En fluorescensmikroskopi-analys för övervakning Mitophagy i jästen Saccharomyces cerevisiae

Summary

En robust metod för att övervaka leveransen av organeller till sura lumen i jästen vacuole för nedbrytning och återvinning beskrivs. Metoden bygger på särskild märkning av mål organeller med en genetiskt kodade med dubbla utsläpp fluorescens pH-Biosensor, och visualisering av enskilda celler med hjälp av fluorescensmikroskopi.

Abstract

Autophagy är viktigt för omsättningen av cellulära komponenter under en rad olika förhållanden. Det tjänar ett viktigt homeostatiska fungera så bra som en kvalitetskontroll mekanism som kan rikta och selektivt försämra cellulära material inklusive organelles1-4. Till exempel, skadade eller överflödiga mitokondrier (Fig. 1), inte bortskaffas genom autophagy, kan utgöra ett hot mot cellulär homeostas och cellöverlevnad. I jäst, kan Saccharomyces cerevisiae, näringsämnen deprivation (t.ex. kväve svält) eller skada främja selektiva omsättning mitokondrier genom autophagy i en process som kallas mitophagy ^5-9.

Vi beskriver en enkel fluorescensmikroskopi metod för att bedöma autophagy. För tydlighetens skull vi begränsa vår beskrivning här för att visa hur metoden kan användas för att övervaka mitophagy i jästceller. Analysen använder sig av en fluorescerande reporter, Rosella, som är en dubbel-utsläpp biosensor bestående av en relativt pH-stabilt rött fluorescerande protein kopplade till en pH-känsliga grönt fluorescerande protein. Driften av denna reporter bygger på skillnader i pH-värde mellan vacuole (pH ~ 5,0-5,5) och mitokondrier (pH ~ 8,2) i levande celler. Under odlingsförhållanden vildtyp celler uppvisar både röda och gröna fluorescens fördelas på ett sätt typisk för mitokondrier. Fluorescens utsläpp är inte förknippas med vacuole. När de utsätts för kväve svält, ett tillstånd som mitophagy inducerar, förutom rött och grönt fluorescens märkning mitokondrierna, cellernas uppvisar ansamling av röda, men inte grön fluorescens, i den sura vakuolär lumen motsvarar leverans av mitokondrier till vacuole. Scoring celler med röd, men inte grönt fluorescerande vakuoler kan användas som ett mått på mitophagic aktiviteten i cellerna ^5,10-12.

Protocol

Val av lämpliga stammar kontroll jäst

Analysen bygger på att försöksledaren visuellt utvärdera ansamling av röda fluorescens i jästen vacuole. Som sådan analysen är subjektiv och bygger på valet av lämpliga kontrollåtgärder stammar och villkor tillväxt. En vild typ kontrollen används för att ange nivåer autophagy normalt förväntas. Som en negativ kontroll en stam null för uttryck för en av de gener kärnan autophagy (t.ex. ATG3) är lämplig, sådana stammar kan inte leverera material (t.ex. mitokondrier, cellkärna) till vacuole

1. Omvandling av jästceller med plasmid-DNA

Jästceller kan lätt göras behörig för omvandling genom att behandla med LiAcetate. Kommersiella kit kan köpas (t.ex. EasyComp, Invitrogen) och publicerade protokoll finns tillgängliga ^13.

I detta protokoll använder vi vild typ stam BY4741 (MAT ett his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0), och vissa medlemmar av ett omfattande bibliotek med radering muterade stammar (t.ex. Δ atg3) härrör från den, varje saknar uttryck för en annan icke-väsentliga genen. Strykningen stambibliotek utgör ett värdefullt verktyg för att undersöka autophagy med Rosella-baserad sonder. Reportern som används i detta protokoll MT-Rosella för mitokondrier (Fig. 2A), som kodas av pAS1NB: MT-Rosella ^12.

Följande steg är baserad på användning av celler som behöriga att använda EasyComp Transformation Kit och förvaras frysta vid -80 ° C för bekväm användning.

1. Jämvikta Solution III (EasyComp Transformation Kit) till rumstemperatur 30 minuter innan du lägger till jästceller.
2. Tillsätt 2-2,5 l (~ 100 ng / l) av plasmid-DNA-kodning reportern (pAS1NB: MT-Rosella) till en steril 1,7 ml snap-lock i plast mikrocentrifugrör.
3. Tillsätt 5 ìl nyligen upptinad suspension av behöriga jästceller och blanda genom försiktig pipettering.
4. Tillsätt 50 ìl Solution III (EasyComp Transformation Kit) och skaka för att blanda. 1,5) Inkubera omvandling reaktioner under 1 timme vid 28-30 ° C med kraftfull blandning var 15 minuter med hjälp av en vortexblandare eller manuellt genom att ställa röret med fingret.
5. Försiktigt överföra omvandlingen blandningen till en enda YMM agar epifysplattan kompletteras med histidin, metionin och uracil och försiktigt distribuera celler runt ytan av agar med en steril glas spridare. Jästceller är ömtåliga i detta skede och varsam hantering kan öka utbytet av transformants.
6. Inkubera epifysplattor för 2 till 4 dagar vid 28-30 ° C eller tills kolonier visas ca 2-3 mm i diameter.

