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Immunology and Infection

जनरेशन और ट्रैकिंग अध्ययन के लिए Qdot Nanocrystals साथ murine अस्थि मज्जा व्युत्पन्न वृक्ष के समान कोशिकाओं के लेबल

Published: June 2, 2011 doi: 10.3791/2785
Automatic Translation
*1, *2, 2, 1,2,3
1Molecular and Cell Biology Program, Ohio University, 2Department of Biomedical Sciences, College of Osteopathic Medicine, Ohio University, 3Department of Biomedical Engineering, Russ College of Engineering and Technology, Ohio University
* These authors contributed equally

Summary

वृक्ष के समान कोशिकाओं तेज प्रतिजनों और प्रतिरक्षा करने के लिए टी कोशिकाओं को संसाधित प्रतिजनों वर्तमान अंगों की ओर विस्थापित. Qdot nanocrystal लेबलिंग एक लंबे समय से स्थायी और स्थिर फ्लोरोसेंट संकेत प्रदान करता है. इस वृक्ष के समान कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा विभिन्न अंगों के लिए ट्रैकिंग की अनुमति देता है है.

Abstract

वृक्ष के समान कोशिकाओं (DCs) पेशेवर पेश प्रतिजन (APCs) कोशिकाओं परिधि के ऊतकों में और thymus, अस्थि मज्जा, प्लीहा, लिम्फ नोड्स और Peyer 1-3 पैच जैसे प्रतिरक्षाविज्ञानी अंगों में पाया हैं. DCs परिधि के ऊतकों के नमूने में प्रतिजनों की उपस्थिति है, जो वे ले, प्रक्रिया और प्रमुख उतक अनुरूपता अणुओं (MHC) के संदर्भ में उनकी सतह में मौजूद जीव मौजूद हैं. फिर, प्रतिजन लोड DCs प्रतिरक्षाविज्ञानी अंगों जहां वे टी लिम्फोसाइटों विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया ट्रिगर करने के लिए प्रसंस्कृत प्रतिजन वर्तमान की ओर पलायन. DCs के प्रवासी क्षमताओं का मूल्यांकन करने के लिए एक तरीका उन्हें फ्लोरोसेंट 4 रंगों के साथ लेबल है .

इसके साथ हम Qdot फ्लोरोसेंट nanocrystals का उपयोग करने के लिए murine अस्थि - मज्जा व्युत्पन्न डीसी लेबल प्रदर्शित करता है. इस लेबलिंग का लाभ यह है कि Qdot nanocrystals स्थिर और लंबे समय तक चलने प्रतिदीप्ति कि उन्हें बरामद ऊतकों में लेबल कोशिकाओं का पता लगाने के लिए आदर्श बनाने के अधिकारी है. यह पूरा करने के लिए, पहली कोशिकाओं murine हड्डी marrows से बरामद किया जाएगा और granulocyte बृहतभक्षककोशिका कॉलोनी उत्तेजक कारक की उपस्थिति में 8 दिनों के लिए सभ्य क्रम में डीसी भेदभाव प्रेरित. इन कोशिकाओं को तो इन विट्रो ऊष्मायन में कम से फ्लोरोसेंट Qdots के साथ लेबल किया जाएगा. सना हुआ कोशिकाओं के साथ एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी visualized किया जा सकता. कक्ष में इस बिंदु पर प्रायोगिक पशुओं में इंजेक्ट किया जा सकता है है या पर इन विट्रो ऊष्मायन में परिपक्व कोशिकाओं में भड़काऊ उत्तेजनाओं के साथ किया जा सकता है . हमारे हाथ में, डीसी परिपक्वता फ्लोरोसेंट संकेत की हानि निर्धारित नहीं था और न ही करता है Qdot धुंधला DCs के जैविक गुणों को प्रभावित. इंजेक्शन पर, इन कोशिकाओं प्रतिरक्षा अंगों में फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा किया जा सकता है ठेठ विच्छेदन और निर्धारण प्रक्रियाओं के बाद की पहचान.

