (z. B. Mitochondrien, Zellkern), die Vakuole

1. Transformation von Hefezellen mit Plasmid-DNA

Hefezellen können leicht gemacht werden kompetent für die Transformation durch Behandeln mit LiAcetate. Kommerzielle Kits können erworben (zB EasyComp, Invitrogen) und veröffentlicht werden Protokolle zur Verfügung ^13.

In diesem Protokoll verwenden wir Wildtypstamms BY4741 (MAT ein his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0), und einige Mitglieder eine umfassende Bibliothek von Deletionsmutante Stämme (zB Δ atg3) daraus abgeleitet, die jeweils fehlenden Ausdruck einer anderen nicht-essentiellen Gen. Die Löschung Belastung Bibliothek stellt ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung von Autophagie mit Rosella-Sonden. Der Reporter in diesem Protokoll eingesetzt wird mt-Rosella für Mitochondrien (Abb. 2A), gefolgt von pAS1NB codiert: mt-Rosella ^12.

Die folgenden Schritte sind auf die Verwendung von Zellen basiert kompetent gemacht mit dem EasyComp Transformation Kit und gefroren bei -80 ° C für die bequeme Nutzung.

1. Äquilibrieren Lösung III (EasyComp Transformation Kit) auf Raumtemperatur 30 Minuten vor der Zugabe von Hefe-Zellen.
2. Add 2-2,5 ul (~ 100 ng / ul) von Plasmid-DNA, die der Reporter (pAS1NB: mt-Rosella) in ein steriles 1,7 ml-Snap-cap Kunststoff Mikrozentrifugenröhrchen.
3. Add 5 ul der frisch aufgetauten Suspension kompetenter Hefezellen und mischen durch vorsichtiges Pipettieren.
4. Dann werden 50 ul Lösung III (EasyComp Transformation Kit) und Vortex mischen. 1,5) Inkubieren der Transformation Reaktionen für 1 Stunde bei 28-30 ° C unter heftigem Rühren alle 15 Minuten mit einem Vortex-Mixer oder manuell durch flicking das Rohr mit dem Finger.
5. Sorgfältig Übertragung der Transformation Mischung zu einem einzigen YMM Agar Wachstum Platte mit Histidin ergänzt, Methionin und Uracil, und sanft verteilen die Zellen auf der ganzen Oberfläche des Agar mit einer sterilen Glas-Spreader. Hefezellen sind in diesem Stadium fragile und schonende Handhabung kann die Ausbeute an Transformanten zu erhöhen.
6. Inkubieren Wachstum Platten für 2 bis 4 Tage bei 28-30 ° C oder bis Kolonien erscheinen etwa 2-3 mm im Durchmesser.

2. Bestätigen Ausdruck Rosella in Hefezellen

Bevor wir auf detaillierte Experimente die korrekte Lokalisation und effiziente Expression von Rosella sollten bestätigt werden.

1. Mit sterilen Zahnstochern wählen für jeden Stamm 5 Einzelzimmer Kolonien aus der Transformation Platte und die Zellen in 50 ul sterilem Wasser in separate sterile 1,7 ml-Snap-cap Kunststoff Mikrozentrifugenröhrchen.
2. Platz 10 ul jeder Zellsuspension auf separaten gekennzeichnet Objektträger aus Glas (76 x 26 mm) und die Abdeckung der Zellsuspension mit einem quadratischen Deckglas (22 x 22 mm).
3. Unmittelbar untersuchen die Zellen für die Fluoreszenz-Emission mit einem Fluoreszenzmikroskop (zB Olympus FluoView FV500). Suchen Sie nach starken grünen und roten Fluoreszenz und Kennzeichnung typische mitochondriale Lokalisation (Abb. 2B und 2C).
4. Der Rest jeder Kolonie für die Fluoreszenz-in auf diese Weise geprüft werden sollte auf eine frische YMM Wachstum Platte geimpft werden.
5. Die Platten bei 28-30 ° C für 2 Tage, bis Kolonie sind etwa 2-3 mm im Durchmesser.