2. Bekräfta uttryck för Rosella i jästceller

Innan man börjar på detaljerade experiment rätt lokalisering och effektivt uttryck för Rosella bör bekräftas.

1. Använda steril tandpetare välja för varje stam 5 enstaka kolonier av omvandling plattan och resuspendera cellerna i 50 l med sterilt vatten i separata sterila 1,7 ml snap-lock i plast mikrocentrifugrör.
2. Placera 10 l av varje cellsuspension på separata märkt objektglas glaset mikroskop (76 x 26 mm) och täcker cellsuspension med en fyrkantig täckglas (22 × 22 mm).
3. Omgående undersöka cellerna för fluorescens utsläpp med hjälp av en fluorescensmikroskop (t.ex. Olympus Fluoview FV500). Leta efter en stark grön och röd fluorescens och märkning typisk för mitokondriell lokalisering (Fig. 2B och 2C).
4. Resten av varje koloni undersökas för fluorescens på detta sätt bör inympas på en ny YMM tillväxt plattan.
5. Inkubera plattorna vid 28-30 ° C i 2 dagar tills kolonin är ca 2-3 mm i diameter.

3. Celltillväxt och framkallande av autophagy

Autophagy kan induceras med hjälp av ett antal olika experimentella förhållanden, inklusive inträde i stationär fas, förändringar i kolkälla, administration av rapamycin, eller kväve svält. Vi använder rutinmässigt kväve svält som metod för att framkalla mitophagy.

1. Inokulera en enda koloni i 10 ml odlingsmedium som innehåller etanol och lämpliga tillskott auxotrophic.
2. Inkubera jästkulturer vid 28-30 ° C med omloppsbanor skaka (200 rpm) i ca 48 timmar. Cellerna bör vara i mitten av log tillväxtfas.
3. Pellets celler från dubblett 1 ml prov av kultur i sterila 1,7 ml snap-cap rör av plast centrifugen genom centrifugering vid 2000 xgi 2 minuter i rumstemperatur. Ta försiktigt bort och kasta supernatanten utan att störa cellpelleten.
4. Tvätta cellerna tre gånger med 1 ml sterilt destillerat vatten genom resuspension följt av centrifugering för att avlägsna rester medium.
5. Efter det tredje tvätta resuspendera cellerna i 100 ml odlingsmedium eller kväve-svält medium.
6. Re-ympa den suspenderade celler till 10 ml rent tillväxt medium eller 10 ml kväve-svält medium. Inkubera med orbital skaka under 6-12 timmar så att induktion av mitophagy. Efter svält förbereda celler för visning av fluorescensmikroskopi.

OBS: märkning av vacuole med CMAC-Arg

När första upprättandet av analysen är det bra att bekräfta under fluorescensmikroskop leverans av Rosella till vacuole. Även jästen vacuole är en stor organell vars plats kan ofta lätt fastställas genom hänvisning till genomlysning bilder, i vissa stammar av jäst och under en viss tillväxt förhållanden vacuole kan vara splittrat och svårt att hitta.

Den vacuole kan lätt märkas med en kumarin-baserad vacuole färgämne som CMAC-Arg (7-amino-4-chloromethylcoumarin, L-arginin amid). Den handling av vakuolär proteaser på färgen resulterar i ljusa blå fluorescens märkning av vacuole. Den blå utsläppen kan vara lätt att skilja från de röda och gröna utsläpp av Rosella ^11. Märkning med CMAC-Arg behöver inte utföras rutinmässigt, men det rekommenderas för dem som inte är bekant med placering och utseende vacuole i jäst.

4. Märkning av vacuole med CMAC-Arg

1. Lägg till CMAC-Arg (100 mm slutlig koncentration) till växande eller kväve-svalt celler före avbildning. Den CMAC-Arg-lösning kan beredas i förväg, men eftersom lösningen är ljuskänsligt det behöver skyddas från ljus.
2. Inkubera vid 28-30 ° C med omloppsbanor skaka (200 rpm) i 30 minuter.
3. Pellets cellerna genom centrifugering vid 2000 xgi 2 minuter i rumstemperatur.
4. Kassera supernatanten.
5. Tvätta cellerna tre gånger med sterilt destillerat vatten genom resuspension följt av centrifugering för att avlägsna rester medelstora och överskott CMAC-Arg färgämne.
6. Montera celler för avbildning som beskrivs nedan.