Protocol

1. माउस femurs और tibiae और अस्थि मज्जा की कोशिकाओं के संस्कृति के विच्छेदन

  1. सीओ 2 asphyxiation द्वारा 2 चूहों बलिदान और ध्यान से हड्डी समाप्त होता है काटने के बिना tibias और femurs काटना .
  2. टिशू पेपर का उपयोग करके सभी संलग्न ऊतकों से हड्डियों को साफ. हड्डियों को तोड़ नहीं सावधान रहो.
  3. एक 35 मिमी पेट्री डिश में 10 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में विसर्जन के द्वारा हड्डियों जीवाणुरहित. इस पल से, एक जैव सुरक्षा हुड के अंदर काम करने के लिए सेल संस्कृतियों के संक्रमण से बचने के लिए.
  4. इथेनॉल से हड्डियों को पुनर्प्राप्त और जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर एक पेट्री डिश में 5 मिनट के लिए उन्हें सूखी हवा चलो.
  5. अपनी thinnest टिप द्वारा आधे में femurs, और टिबिअ कट. RPMI माध्यम से 1 मिलीग्राम (सीरम के बिना, लेकिन एंटीबायोटिक दवाओं के साथ) एक बाँझ पेट्री डिश पर एक बाँझ सिरिंज का उपयोग कर के साथ हड्डी के अंदर दिखे.
  6. सेल निलंबन और एकत्र 2X धोया RPMI माध्यम से 10 मिनट centrifugation द्वारा एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में एक झूलते बाल्टी रोटर के साथ एक प्रशीतित अपकेंद्रित्र में 1,100 RPM को (4 डिग्री सेल्सियस) पर.
  7. पिछले धोने के बाद, ACK lysis बफर के 2 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते क्रम में लाल रक्त कोशिकाओं को खत्म करने.
  8. 10% FBS के साथ RPMI के 13 मिलीलीटर जोड़ें resuspend, और इस माध्यम में ही 1.6 में वर्णित के रूप में सेटिंग्स के साथ 2X धोने.
  9. कोशिकाओं की गणना, 2 को समायोजित x 10 5 / RPMI 10% FBS, और (20 ​​एनजी / एमएल अंतिम एकाग्रता) rm-जीएम-CSF 5 जोड़ने के साथ कोशिकाओं मिलीलीटर .
  10. एक बाँझ, सूक्ष्मजीवविज्ञानी गुणवत्ता, 10 सेमी पेट्री डिश, सीओ 2 इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) और संस्कृति को इस निलंबन का 10 मिलीलीटर जोड़ें.
  11. तीन दिन बाद, 20 rmGM सी.एस.एफ. की एनजी / एल के साथ तैयार प्लेटों के प्रत्येक के लिए RPMI 10% FBS की एक और 10 मिलीलीटर जोड़ने.
  12. तीन दिन बाद सेल निलंबन के 10 मिलीलीटर प्रत्येक पेट्री डिश से बरामद कर रहे हैं, 1.6 के रूप में centrifuged rmGM-CSF के साथ RPMI 10% FBS के समान मात्रा में resuspended और पेट्री डिश को लौट. कक्ष सीओ 2 इनक्यूबेटर में 2 अतिरिक्त दिनों के लिए सुसंस्कृत हैं.

2. संग्रह और DCs की लेबलिंग

  1. संस्कृति में 8 दिन के बाद शिथिल पक्षपाती कोशिकाओं ताजा माध्यम के साथ पेट्री डिश धोने से बरामद कर रहे हैं. इस प्रोटोकॉल हमारे हाथ में 2-4 x10 8 DCs के आसपास renders है. कक्ष प्रवाह cytometry द्वारा डीसी phenotype के लिए विश्लेषण किया जा सकता है.
  2. एकत्र कोशिकाओं तो Qtracker 655 सेल लेबल सख्ती से निर्माता के निर्देशों का पालन किट के साथ लेबल रहे हैं.
  3. हम एक 10 एनएम एकाग्रता Qdots के साथ उत्कृष्ट परिणाम murine अस्थि मज्जा व्युत्पन्न DCs लेबलिंग मिला है. यह पूरा करने के लिए, Qtracker सेल लेबल किट घटकों की aliquots A और B बराबर मात्रा में मिश्रित कर रहे हैं, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए incubated, और तुरंत एस के लिए 30 vortexing साथ 1 / 100 ताजा माध्यम पतला
  4. 5 x 10 6 DCs दाग ​​के लिए, प्रत्येक किट ए और बी एक Eppendorf ट्यूब और कमरे Temp पर 5 मिनट के लिए सेते में घटकों के 5 μl मिश्रण. फिर, RPMI 10% FBS सेते 1 मिलीलीटर, और 30 सेकंड के लिए भंवर में जोड़ें.
  5. 5 x10 6 DCs युक्त सेल निलंबन के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें, और 37 पर सेते ° C 60 मिनट के लिए.
  6. फिर, RPMI 10% FBS (1100 आरपीएम) में 2X कोशिकाओं धो लो. कक्ष के आगे संस्कृति के लिए या RPMI में पीबीएस में प्रयोगात्मक चूहों में इंजेक्शन के लिए किया जा सकता है resuspended.

