Summary
التغصنية المستضدات امتصاص الخلايا وترحيل نحو أجهزة المناعة لتقديم المستضدات المصنعة للخلايا T. Qdot النانوية الوسم يوفر إشارة طويلة الامد ومستقرة الفلورسنت. وهذا يسمح لتعقب الخلايا الجذعية إلى أجهزة مختلفة عن طريق المجهر الفلورسنت.
Abstract
الخلايا الجذعية (DCS) هي خلايا المستضد المهنية تقديم (ناقلة جنود مصفحة) وجدت في الأنسجة الطرفية والأجهزة المناعية مثل الغدة الصعترية ، ونخاع العظم والطحال والغدد الليمفاوية وبقع باير 1-3. البلدان النامية الموجودة في عينة الأنسجة الطرفية الكائن الحي عن وجود مستضدات ، وهو ما يستغرق والعملية وحاضرا في سطحها في سياق جزيئات التوافق النسيجي الرئيسي (MHC). ثم ، مستضد تحميل البلدان النامية يهاجرون إلى الأجهزة المناعية حيث تقديم المستضد لمعالجة الخلايا اللمفية تي مطلقة استجابات مناعية معينة. طريقة واحدة لتقييم قدرات البلدان النامية من الهجرة هو التسمية لهم الأصباغ الفلورية 4.
طيه أننا شرح استخدام البلورات النانوية نيون Qdot لتسمية الفئران نخاع العظام المستمدة من العاصمة. وميزة هذا الوسم هو أن تمتلك Qdot البلورات النانوية مضان مستقرة وطويلة الأمد التي تجعلها مثالية للكشف عن الخلايا في الأنسجة المسمى استردادها. لإنجاز هذا ، سيتم استرداد الخلايا الأولى من الكوسا العظام الفئران والمثقفين لمدة 8 أيام في وجود عامل بلعم - مستعمرة محببة تحفيز من أجل حمل العاصمة التمايز. وسوف تكون هذه الخلايا المسماة ثم مع Qdots الفلورسنت التي حضانة قصيرة في المختبر. ويمكن تصور الخلايا الملون مع المجهر الفلورسنت. ويمكن حقن الخلايا في حيوانات التجارب عند هذه النقطة أو يمكن أن تصبح خلايا ناضجة عليها في المختبر مع المثيرات حضانة للالتهابات. في أيدينا ، ولم يتم تحديد DC نضوج فقدان الإشارة الفلورسنت ولا تلطيخ Qdot تؤثر على الخصائص البيولوجية للبلدان النامية. عند الحقن ، ويمكن تحديد هذه الخلايا في أجهزة المناعة بواسطة المجهر الفلورسنت التالية تشريح نموذجي وإجراءات التثبيت.
Protocol
1. تشريح femurs الماوس وظنبوب والثقافة من خلايا نخاع العظام
- 2 التضحية الفئران خنقا 2 أكسيد الكربون وتشريح بعناية tibias وfemurs دون قطع نهايات العظام.
- تنظيف العظام من الأنسجة التي ربطت باستخدام المناديل الورقية. يجب الحرص على عدم كسر العظام.
- تعقيم العظام عن طريق الغمر في الإيثانول 70 ٪ لمدة 10 دقيقة في طبق بتري 35 مم. من هذه اللحظة ، والعمل داخل غطاء السلامة الأحيائية لتجنب التلوث من الثقافات الخلية.
- استعادة عظام من الايثانول والسماح لهم الهواء الجاف لمدة 5 دقائق في طبق بتري داخل مجلس الوزراء السلامة الأحيائية.
- قطع femurs إلى النصف ، والساق والتي طرفها أنحف. يبث في داخل العظم مع 1 مل من المتوسط RPMI (بدون المصل ولكن مع المضادات الحيوية) باستخدام محقنة معقمة على طبق بتري معقمة.
- يتم جمع نظام التعليق الخلية وغسلها 2X في المتوسط RPMI بواسطة الطرد المركزي 10 دقيقة في أنبوب الطرد المركزي 15 مل في 1100 دورة في الدقيقة في جهاز للطرد المركزي المبردة (4 درجات مئوية) مع الدوار الدلو المتأرجح.