5. Montering levande jästceller för konfokala laserskanning mikroskopi (CLSM)

1. Smält 2 mg låg smältpunkt agaros i separata 1 ml alikvoter av odlingsmedium och kväve-svält mediet genom att inkubera vid 70 ° C. Den smälta agarosen bibehålls vid 70 ° C.
2. Försiktigt pellets cellerna i 1 ml portioner av varje cell kultur genom centrifugering vid 2000 xgi 2 minuter i rumstemperatur och kassera supernatanterna.
3. Tvätta cellerna tre gånger med 1 ml sterilt destillerat vatten genom resuspension och centrifugering som i steg 5,2.
4. Resuspendera tvättade cellerna i 100 l sterilt destillerat vatten.
5. För att montera cellerna plats 20 ìl smälta agarosen på en märkt glas objektglas (76 x 26 mm).
6. Omedelbart plats 10 ìl av tvättade cellsuspension på agarosen sängen.
7. Täck agarosen sängen med ett täckglas (22 × 22 mm). Cellerna kommer att spridas över agarosen ytan under täckglas.
8. För att förhindra uttorkning och rörelse av täckglas under avbildning noggrant försegla kanterna täckglas med en tunn film av nagellack.
9. När nagellack är helt torr (10 min) bilden är redo att visa genom fluorescensmikroskopi Varning: nagellack kan orsaka skador på mikroskop mål.
10. Celler monteras med denna teknik kan ses upp till 1 timme efter montering.

6. Visualisering autophagy med CLSM

Nivån på autophagy i en population av celler rutinmässigt bedömas genom att antalet celler som visar rött vakuolär fluorescens före och efter induktion av autophagy. Helst utvecklingen av autophagy följs upp vid utvalda tidpunkter efter induktion av autophagy (Fig. 3). Detta utförs bäst genom att visualisera genom mikroskop kikare. Det är viktigt att korrekta kontroller som används (t.ex. Δ atg3 mutant) och att i mikroskop förblir oförändrade mellan att observera olika prover (t.ex. användning av neutrala täthetsfilter, filtrera urval).

Jästceller är relativt små som kräver ett bra mikroskop kvalitet fluorescens (t ex Olympus Fluoview FV500) utrustade med excitation / emission filter lämpliga för separat visualisering av GFP och / eller pHluorin (grön fluorescens utsläpp) (FITC-filter) och DsRed.T3 (röd fluorescens utsläpp) (TRITC filter).

1. Med hjälp av en 60x för vatten objektiva, icke-svalt vildtyp celler med växelvis FITC och TRITC filter. Vildtyp celler bör uppvisa en typisk cellulär fördelning av mitokondrier i utkanten av de celler som visar både röda och gröna fluorescens. Observera att denna fördelning av mitokondrier är beroende av pinhole inställning av konfokalmikroskop. Vi använder i allmänhet en lägre hål värde av 125 ìm som bara tillåter mitokondrierna som måste iakttas som en serie prickar lokaliserad i utkanten av cellen (Fig. 2C) så att vacuole inte skyms ^12. Om en hög hål värde (200 mikrometer) används detta gör att den typiska fintrådiga mitokondriella nätverk fördelade över hela cellen (och de förändringar det undergår) som skall uppfyllas ^11. Inga andra strukturer i cellen ska vara fluorescerande.
2. Sekventiellt för celler för varje tidpunkter följande överföring till svält medium. Visualisera växelvis med grönt och rött utsläpp filter. På 6 timmar svält tidpunkt röd fluorescens, men ingen motsvarande gröna utsläpp bör märkbara i vacuole. Vakuolär lokalisering kan separat bekräftas med CMAC-Arg (Fig. 2C). Visa ~ 200 celler och räkna antalet som visar bara röd fluorescens i vacuole (dvs. vakuolär upptag av mitokondrier).
3. Räkna vakuolär ackumulering för alla tidpunkter att observera> 200 celler och sedan rita procentandel av cellerna som visar vakuolär ackumulering.
4. Undersök autophagy-negativ kontroll celler som uttrycker mt-Rosella innan svält och efter 6 h svält.

