Un ensayo de microscopía de fluorescencia para Mitophagy Vigilancia de la levadura Saccharomyces cerevisiae

Summary

Un enfoque sólido para controlar la entrega de los orgánulos de la luz del ácido de la vacuola de levadura para la degradación y el reciclaje se describe. El método se basa en el etiquetado específico de los orgánulos de destino con una codificada genéticamente doble emisión de fluorescencia de pH biosensor, y la visualización de las células individuales mediante microscopía de fluorescencia.

Abstract

La autofagia es importante para el movimiento de los componentes celulares en un rango de condiciones diferentes. Cumple una función esencial homeostático, así como un mecanismo de control de calidad que pueden degradar selectivamente objetivo y material celular como organelles1-4. Por ejemplo, las mitocondrias dañadas o redundante (Fig. 1) no se eliminará la autofagia, puede representar una amenaza para la homeostasis celular y la supervivencia celular. En la levadura Saccharomyces cerevisiae, la privación de nutrientes (por ejemplo, el hambre de nitrógeno) o el daño se puede promover la renovación selectiva de las mitocondrias de la autofagia en un proceso denominado mitophagy ^5-9.

Se describe un método simple microscopio de fluorescencia para evaluar la autofagia. Para mayor claridad, restringimos nuestra descripción aquí para ver cómo el método puede ser usado para monitorear mitophagy en células de levadura. El ensayo hace uso de un fluorescente reportero, Rosella, que es un biosensor de doble emisión que comprende un pH relativamente estable proteína fluorescente roja vinculado a un pH sensible a la proteína verde fluorescente. El funcionamiento de este periodista se basa en las diferencias de pH entre la vacuola (pH ~ 5.0 hasta 5.5) y mitocondrias (pH ~ 8,2) en las células vivas. Bajo condiciones de cultivo, las células de tipo salvaje muestran tanto la fluorescencia de color rojo y verde distribuido de una manera característica de las mitocondrias. Emisión de fluorescencia no se asocia con la vacuola. Al ser sometido al hambre de nitrógeno, una condición que induce mitophagy, además de fluorescencia de color rojo y verde etiquetado de las mitocondrias, células presentan la acumulación de rojo, pero no de fluorescencia verde, en el lumen vacuolar ácida que representa la entrega de las mitocondrias de la vacuola. Anotando las células con rojo, pero vacuolas fluorescente verde no puede ser utilizado como una medida de la actividad en las células mitophagic ^5,10-12.

Protocol

Selección de cepas de levadura de control adecuado

El ensayo se basa en el experimentador evaluar visualmente la acumulación de fluorescencia de color rojo en la vacuola de levadura. Como tal, el ensayo es subjetiva y se basa en la selección de cepas de control adecuadas y las condiciones de crecimiento. Un control de tipo salvaje se utiliza para indicar los niveles de autofagia que normalmente se espera. Como control negativo un nulo esfuerzo para la expresión de uno de los principales genes autofagia (por ejemplo, ATG3) es adecuado, estas cepas no se puede entregar el material (por ejemplo, las mitocondrias, núcleo) a la vacuola

1. Transformación de células de levadura con el plásmido de ADN

Las células de levadura se puede hacer fácilmente aptas para la transformación mediante el tratamiento con LiAcetate. Kits comerciales pueden ser comprados (por ejemplo, Easycomp, Invitrogen) y los protocolos publicados están disponibles ^13.

En este protocolo se utiliza cepa de tipo salvaje BY4741 (MAT un his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0), y algunos miembros de una completa biblioteca de supresión cepas mutantes (por ejemplo, Δ atg3) que se derivan de ella, cada expresión de falta de otro gen no esencial. La biblioteca supresión cepa representa una herramienta valiosa para la investigación de la autofagia con Rosella basada en sondeos. El reportero de empleados en este protocolo es mt-Rosella de las mitocondrias (Fig. 2A), codificada por pAS1NB: mt-Rosella ^12.

Los siguientes pasos se basan en el uso de células hechas competente mediante el kit de transformación Easycomp y almacenado congelado a -80 ° C para facilitar su uso.