3. Das Wachstum der Zellen und die Induktion von Autophagie

Autophagie kann induziert durch eine Reihe von verschiedenen experimentellen Bedingungen, einschließlich des Beginns der stationären Phase, Veränderung der C-Quelle, die Verwaltung von Rapamycin oder Stickstoff Verhungern werden. Wir verwenden routinemäßig Stickstoff Hunger als die Methode mitophagy induzieren.

1. Impfen einer einzigen Kolonie in 10 ml Wachstumsmedium mit Ethanol und den entsprechenden auxotrophen ergänzt.
2. Inkubieren Hefekulturen bei 28-30 ° C mit Orbital Schütteln (200 rpm) für ca. 48 Stunden. Die Zellen sollten in der mittleren logarithmischen Wachstumsphase werden.
3. Pellet-Zellen von doppelter 1ml Proben der Kultur in sterile 1,7 ml-Snap-Cap-Kunststoff-Röhrchen durch Zentrifugation bei 2.000 xg für 2 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie vorsichtig und den Überstand verwerfen, ohne das Zellpellet.
4. Waschen Sie die Zellen dreimal mit 1 ml sterilem destilliertem Wasser durch Resuspension, gefolgt von Zentrifugation, um restliches m entferntedium.
5. Nach dem dritten Waschen die Zellen in 100 ml Wachstumsmedium oder Stickstoff-Hunger Medium.
6. Re-impfen die resuspendierten Zellen in 10 ml frischem Nährmedium oder 10 ml Stickstoff-Hunger Medium. Inkubieren mit Orbital Schütteln für 6-12 Stunden zur Induktion von mitophagy ermöglichen. Nach Hungertod vorzubereiten Zellen für die Anzeige mittels Fluoreszenzmikroskopie.

Hinweis: Die Beschriftung der Vakuole mit CMAC-Arg

Bei der ersten Gründung des Tests ist es sinnvoll, unter dem Fluoreszenzmikroskop Lieferung von Rosella, die Vakuole zu bestätigen. Obwohl die Hefe Vakuole ist eine große Organellen, deren Lage oft einfach durch Verweis auf Durchlichtbilder, in einigen Stämmen der Hefe und unter bestimmten Wachstumsbedingungen der Vakuole werden fragmentiert und schwer zu orten ermittelt werden kann.

Die Vakuole kann leicht beschriftet werden mit einem Cumarin-basierte Vakuole Farbstoff wie CMAC-Arg (7-Amino-4-chloromethylcoumarin, L-Arginin-Amid). Die Wirkung von Proteasen vacuolar auf den Farbstoff Ergebnisse in hellblauen Fluoreszenz-Markierung der Vakuole. Die blaue Emission kann leicht aus den roten und grünen Emissionen von Rosella ¹¹ unterschieden werden. Die Markierung mit CMAC-Arg muss nicht routinemäßig durchgeführt werden, aber es ist für diejenigen, die nicht vertraut sind mit dem Standort und Aussehen der Vakuole in Hefe empfohlen.

4. Labeling der Vakuole mit CMAC-Arg

1. Fügen Sie die CMAC-Arg (100 mM Endkonzentration) auf die wachsende oder Stickstoff unterversorgten Zellen vor der Aufnahme. Die CMAC-Arg Lösung kann im Voraus zubereitet werden, sondern als die Lösung ist lichtempfindlich es braucht, um vor Lichteinwirkung geschützt werden.
2. Inkubation bei 28-30 ° C mit Orbital Schütteln (200 rpm) für 30 Minuten.
3. Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 2.000 xg für 2 Minuten bei Raumtemperatur.
4. Überstand verwerfen.
5. Waschen Sie die Zellen dreimal mit sterilem destilliertem Wasser durch Resuspension, gefolgt von Zentrifugation, um restliches Medium und überschüssiges CMAC-Arg Farbstoff zu entfernen.
6. Montieren Sie die Zellen für die Bildgebung, wie unten beschrieben.