7. Representativa resultat:

Här visar vi typiska resultat som erhållits med hjälp av mt-Rosella, uttryckt i vild typ och Δatg3 muterade celler. Under odlingsförhållanden med etanol som kolkälla, både vilda typ och Δatg3 muterade celler uppvisar en cellulär fördelning av fluorescens (röd och grön) som är typiska för mitokondrier i jästceller. Röd och grön fluorescens utsläpp är inte registreras i vacuole (Fig. 2B och 2C). När det utsätts för kväve svält i 6 timmar och därefter sedan, förutom rött och grönt fluorescens motsvarande mitokondrierna, vildtyp celler uppvisar också en ansamling av röda, men inte grön fluorescens i vakuolär lumen (Fig. 2B;. Fig. 3) . Men i Δatg3 muterade celler röda eller gröna fluorescens ansamlas i vakuolär lumen (Fig. 2C;. Fig. 3).

Figur 1. Top, system av organeller och fack i en jäst cell. Botten, ett vacuole-centrerad syn på en jästcell presenteras visar autophagic nedbrytning av olika organeller och fack. Några av skillnaderna mellan de olika organell-specifika typer av autophagy (t.ex. mitophagy, nucleophagy) inkluderar specificitet (lasten urval) av de uppslukas innehållet, olika intracellulära behov och extracellulära signaler (t ex svält, skador), specifika signaler, ATG gener och tidsfaktorn.

Figur 2. (A) Schematisk bild av MT-Rosella. Den mitokondriella ledare sekvens (i detta fall av citrat-syntas) används för att rikta Rosella biosensor till mitokondriella matrisen. Excitation och emission gränsen för både rött fluorescerande protein (DsRed.T3) och grönt fluorescerande protein (pHluorin) anges. Vid höga pH (mitokondriell pH ~ 8.2) i biosensor fluorescerar både rött och grönt, men vid låga pH (vakuolär pH ~ 5,5) det fluorescerar bara rött. (B) Schematisk bild av förväntade resultat i vild typ och Δ atg3 muterade celler som uttrycker MT-Rosella. (C) Faktiska resultat som CLSM för vildtyp celler i odling och kväve villkor svält. Från vänster till höger:. DIC (skillnad i kontrast), RFP (DsRed.T3) fluorescens utsläpp, GFP (pHluorin) fluorescens utsläpp, CMAC-Arg fluorescens och slå samman bild (D) Faktiska resultat som fluorescensmikroskopi för Datg3 muterade celler under växer och kväve villkor svält. Från vänster till höger: DIC (skillnad i kontrast), RFP (DsRed.T3) fluorescens utsläpp, GFP (pHluorin) fluorescens utsläpp, CMAC-Arg fluorescens och slå samman bilden.

Figur 3. Andelen av vild typ och Δ atg3 muterade celler, som uttrycker MT-Rosella och vuxit under kväve svält, som visar rött fluorescens i vacuole under en tidsperiod på 48 timmar. Andelen celler som visar ansamling av röda fluorescens i vacuole spelades in vid 0, 6, 12, 24 och 48 timmar efter påbörjandet av kväve svält.

Discussion

I den representativa bilder som presenteras i bild. 2B och 2C kan man tydligt att användningen av organell-specifik fluorescerande reportrar och fluorescensmikroskopi ger bevis för mitokondriell lokalisering / distribution i både växande och kväve-svalt celler och låter mitophagy ska visualiseras.

Det bör betonas att denna metod inte är begränsat till följande mitophagy. Autophagy av andra cellulära komponenter eller organeller (t.ex. ribosomer, lipid droppar, peroxisomer, endoplasmatiska retiklet och cellkärnan) kan övervakas med lämplig märkning. Detaljer om Rosella biosensor konstruera, cell villkor kultur och typiska resultat för omsättning av kärnan (nucleophagy) har rapporterats ^11,12 illustrerar bredare tillämpning av metoden.

Användning av organell-specifika fluorescerande reportrar för övervakning autophagy kräver flera överväganden konstruera design hållas i åtanke. Dessa inkluderar: (1) val av och fusion till lämplig inriktning signalen att nå organell-specifik inriktning, (2) val av en lämplig fluorescerande protein (s), (3) stark fluorescens utsläpp, (4) rätt organell lokalisering och / eller fördelning inom cellen. När den organell-specifika reporter har framgångsrikt uttryckts i den valda jästen värd stam en andra grupp av överväganden blir: (1) jäst tillväxt villkor, (2) cellen provberedning, (3) imaging parametrar som det är viktigt att de parametrar som valts för CLSM (t.ex. laser intensitet, skanna hastighet och läge, hål värde, zoom värde, används mål eller exponering för CCD-kamera) bibehålls under hela ett experiment att se till att jämförelser kan göras mellan kontroll (växande celler) och svalt prover, ( 3) autophagy induktion och framgångsrik leverans av reportern i vacuole.

Sammantaget är detta fluorescerande mikroskopi metoden enkel, relativt snabb och har potential ansökan för hög throughput screening för nya läkemedel som förstärker eller hämmar autophagy, och även för gener som reglerar eller modulera autophagy.