- بعد غسل الماضي ، resuspend الخلايا في 2 مل من تحلل ACK العازلة واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة من أجل القضاء على خلايا الدم الحمراء.
- إضافة 13 مل من RPMI FBS مع 10 ٪ ، ويغسل resuspend 2X في هذه الوسيلة مع نفس الإعدادات كما هو موضح في 1.6.
- عدد الخلايا ، والتكيف مع 2 × 10 5 خلية / مل مع FBS 10 ٪ RPMI وإضافة RM - GM - CSF (20 نانوغرام / مل تركيز النهائي) 5.
- إضافة 10 مل من هذا التعليق على الجودة ، ومعقمة الميكروبيولوجية ، 10 طبق بيتري سم ، والثقافة في حاضنة CO 2 (37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2).
- بعد ثلاثة أيام ، إضافة آخر 10 مل من 10 ٪ FBS RPMI مع 20 نانوغرام / لتر من rmGM - CSF إلى كل من لوحات معدة.
- يتم استردادها بعد ثلاثة أيام من 10 مل تعليق خلية من كل طبق بيتري ، كما هو الحال في طرد 1.6 ، معلق في نفس الحجم من FBS 10 ٪ RPMI مع rmGM - CSF ، وعاد إلى صحن بتري. يتم استزراع خلايا ل 2 أيام إضافية في الحاضنة 2 CO.
2. جمع وتصنيف البلدان النامية
- بعد 8 أيام في الثقافة وتسترد الخلايا الملتصقة فضفاضة بغسل الصحون مع بيتري المتوسطة الطازجة. يجعل هذا البروتوكول في جميع أنحاء البلدان النامية 8 X10 2-4 في أيدينا. ويمكن تحليل الخلايا عن النمط الظاهري العاصمة التي التدفق الخلوي.
- ثم وصفت الخلايا التي تم جمعها مع Qtracker 655 خلية وصفها بدقة كيت باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
- حصلنا على نتائج ممتازة وسم الفئران نخاع العظام المستمدة من البلدان النامية مع التركيز على Qdots 10 نانومتر. لتحقيق هذا الهدف ، aliquots مكونات الخلية Qtracker كيت وصفها مختلطة ألف وباء في أحجام متساوية ، حضنت لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، والمخففة على الفور 1 / 100 في المتوسط جديدة مع لمدة 30 ثانية. vortexing
- وصمة عار على 5 × 10 6 البلدان النامية ، ومزيج من كل 5 ميكرولتر مكونات عدة ألف وباء في أنبوب إيبندورف واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم ، إضافة 1 مل من احتضان RPMI FBS 10 ٪ ، ودوامة لمدة 30 ثانية.
- إضافة 0.5 مل من تعليق خلية تحتوي على 5 6 X10 البلدان النامية ، واحتضان في 37 دقيقة لمدة 60 درجة مئوية.
- ثم ، وغسل الخلايا في FBS 2X RPMI 10 ٪ (1100 دورة في الدقيقة). يمكن معلق الخلايا في RPMI للثقافة أخرى أو في برنامج تلفزيوني للحقن في فئران التجارب.
3. تقييم المسمى DC
- ويمكن تقييم وضع العلامات الخلية عن طريق المجهر الفلورسنت. لتحقيق ذلك ، إضافة قطرة من تعليق الخلية إلى شريحة المجهر ، وتغطي مع ساترة الزجاج ، وتقييمها مع المجهر الفلورسنت مع الأخذ بعين الاعتبار أن هذه الانبعاثات قد Qdots والإثارة أطياف 565nm 525nm و 405 على التوالي (الشكل 3 )
- عند هذه النقطة ، يمكن استخدام الخلايا المسمى لحقن الحيوانات ، أو يمكن أن يتسبب النضج التي تفرخ هذه الخلايا لمدة 48 ساعة (37 درجة مئوية ، 5 CO 2) في حضور LPS (100 نانوغرام / مل) ، وTNF (- 20 نانوغرام / مل). لا يتأثر وضع العلامات الفلورسنت التي نضوج العاصمة (الشكل 4).