3. लेबल डीसी का मूल्यांकन

  1. सेल लेबलिंग फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के माध्यम से मूल्यांकन किया जा सकता है. यह पूरा करने के लिए, सेल निलंबन की एक बूंद एक खुर्दबीन स्लाइड के लिए जोड़ा जाता है, एक गिलास coverslip के साथ कवर किया, और एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन खाते में ले कि इन Qdots उत्सर्जन और 565nm और 405-525nm के स्पेक्ट्रा उत्तेजना है क्रमशः के साथ मूल्यांकन किया (3 छवि )
  2. इस बिंदु पर, लेबल कोशिकाओं जानवरों इंजेक्षन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या परिपक्वता 48 घंटे के लिए इन कोशिकाओं incubating द्वारा प्रेरित किया जा सकता है (37 डिग्री सेल्सियस, सीओ 2 5) (100 एनजी / मिली) LPS और TNF (की उपस्थिति में 20 एनजी / एमएल). फ्लोरोसेंट लेबलिंग डीसी परिपक्वता (4 छवि) द्वारा प्रभावित नहीं है.

4. प्रतिनिधि परिणाम:

इसके साथ हम बताया कि कैसे murine अस्थि मज्जा व्युत्पन्न DCs तैयार करने के लिए और फ्लोरोसेंट Qdots के साथ उन्हें कैसे लेबल छवि . एक प्रक्रिया को सारांशित करने के लिए सेल प्राप्त करने के लिए, अंजीर , जबकि. 2 उन्हें Qdots के साथ लेबल की प्रक्रिया को दर्शाया गया है . के रूप में छवि में दिखाया गया है. 3, लगभग सभी कोशिकाओं को इस प्रक्रिया द्वारा चिह्नित कर रहे हैं, और इस भड़काऊ कारकों के साथ डीसी परिपक्वता (4 छवि) अंजीर. द्वारा प्रभावित नहीं है . 5 से पता चलता है कि Qdot से सना हुआ DCs (Fig.5a) गैर दाग कोशिकाओं के समान व्यवहार करते हैं जब एक सूजन कॉकटेल के साथ इलाज किया. दोनों सेल की तैयारी इसी तरह upregulate costimulatory अणुओं की अभिव्यक्ति (छवि 5b), और परिपक्वता उत्तेजनाओं पर आईएल -6 (छवि 5c) और नाइट्रिक ऑक्साइड (छवि 5d) के समान मात्रा में उत्पादन. यह previ साथ सहमतous प्रकाशित डेटा कि Qdot धुंधला संकेत डीसी की क्षमता परिपक्व प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया [6] eliciting में सक्षम कोशिकाओं में बदल प्रभावित नहीं करती. इन कोशिकाओं को फिर प्रायोगिक पशुओं को इंजेक्शन लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. के रूप में छवि में दिखाया गया है. 6, चूहों में लेबल DCs के अंतःशिरा इंजेक्शन के बाद 2 दिनों, हम Qdot से सना हुआ तिल्ली में कोशिकाओं का पता लगाने में सक्षम थे . यह भी है [6] गैर इनवेसिव इमेजिंग और प्रवाह cytometry द्वारा पिछले प्रकाशित Qdot nanocrystals के उपयोग को दिखाने के लिए vivo में डीसी के प्रवास का मूल्यांकन डेटा के साथ समझौते में.

चित्रा 1
चित्रा 1 अस्थि मज्जा से डीसी पीढ़ी के फ्लो चार्ट. इसके साथ हम इस प्रक्रिया को दर्शाती अस्थि मज्जा व्युत्पन्न डीसी को प्राप्त है. दोनों tibias और femurs dissected और ऊतकों आसपास से साफ कर रहे हैं. अस्थि सुझावों को संरक्षित कर रहे हैं और हड्डियों की आंतरिक मध्यम के साथ प्लावित कर रहे हैं. लाल रक्त कोशिकाओं को नष्ट करने के बाद, उन्हें DCs में अंतर के लिए जीएम-CSF की उपस्थिति में 8 दिन के लिए अस्थि मज्जा की कोशिकाओं सुसंस्कृत हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2. लेबलिंग प्रक्रिया का प्रवाह चार्ट. Qtracker सेल लेबल किट घटकों के समान aliquots ए और बी एक Eppendorf ट्यूब में मिश्रित कर रहे हैं. वृक्ष के समान कोशिकाओं जीएम-CSF के साथ 8 दिन अस्थि मज्जा संस्कृतियों से एकत्र कर रहे हैं और 37C में 60 मिनट के लिए लेबलिंग डाई के साथ मिलाया. तो कोशिकाओं को मीडिया में धो रहे हैं के लिए अतिरिक्त लेबलिंग कणों को खत्म करने.