5. Montage leben Hefezellen für die konfokale Laser Scanning Mikroskopie (CLSM)

1. Melt 2 mg Agarose für niedrigen Schmelzpunkt in separate 1 ml Aliquots Wachstum mittel-und Stickstoff-Hunger Medium durch Inkubation bei 70 ° C. Die geschmolzene Agarose bei 70 ° C gehalten
2. Gently Pellet die Zellen in 1 ml Aliquots jeder Zellkultur durch Zentrifugation bei 2.000 xg für 2 Minuten bei Raumtemperatur und entsorgen Sie die Überstände.
3. Waschen Sie die Zellen dreimal mit 1 ml sterilem destilliertem Wasser durch Resuspension und Zentrifugation wie in Schritt 5.2.
4. Resuspendieren gewaschenen Zellen in 100 ul sterilem destilliertem Wasser.
5. Um die Zellen vor Ort 20 ul geschmolzene Agarose auf eine markierte Objektträger (76 x 26 mm) montieren.
6. Unmittelbar vor Ort 10 ul der gewaschenen Zellsuspension auf die Agarose Bett.
7. Decken Sie die Agarose Bett mit einem Deckglas (22 x 22 mm). Die Zellen werden über die Agarose Oberfläche unter dem Deckglas verteilen.
8. Um zu verhindern, Dehydration und die Bewegung des Deckglases während der Bildgebung sorgfältig die Ränder des Deckglases mit einem dünnen Film von Nagellack.
9. Wenn der Nagellack trocken ist (10 min) der Folie ist bereit, durch Fluoreszenzmikroskopie Beware Blick: Nagellack kann Schäden an Mikroskop Ziele führen.
10. Cells montiert mit Hilfe dieser Technik können bis zu 1 Stunde beobachtet werden nach der Montage.

6. Visualizing Autophagie mit CLSM

Die Höhe der Autophagie in einer Population von Zellen wird routinemäßig durch die Bestimmung der Anzahl der Zellen zeigt rot vacuolar Fluoreszenz vor und nach der Induktion von Autophagie beurteilt. Idealerweise wird die Progression der Autophagie wird an ausgewählten Zeitpunkten nach Induktion von Autophagie (Abb. 3) überwacht. Dies geschieht am besten durch die Visualisierung durch das Mikroskop Binokular durchgeführt. Es ist wichtig, dass die korrekte Kontrollen eingesetzt werden (zB Δ atg3 Mutante) und dass das Mikroskop Einstellungen bleiben unverändert zwischen Beobachtung verschiedener Proben (z. B. Einsatz von Neutralfilter, Filter-Auswahl).

Hefezellen sind relativ klein, die eine gute Qualität Fluoreszenzmikroskop (zB Olympus FluoView FV500) mit Anregung / Emission-Filter für die separate Darstellung von GFP und / oder pHluorin (grüne Fluoreszenzemission) (FITC-Filter) und DsRed.T3 (rot ausgestattet Fluoreszenzemission) (TRITC-Filter).