4. ممثل النتائج :
وصف طيه أننا كيفية تحضير الفئران نخاع العظام المستمدة من البلدان النامية ، وكيف لهم المسمى Qdots الفلورسنت. الشكل. 1 موجزا للإجراءات الحصول على الخلايا ، في حين شكل. 2 يصور الداخلي لتسمية لهم Qdots. كما هو مبين في الشكل. 3 ، وصفت تقريبا كافة الخلايا بواسطة هذا الإجراء ، ولا يتأثر هذا النضج بواسطة DC مع العوامل الالتهابية (الشكل 4). الشكل. 5 يدل على أن Qdot الملطخة البلدان النامية (Fig.5a) تتصرف مشابهة لخلايا غير ملطخة عندما تعامل مع كوكتيل التهابات. كلا الاستعدادات الخلية upregulate بالمثل التعبير عن جزيئات costimulatory (الشكل 5B) ، وإنتاج كميات مماثلة من IL - 6 (الشكل 5C) واكسيد النيتريك (الشكل 5D) عند نضوج المنبهات. هذا يتفق مع previالأوس البيانات المنشورة تشير إلى أن تلطيخ Qdot لا يؤثر على القدرة على العاصمة لتتحول الى خلايا ناضجة قادرة على انتزاع استجابات مناعية [6]. ويمكن عندئذ أن تستخدم هذه الخلايا لحقن حيوانات التجارب. كما هو مبين في الشكل. 6 ، 2 بعد أيام من الحقن في الوريد من البلدان النامية في الفئران المسمى ، كنا قادرين على كشف Qdot الملطخة الخلايا في الطحال. وهذا هو أيضا في اتفاق مع البيانات المنشورة السابقة تبين استخدام البلورات النانوية Qdot لتقييم هجرة العاصمة في الجسم الحي [6] من غير الغازية التصوير والتدفق الخلوي.
مخطط تدفق الرقم 1. توليد العاصمة من نخاع العظام. طيه أننا تصوير عملية الحصول على نخاع العظام المستمدة من العاصمة. يتم تشريح كلا tibias وfemurs ونظيفة من الأنسجة المحيطة. هي الحفاظ على العظام ونصائح ومسح المناطق الداخلية من العظام مع المتوسط. بعد القضاء على خلايا الدم الحمراء ، ويتم استزراع خلايا نخاع العظم لمدة 8 أيام في حضور GM - CSF لتمييزها في البلدان النامية.
مخطط تدفق الرقم 2. الإجراء التوسيم. aliquots متساوية من مكونات الخلية Qtracker كيت وصفها مختلطة ألف وباء في أنبوب إيبندورف. يتم جمع الخلايا الجذعية من 8 ايام الثقافات نخاع العظم مع جنرال موتورز - CSF ومختلطة مع الصبغة لوضع العلامات على 37C 60 دقيقة. ثم يتم غسل الخلايا في وسائل الاعلام للقضاء على جزيئات العلامات الزائدة.
الشكل 3. microphotography نيون من البلدان النامية على الفور بعد وضع العلامات. أودع قطرة من الخلايا المسمى على شريحة زجاجية وتغطيها ساترة. ثم ، تم تقييم العينات في مضان المجهر والصور تم الحصول عليها من خلال كاميرا رقمية 5.0 Micropublisher اللون اتفاقية مكافحة التصحر (Qimaging ، ساري ، قبل الميلاد كندا).
الشكل 4. microphotography نيون من البلدان النامية بعد نضوج 48 ساعة في المختبر. وكانت البلدان النامية مثقف المسمى لمدة 48 ساعة مع LPS (100 نانوغرام / مل) ، وTNF - α (20 نانوغرام / مل) على شرائح من الزجاج على حاضنة CO 2 (37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2). ثم ، تم غسلها مع عينات PBS (5 دقائق ، 2X) ، ثابت مع الأسيتون (15 دقيقة و 4 درجات مئوية) وcounterstained مع دابي. وجرى تقييم الخلايا في المجهر الفلورسنت على النحو الوارد أعلاه.