चित्रा 3
चित्रा 3 लेबलिंग के तुरंत बाद DCs प्रतिदीप्त microphotography. लेबल कोशिकाओं की एक बूंद एक गिलास स्लाइड पर जमा किया गया था और एक coverslip द्वारा किया गया. फिर, नमूने एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी में मूल्यांकन किया गया और छवियों Micropublisher 5.0 डिजिटल सीसीडी रंग कैमरा (QImaging, Surrey, ई.पू. कनाडा) के माध्यम से हासिल किया गया.

चित्रा 4
चित्रा 4 DCs के इन विट्रो में 48 घंटे परिपक्वता के बाद प्रतिदीप्त microphotography . लेबल DCs LPS (100 एनजी / मिली) और सीओ 2 इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) पर कांच स्लाइड पर TNF-α (20 एनजी / एमएल) के साथ 48 घंटे के लिए सुसंस्कृत थे. फिर, नमूने पीबीएस (5 मिनट, 2X) के साथ धोया गया, एसीटोन (15 मिनट, 4 ° C) के साथ तय की और DAPI साथ counterstained. कक्ष के ऊपर के रूप में एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन में मूल्यांकन किया गया.

चित्रा 5
चित्रा 5 Qdot दाग परिपक्व DCs के जैविक गतिविधि. लेबल इसके बाद के संस्करण के रूप में इन विट्रो में परिपक्व DCs प्रवाह cytometry (ए) द्वारा विश्लेषण किया गया और (बी). (ए) Qdot से सना हुआ कोशिकाओं FL3 चैनल (PercP) में एक मजबूत संकेत देते हैं. छायांकित हिस्टोग्राम: बेदाग नियंत्रण. और निर्धारण नियंत्रण, (बी) Qdot से सना हुआ और बेदाग DCs अतिरिक्त परिपक्वता मार्कर CD86 और CD40 के खिलाफ विशेष एंटीबॉडी के साथ दाग थे. कोशिकाओं तो एक FACSort प्रवाह cytometer (Becton Dickinson, सैन जोस, CA) में विश्लेषण किया गया. इसके अतिरिक्त, आईएल (सी) और नाइट्रिक ऑक्साइड (NO) 6 परिपक्व Qdot से सना हुआ DCs और नियंत्रण के supernatants में निर्धारित किया गया है. आईएल -6 और नाइट्रिक ऑक्साइड के स्तर एलिसा विश्लेषण और Griess परख के रूप में हम पहले 7 वर्णन किया है, 8 के माध्यम से निर्धारित किया गया है. सभी डेटा इस आंकड़े में दिखाया दो या तीन स्वतंत्र के इसी तरह के परिणाम दिखाने प्रयोगों की प्रतिनिधि है. डेटा एनोवा द्वारा GraphPad सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था.

चित्रा 6
चित्रा 6 dissected ऊतकों में लेबल DCs की जांच. लेबल परिपक्व DCs (1x10 6 कोशिकाओं) नसों C57BL 6 / चूहों में इंजेक्ट किया गया . (ए) दो दिन बाद चूहों बलिदान और spleens एकत्र थे, तस्वीर जमे हुए, अक्टूबर में एम्बेडेड है, और 8 सुक्ष्ममापी वर्गों एक cryostat का उपयोग कर तैयार है. फिर, नमूने एसीटोन (15 मिनट, 4 ° C) के साथ तय किया गया और DAPI साथ counterstained. कक्ष के ऊपर के रूप में एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन में मूल्यांकन किया गया 6a चित्र: 40x बढ़ाई, अंजीर 6b: 100X बढ़ाई, अंजीर. . 6C, 400X बढ़ाई.