1. Equilibre la solución III (Easycomp transformación Kit) a temperatura ambiente 30 minutos antes de añadir a las células de levadura.
2. Añadir 2-2,5 l (~ 100 ng / l) de ADN de plásmido que codifica la periodista (pAS1NB: mt-Rosella) a un estéril 1,7 ml con tapa de tubo de microcentrífuga de plástico.
3. Añadir 5 l de la suspensión recién descongelado de células de levadura y mezclar competente mediante pipeteo suave.
4. Añadir 50 l de solución III (Easycomp transformación Kit) y agitar para mezclar. 1.5) Se incuban las reacciones de transformación durante 1 hora a 28-30 ° C con una mezcla vigorosa cada 15 minutos usando un mezclador de vórtice o manualmente accionando el tubo con el dedo.
5. Transferir cuidadosamente la mezcla de transformación en una sola placa de agar YMM crecimiento suplementado con histidina, metionina y uracilo, y suavemente distribuir las células alrededor de la superficie del agar con un esparcidor de vidrio estéril. Las células de levadura son frágiles en esta etapa y un manejo suave puede aumentar el rendimiento de los transformantes.
6. Incubar las placas de crecimiento de 2 a 4 días a 28-30 ° C o hasta que las colonias aparecen unos 2-3 mm de diámetro.

2. Confirmando la expresión de Rosella en células de levadura

Antes de embarcarse en experimentos detallados de la correcta localización y la expresión eficiente de Rosella debe ser confirmado.

1. Con mondadientes estéril seleccionar para cada cepa 5 colonias aisladas de la placa de la transformación y suspender las células en 50 l de agua estéril en esterilizada 1,7 ml con tapa de tubo de microcentrífuga de plástico.
2. Lugar 10 l de cada suspensión celular en la etiqueta por separado portaobjetos de vidrio (76 x 26 mm) y la tapa de la suspensión celular con una plaza cubreobjetos (22 x 22 mm).
3. Inmediatamente examinar las células para la emisión de fluorescencia utilizando un microscopio de fluorescencia (por ejemplo, Olympus Fluoview FV500). Busque fuerte fluorescencia verde y el rojo y el etiquetado típico de localización mitocondrial (Fig. 2B y 2C).
4. El resto de cada colonia examinados por fluorescencia de esta manera deben ser inoculadas en un plato YMM de cultivo fresco.
5. Incubar las placas a 28-30 º C durante 2 días hasta que la colonia es de aproximadamente 3.2 mm de diámetro.

3. Crecimiento celular y la inducción de la autofagia

La autofagia puede ser inducida mediante un número de diferentes condiciones experimentales, incluida la entrada en fase estacionaria, cambio de fuente de carbono, la administración de rapamicina, o de hambre de nitrógeno. Nosotros usamos el hambre de nitrógeno como el método para inducir mitophagy.

1. Inocular una colonia en 10 ml de medio de cultivo que contienen el etanol y los suplementos auxotróficos apropiado.
2. Incubar los cultivos de levaduras a 28-30 ° C con agitación orbital (200 rpm) durante aproximadamente 48 horas. Las células deben estar en fase de crecimiento a mediados de registro.
3. Pellet de células muestras duplicadas de 1 ml de la cultura en estéril 1,7 ml tapa snap-tubos de plástico de la centrifugadora por centrifugación a 2.000 xg durante 2 minutos a temperatura ambiente. Con cuidado, retirar y desechar el sobrenadante sin perturbar el sedimento celular.
4. Se lavan las células tres veces con 1 ml de agua destilada estéril por resuspensión y centrifugación para eliminar m residualedium.
5. Después del tercer lavado resuspender las células en 100 ml de medio de cultivo o medio de nitrógeno hambre.
6. Volver a inocular las células se resuspendieron en 10 ml de medio de cultivo fresco o 10 ml de medio de nitrógeno hambre. Incubar con agitación orbital durante 6-12 horas para permitir la inducción de la mitophagy. Después de hambre preparar las células para su visualización por microscopía de fluorescencia.