1. Mit einem 60x Wasser objektive Sicht nicht verhungert Wildtyp-Zellen mit abwechselnd die FITC und TRITC-Filter. Wildtyp-Zellen sollte eine typische zelluläre Verteilung von Mitochondrien an der Peripherie der Zellen, die beide rote und grüne Fluoreszenz ausstellen. Beachten Sie, dass diese Verteilung der Mitochondrien abhängig von der Pinh istole Einstellung des konfokalen Mikroskops. Wir verwenden in der Regel eine niedrigere Pinhole Wert von 125 um, die nur erlaubt den Mitochondrien als eine Reihe von Punkten an der Peripherie der Zelle (Abb. 2C), so dass die Vakuole nicht verdeckt ist ¹² lokalisiert beobachtet werden. Wenn eine hohe Pinhole Wert (200 um) verwendet, ist dies erlaubt den typischen filamentösen mitochondriale Netzwerk der ganzen Zelle verteilt (und die darin auftretenden Veränderungen) zu beachten ^11. Keine andere Strukturen in der Zelle sollte fluoreszenzmarkierten werden.
2. Sequenziell Blick Zellen für jede der folgenden Zeitpunkten Transfer zum Hungertod Medium. Visualisieren Sie abwechselnd mit den grünen und roten Sperrfilter. Auf der 6 h Hunger Zeitpunkt rote Fluoreszenz, aber keine entsprechende grüne Emission sollte in der Vakuole erkennbar. Vakuoläre Lokalisierung kann separat bestätigt werden mit CMAC-Arg (Abb. 2C). Blick ~ 200 Zellen und die Anzahl, die nur rote Fluoreszenz in der Vakuole (dh vacuolar Aufnahme von Mitochondrien) zu zeigen.
3. Graf vacuolar Akkumulation zu allen Zeitpunkten beobachten> 200 Zellen und dann Plot Prozentsatz an Zellen, welche vacuolar Akkumulation.
4. Untersuchen Autophagie-negative Kontrolle Zellen, die mt-Rosella vor Hunger und nach 6 h Hunger.

7. Repräsentative Ergebnisse:

Hier zeigen wir typische Ergebnisse, die mit mt-Rosella, in Wildtyp und Mutante Δatg3 Zellen exprimiert. Unter Wachstumsbedingungen mit Ethanol als Kohlenstoffquelle, weisen sowohl Wildtyp und Δatg3 mutierten Zellen eine zelluläre Verteilung der Fluoreszenz (rot und grün), die typisch von Mitochondrien in Hefezellen. Rote und grüne Fluoreszenzemission ist nicht in der Vakuole (Abb. 2B und 2C) nachgewiesen. Wenn Stickstoff Hunger für 6 h und einer darüber hinaus dann, zusätzlich zu roten und grünen Fluoreszenz entspricht Mitochondrien, Wildtyp-Zellen zeigen auch die Ansammlung von roten, nicht aber grüne Fluoreszenz in den Vakuolen Lumen (Abb. 2B;. Abb. 3) . Doch in Δatg3 mutierten Zellen weder rot noch grün Fluoreszenz reichert sich in der vacuolar Lumen (Abb. 2C;. Abb. 3).

Abbildung 1. Top, Schema der Organellen und Kompartimente in einer Hefezelle. Unten, eine Vakuole-zentrierte Sicht einer Hefezelle vorgestellt Angabe autophagischen Abbau von verschiedenen Organellen und Kompartimente. Einige der Unterschiede zwischen den verschiedenen Organellen-spezifische Arten von Autophagie (zB mitophagy, nucleophagy) gehören die Spezifität (Fracht Auswahl) der verschlungen Inhalt, verschiedene intrazelluläre Bedürfnisse und extrazelluläre Signale (z. B. Hunger, Beschädigung), spezifische Signale, ATG Gene und Zeitabhängigkeit.

Abbildung 2. (A) Schematische Darstellung des mt-Rosella. Die mitochondriale Leitsequenz (in diesem Fall von Citrat-Synthase) wird verwendet, um die Rosella Biosensor auf der mitochondrialen Matrix Ziel. Anregungs-und Emissionsmaxima für beide rot fluoreszierendes Protein (DsRed.T3) und grün fluoreszierende Protein (pHluorin) angegeben sind. Bei hohen pH-Wert (pH ~ mitochondrialen 8,2) der Biosensor fluoresziert sowohl rot und grün, aber bei niedrigen pH-Wert (pH ~ vacuolar 5,5) fluoresziert nur rot. (B) Schematische Darstellung der erwarteten Ergebnisse in Wildtyp-und Δ atg3 mutierte Zellen, die mt-Rosella. (C) Die tatsächlichen Ergebnisse von CLSM für Wildtyp-Zellen unter wachsenden und Stickstoff Hunger Bedingungen erhalten. Von links nach rechts:. DIC (Unterschied in Kontrast), RFP (DsRed.T3) Fluoreszenzemission, GFP (pHluorin) Fluoreszenzemission, CMAC-Arg-Fluoreszenz und verschmelzen Bild (D) Die tatsächlichen Ergebnisse von Fluoreszenz-Mikroskopie für Datg3 mutierten Zellen erhalten unter wachsenden und Stickstoff Hunger Bedingungen. Von links nach rechts: DIC (Differenz in Kontrast), RFP (DsRed.T3) Fluoreszenzemission, GFP (pHluorin) Fluoreszenzemission, CMAC-Arg-Fluoreszenz und verschmelzen Bild.