Discussion

Murine माइलॉयड) DCs बड़े पैमाने पर किया गया है क्रम में इस्तेमाल किया निर्धारित करने के लिए डीसी आधारित टीकों की प्रभावकारिता में सुधार; डीसी जांच: टी सेल बातचीत या डीसी विकास, और विभिन्न 9-11 रोगों में उनकी भूमिका का निर्धारण. इसके साथ हम बताएंगे कि कैसे उत्पन्न करने के लिए व्यापारियों से DCs tibias और femurs की हड्डी marrows से बरामद. हम सुझावों काटने के बिना हड्डियों को ठीक हो, हमें उन्हें 70% इथेनॉल में डुबकी द्वारा बाँझ की अनुमति, इस प्रकार संदूषण की संभावना को कम करने. अस्थि मज्जा की कोशिकाओं से DCs अंतर हम केवल 5 पहले से वर्णित के रूप में जीएम-CSF का उपयोग. हालांकि कुछ प्रोटोकॉल भी आईएल 4 का उपयोग करें, यह बताया गया है कि इस cytokine 12 जीएम-CSF के उच्च स्तर के साथ जब आवश्यक काम नहीं है. दरअसल, हम पहले दिखा दिया है कि इन DCs के लिए प्रतिरक्षा 13 प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने में सक्षम हैं. इसके अलावा, देखभाल करने के लिए मध्यम के साथ पेट्री डिश धोने द्वारा 8 दिन संस्कृतियों से ही शिथिल पक्षपाती कोशिकाओं को ठीक करने के लिए ले जाया जा के बाद से संलग्न कोशिकाओं monocyte तरह phenotype दिखा है. यहाँ हम DCs की लेबलिंग फ्लोरोसेंट Qdot कणों के साथ दिखाते हैं. यह लेबलिंग कुछ लाभ अन्य तरीकों के लिए सम्मान है. सबसे पहले, Qdots कणों को आसानी से कोशिकाओं में शामिल हैं. दूसरा, फ्लोरोसेंट संकेत बहुत अधिक है और डीसी परिपक्वता से बदल रहा है नहीं है. तीसरा, प्रतिदीप्ति जब कोशिकाओं या ऊतकों एसीटोन जैसे सॉल्वैंट्स, क्या होता है अगर GFP 14 DCs टैग प्रयोग किया जाता है, धुंधला प्रोटोकॉल का चयन करने के लिए पल में और अधिक लचीलापन दे रही है विपरीत के साथ तय कर रहे हैं खो नहीं है. अंत में, उच्च फ्लोरोसेंट इन कणों द्वारा दिए गए संकेत ऑटो प्रतिदीप्ति ऊतक के बावजूद कोशिकाओं के दृश्य की अनुमति देता है. जैसा कि पहले 6 वर्णित है, Qdot धुंधला में इन कोशिकाओं की परिपक्वता क्षमता को प्रभावित नहीं किया . इसके साथ हम बताते हैं कि Qdot से सना हुआ DCs गैर - दाग DCs के रूप में एक समान तरीके से व्यवहार करते हैं, costimulatory upregulating अणुओं, और भड़काऊ उत्तेजनाओं के जवाब में आईएल-6 और नाइट्रिक ऑक्साइड के उत्पादन. हालांकि DCs प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया ट्रिगर में विशेष कोशिकाओं रहे हैं, वे कैंसर और 4 atherosclerosis, 15, 16 जैसे रोग की स्थिति में भाग लेने के लिए दिखाया गया है. उन्होंने यह भी किया गया है angiogenic प्रक्रिया 17, 18, ​​भी structurally नए जहाजों 19, 20 के विकास में भाग लेने के रूप में सुझाव दिया है में भाग लेने का दावा किया. इस प्रकार, तरीकों कि डीसी vivo में ट्रैकिंग, और उनके विभिन्न ऊतकों 4, 21 में भौगोलिक स्थानीयकरण का निर्धारण करने के लिए अनुमति देते हैं , 22 बहुत मूल्यवान हैं.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

अनुदान CA137499 01-R15 (अमेरिकन प्लान) और ओहियो विश्वविद्यालय (अमेरिकन प्लान) से एक स्टार्टअप कोष के तहत इस काम NIH द्वारा भाग में समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6 mice Jackson Laboratory Females, 6-8 weeks old
RPMI Invitrogen 11875-119
Fetal bovine serum, qualified Invitrogen 10437-028
Antibiotic-antimycotic Invitrogen 15240-096
PBS Invitrogen 10010-049
ACK Lysing Buffer Lonza Inc. 10-548E
Recombinant murine GM-CSF PeproTech Inc 315-03
Qtracker 655 Cell Labeling Kit Invitrogen Q25021MP
Lipopolysaccharide Invitrogen tlrl-eblps
Recombinant murine TNF alpha PeproTech Inc 315-01A
CD86 antibody BD Biosciences 553691
CD40 antibody BD Biosciences 553791
Griess reagent system Promega Corp. G2930
IL-6 capture antibody eBioscience 13-7061-81
IL-6 detection antibody eBioscience 13-7062-81

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References

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