Nota: El etiquetado de la vacuola con CMAC-Arg

La primera vez que se establece el ensayo es útil para confirmar la entrega bajo microscopio de fluorescencia de Rosella a la vacuola. A pesar de la vacuola de levadura es un orgánulo grande cuya ubicación a menudo pueden ser fácilmente determinadas por referencia a las imágenes de luz transmitida, en algunas cepas de la levadura y bajo ciertas condiciones de crecimiento de la vacuola puede ser fragmentado y difícil de localizar.

La vacuola puede ser fácilmente etiquetados con un tinte vacuolas cumarina basado, como CMAC-Arg (7-amino-4-chloromethylcoumarin, L-arginina amida). La acción de las proteasas vacuolares en los resultados de colorante en el etiquetado fluorescencia azul brillante de la vacuola. La emisión de color azul se pueden distinguir fácilmente de las emisiones de rojo y verde de Rosella ^11. Etiquetado con la CMAC-Arg no tiene que ser realizada de forma rutinaria, pero se recomienda para aquellos que no están familiarizados con la ubicación y el aspecto de la vacuola en la levadura.

4. Etiquetado de la vacuola con CMAC-Arg

1. Añadir la CMAC-Arg (100 mM concentración final) a las células que crecen o se le priva de nitrógeno antes de la imagen. La solución CMAC-Arg puede ser preparado de antemano, pero a medida que la solución es sensible a la luz que necesita ser protegido de la exposición a la luz.
2. Incubar a 28-30 ° C con agitación orbital (200 rpm) durante 30 minutos.
3. Pellet células por centrifugación a 2.000 xg durante 2 minutos a temperatura ambiente.
4. Eliminar el sobrenadante.
5. Se lavan las células tres veces con agua destilada estéril por resuspensión y centrifugación para eliminar medio residual y el exceso de tinte CMAC-Arg.
6. Montaje de las células para obtener imágenes como se describe a continuación.

5. Montaje de las células vivas de la levadura para la microscopía de escaneo láser confocal (CLSM)

1. Derrita 2 mg de bajo punto de fusión de agarosa por separado en alícuotas de 1 ml de medio de cultivo y medio de nitrógeno hambre mediante la incubación a 70 ° C. La agarosa fundida se mantiene a 70 ° C.
2. Suavemente que sedimenten las células en alícuotas de 1 ml de cada cultivo de células por centrifugación a 2.000 xg durante 2 minutos a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante.
3. Se lavan las células tres veces con 1 ml de agua destilada estéril por resuspensión y centrifugación como en el paso 5.2.
4. Resuspender las células se lavan en 100 l de agua destilada estéril.
5. Para montar el lugar las células 20 l de agarosa fundida en un portaobjetos de microscopio de vidrio etiquetados (76 x 26 mm).
6. Inmediatamente punto 10 l de la suspensión de células lavadas en la cama de agarosa.
7. Cubra la cama de agarosa con un cubreobjetos (22 x 22 mm). Las células se extenderá por toda la superficie de agarosa bajo el cubreobjetos.
8. Para prevenir la deshidratación y el movimiento del cubreobjetos durante la exploración Selle cuidadosamente los bordes de los portaobjetos con una fina capa de esmalte de uñas.
9. Cuando el esmalte esté completamente seco (10 min) de la diapositiva está listo para ver por Cuidado con microscopía de fluorescencia: esmalte de uñas puede causar daño a los objetivos de microscopio.
10. Células montado con esta técnica se pueden observar hasta 1 hora después del montaje.

6. Autofagia visualizar utilizando CLSM

El nivel de la autofagia en una población de células se evalúan regularmente mediante la determinación del número de células que presentan una fluorescencia de color rojo vacuolar antes y después de la inducción de la autofagia. Lo ideal sería que la progresión de la autofagia es un control en los puntos de tiempo seleccionado después de la inducción de la autofagia (Fig. 3). Esto se realiza mejor mediante la visualización a través del binocular microscopio. Es importante que los controles adecuados se utilizan (por ejemplo, Δ atg3 mutante) y que los valores permanecen sin cambios entre el microscopio de la observación de diferentes muestras (por ejemplo, el uso de filtros de densidad neutra, la selección de filtro).