Abbildung 3. Der Anteil der Wildtyp-und Δ atg3 mutierte Zellen, die mt-Rosella gewachsen und unter Stickstoff Hunger, zeigt rote Fluoreszenz in der Vakuole über einen zeitlichen Verlauf von 48 Stunden. Der Prozentsatz an Zellen, welche Anhäufung von roten Fluoreszenz in der Vakuole wurde bei 0, 6, 12, 24 und 48 Stunden nach Beginn der Stickstoff Hunger aufgezeichnet.

Discussion

In der repräsentativen Bilder in Abb. vorgestellt. 2B und 2C ist deutlich zu erkennen sein, dass die Verwendung von Organellen-spezifische fluoreszierende Reporter-und Fluoreszenzmikroskopie Beweis für mitochondriale Lokalisation / Verteilung in der Wachstums-und Stickstoff unterversorgten Zellen bietet, und ermöglicht mitophagy visualisiert werden.

Es ist zu betonen, dass diese Methode nicht zu folgen mitophagy eingeschränkt werden. Autophagy von anderen zellulären Komponenten oder Organellen (z. B. Ribosomen, Lipidtropfen, Peroxisomen, endoplasmatisches Retikulum und Zellkern) lassen sich mit geeigneten Kennzeichnung überwacht werden. Details der Rosella Biosensor zu konstruieren, Zellkultur-Bedingungen und typische Ergebnisse für Umsatz des Kerns (nucleophagy) wurden ^11,12 berichtet, welche die breitere Anwendung der Methode.

Verwenden von Organell-spezifischen fluoreszierenden Reporter für die Überwachung der Autophagie erfordert mehrere Überlegungen von Konstrukt-Design im Auge behalten werden. Dazu gehören: (1) Auswahl und Fusion mit dem entsprechenden Targeting-Signal zu Organellen-spezifisches Targeting zu erreichen, (2) Auswahl eines geeigneten fluoreszierenden Proteins (s), (3) starke Fluoreszenzemission, (4) richtig Organelle Lokalisierung und / oder Verteilung in der Zelle. Sobald der Organellen-spezifische Reporter wurde erfolgreich in der gewählten Hefewirt ausgedrückt Stamm eine zweite Gruppe von Überlegungen werden: (1) das Wachstum der Hefe Bedingungen, (2) Zelle Probenvorbereitung, (3) Bildparameter wie es wichtig ist, dass die gewählten Parameter für CLSM (zB Laser-Intensität, Scan-Rate und den Modus, Pinhole-Wert, Zoom-Wert, Ziele eingesetzt oder Belichtung für CCD-Kamera) sind über ein Experiment, dass Vergleiche zwischen Steuerung (wachsende Zellen) und ausgehungert Proben gemacht werden beibehalten; ( 3) Autophagie Induktion und erfolgreiche Umsetzung der Reporter in die Vakuole.

Insgesamt ist diese Fluoreszenz-Mikroskopie-Methode einfach, relativ schnell und hat mögliche Anwendung für das Hochdurchsatz-Screening nach neuen Medikamenten, oder zu verbessern hemmen Autophagie, und auch für Gene, oder regeln modulieren Autophagie.