Las células de levadura son relativamente pequeñas que requieren de un microscopio de fluorescencia buena calidad (por ejemplo, Olympus Fluoview FV500) equipados con filtros de excitación / emisión adecuado para la visualización por separado de las buenas prácticas agrarias y / o pHluorin (fluorescencia verde de emisión) (FITC filtro) y DsRed.T3 (rojo emisión de fluorescencia) (TRITC filtro).

1. El uso de un punto de vista objetivo 60x de agua no las células privadas de tipo salvaje utilizando alternativamente los filtros FITC y TRITC. Las células de tipo salvaje debe exhibir una distribución típica de las mitocondrias celulares en la periferia de las células que muestran tanto la fluorescencia de color rojo y verde. Tenga en cuenta que esta distribución de las mitocondrias es dependiente de la Pinhestablecimiento ole del microscopio confocal. Por lo general, utilizar un valor inferior del agujero de alfiler de 125 micras que sólo permite la mitocondria para ser observado como una serie de puntos localizados en la periferia de la célula (Fig. 2C) para que la vacuola no está oculto ^12. Si un valor alto de agujero de alfiler (200 m) se utiliza esto permite que la típica red mitocondrial filamentosas distribuidas por toda la célula (y los cambios que experimenta) para ser observado ^11. No hay otras estructuras de la célula debe ser marcado con fluorescencia.
2. Secuencialmente ver las células de cada uno de los puntos de tiempo después de la transferencia a medio morir de hambre. Visualizar alternativamente usando los filtros de emisión verde y rojo. A las 6 h de hambre el tiempo de fluorescencia punto rojo, pero no hay emisión verde correspondiente debe ser perceptible en la vacuola. Localización vacuolar puede confirmaron por separado con CMAC-Arg (Fig. 2C). Ver ~ 200 células y contar el número que sólo muestran fluorescencia de color rojo en la vacuola (es decir, la captación vacuolar de las mitocondrias).
3. Contar con la acumulación vacuolar de todos los puntos de tiempo de observación> 200 células y el porcentaje de células que muestran trama acumulación vacuolar.
4. Examine la autofagia-negativas control de las células que expresan mt-Rosella antes de la inanición y el hambre después de seis horas.

7. Los resultados representativos:

Aquí, mostramos los resultados típicos obtenidos con mt-Rosella, expresada en el tipo salvaje y Δatg3 células mutantes. Bajo condiciones de cultivo con etanol como fuente de carbono, tanto de tipo salvaje y Δatg3 células mutantes muestran una distribución celular de la fluorescencia (rojo y verde) típica de las mitocondrias en células de levadura. Roja y de emisión de fluorescencia de color verde no se detecta en la vacuola (Fig. 2B y 2C). Al ser sometido al hambre de nitrógeno durante 6 horas y luego más allá, además de fluorescencia de color rojo y verde que corresponde a las mitocondrias, las células de tipo salvaje también muestran la acumulación de rojo, pero no la fluorescencia verde en el lumen vacuolar (Fig. 2B;. Fig. 3) . Sin embargo, en las células mutantes Δatg3 fluorescencia ni rojo ni verde, se acumula en el lumen vacuolar (Fig. 2C;. Fig. 3).

Figura 1. Arriba, el esquema de los orgánulos y compartimentos de una célula de levadura. En pocas palabras, una visión centrada en la vacuola de una célula de levadura se presenta lo que indica la degradación de la autofagia diferentes orgánulos y compartimentos. Algunas de las diferencias entre los distintos orgánulos específicos de los tipos de autofagia (por ejemplo, mitophagy, nucleophagy) incluir la especificidad (la selección de carga) de los contenidos envuelto, varias necesidades intracelulares y señales extracelulares (por ejemplo, el hambre, el daño), señales específicas, ATG genes y la dependencia del tiempo.

Figura 2. (A) Representación esquemática de mt-Rosella. La secuencia líder mitocondrial (en este caso de la citrato sintasa) se utiliza para apuntar el biosensor Rosella a la matriz mitocondrial. Excitación y emisión máximos, tanto para la proteína roja fluorescente (DsRed.T3) y la proteína verde fluorescente (pHluorin) se indican. A pH alto (pH ~ 8.2 mitocondrial) el biosensor fluorescencia roja y verde, sin embargo, a pH bajo (pH vacuolar ~ 5.5) que emite fluorescencia solamente el rojo. (B) Representación esquemática de los resultados esperados en el tipo salvaje y Δ atg3 células mutantes que expresan mt-Rosella. (C) Los resultados reales obtenidos por CLSM de células de tipo salvaje en cultivo y las condiciones de nitrógeno hambre. De izquierda a derecha:. DIC (diferencia de contraste), PP (DsRed.T3) emisión fluorescente, GFP (pHluorin) de fluorescencia de emisión, CMAC-Arg fluorescencia y la imagen de fusión (D) Los resultados reales obtenidos por microscopía de fluorescencia de células mutantes en Datg3 crecimiento y las condiciones de nitrógeno hambre. De izquierda a derecha: DIC (diferencia de contraste), PP (DsRed.T3) emisión fluorescente, GFP (pHluorin) de fluorescencia de emisión, CMAC-Arg fluorescencia y la imagen de fusión.

Figura 3. El porcentaje de tipo salvaje y mutante Δ células atg3, expresando mt-Rosella y cultivados en el hambre de nitrógeno, que presentan una fluorescencia de color rojo en la vacuola durante un curso de 48 horas. El porcentaje de células que muestran la acumulación de fluorescencia de color rojo en la vacuola se registró a las 0, 6, 12, 24 y 48 horas después de comenzar el hambre de nitrógeno.

Discussion

En las imágenes representativas se presentan en la figura. 2B y 2C que se puede ver claramente que el uso de orgánulos específicos de los periodistas fluorescentes y microscopía de fluorescencia proporciona evidencia de localización mitocondrial / distribución, tanto en crecimiento y las células de hambre de nitrógeno, y permite mitophagy para ser visualizados.

Es de destacar que este método no se limita a mitophagy siguiente. Autofagia de otros componentes celulares u orgánulos (por ejemplo, los ribosomas, las gotas de lípidos, peroxisomas, retículo endoplasmático y el núcleo) puede ser controlado con un etiquetado adecuado. Detalles de la construcción de biosensores Rosella, condiciones de cultivo celular y los resultados típicos de rotación del núcleo (nucleophagy) han sido reportados ^11,12 ilustra la aplicación más amplia del método.

El uso de orgánulos específicos de los periodistas fluorescentes de la autofagia monitoreo requiere varias consideraciones de diseño para la construcción de tenerse en cuenta. Estos incluyen: (1) la selección y la fusión con la señal de la adecuada focalización de lograr orgánulos específicos de selección; (2) la selección de una proteína fluorescente adecuada (s), (3) emisión de fluorescencia fuerte, (4) correcta localización de orgánulos y / o distribución dentro de la célula. Una vez que el reportero de orgánulos específicos se ha expresado con éxito en la cepa huésped de levadura elegido un segundo grupo de consideraciones se convierten en: (1) las condiciones de crecimiento de la levadura, (2) la preparación de muestras de células, (3) imágenes de los parámetros, ya que es importante que los parámetros seleccionados para CLSM (por ejemplo, la intensidad del láser, frecuencia y modo, el valor del agujero de alfiler, el valor de zoom, los objetivos utilizados o la exposición de la cámara CCD) se mantienen a lo largo de un experimento asegurarse de que se pueden hacer comparaciones entre el control (células de crecimiento) y las muestras de hambre; ( 3) la inducción de la autofagia y exitosa entrega de la periodista en la vacuola.

En general, este método de microscopía de fluorescencia es fácil y relativamente rápido, y tiene una aplicación potencial para el cribado de alto rendimiento para los nuevos fármacos que facilitan o inhiben la autofagia, y también para los genes que regulan o modulan la autofagia.