الشكل 5. النشاط البيولوجي للبلدان النامية Qdot ناضجة الملون. وقد تم تحليل البلدان النامية المسمى نضجت في المختبر على النحو الوارد أعلاه عن طريق التدفق الخلوي (A) و (B) (A) Qdot الملطخة خلايا تعطي إشارة قوية في القناة (PercP) FL3. مظللة الرسم البياني : مراقبة غير ملوثين. (ب) كانت ملطخة بالإضافة إلى البلدان النامية Qdot الملطخة وغير ملوثين أجسام مضادة محددة ضد علامات النضج وCD86 CD40 ، والضوابط isotype. ثم تم تحليل الخلايا في عداد الكريات تدفق FACSort (بيكتون ديكنسون ، سان خوسيه ، كاليفورنيا). بالإضافة إلى ذلك ، تم تحديد IL - 6 (C) واكسيد النيتريك (NO) في البلدان النامية من supernatants Qdot الملطخة ناضجة والضوابط. وتم تحديد مستويات IL - 6 وأكسيد النيتريك من خلال تحليل وفحص ELISA Griess كما وصفناها سابقا 7 و 8. جميع البيانات أظهرت في هذا الرقم هو ممثل اثنين أو ثلاث تجارب مستقلة تظهر نتائج مماثلة. وتم تحليل البيانات بواسطة ANOVA باستخدام برنامج GraphPad.
الشكل 6. الكشف عن البلدان النامية المسمى في أنسجة تشريح. تم حقن في الوريد البلدان النامية ناضجة المسمى (1x10 6 خلايا) في الفئران C57BL / 6. (A) وبعد ذلك بيومين تم التضحية الفئران والتي تم جمعها الطحال ، المجمدة المفاجئة ، جزءا لا يتجزأ من أكتوبر ، و 8 أقسام ميكرومتر أعدت باستخدام ناظم البرد. ثم ، كانت ثابتة العينات مع الأسيتون (15 دقيقة و 4 درجات مئوية) وcounterstained مع دابي. وجرى تقييم الخلايا في المجهر الفلورسنت على النحو الوارد أعلاه الشكل 6A : التكبير 40X ، الشكل 6B : التكبير 100X ، الشكل. 6C ، التكبير 400X.
Discussion
وقد الفئران النخاعي) البلدان النامية تستخدم على نطاق واسع من أجل تحديد فعالية وتحسين العاصمة مقرا لقاحات ، والتحقيق العاصمة : تفاعلات الخلايا التائية أو تطوير العاصمة ، وتحديد دورها في الأمراض المختلفة 9-11. طيه نظهر كيفية توليد البلدان النامية من السلائف تعافى من الكوسا وعظم tibias femurs. نستعيد العظام دون قطع النصائح ، مما يسمح لنا لتعقيم لهم من قبل الانغمار في الايثانول 70 ٪ ، وبالتالي تقليل احتمال تعرضها للتلوث. للتمييز بين البلدان النامية من خلايا نخاع العظام التي نستخدمها فقط GM - CSF إلى 5 الموصوفة سابقا. على الرغم من بعض البروتوكولات أيضا استخدام IL - 4 ، وأفيد أن هذه خلوى ليس من الضروري عند التعامل مع مستويات عالية من GM - CSF 12. في الواقع ، لقد أثبتنا سابقا أن هذه البلدان النامية قادرة على حمل 13 الاستجابات المناعية. أيضا ، والرعاية التي يجب اتخاذها لاستعادة خلايا ملتصقة فقط فضفاضة من 8 ايام الثقافات من خلال غسل أطباق بتري مع المتوسط منذ خلايا النمط الظاهري المرفقة تظهر أكثر مثل الوحيدات. هنا نعرض وسم البلدان النامية مع جزيئات Qdot الفلورسنت. هذه العلامات لديها بعض المزايا لاحترام أساليب أخرى. أولا ، تدمج بسهولة Qdots الجزيئات في الخلايا. الثاني ، إشارة الفلورسنت عالية جدا وليس تعديلها من قبل نضوج العاصمة. الثالث ، هو عدم فقدان مضان عندما يتم إصلاح الخلايا أو الأنسجة مع المذيبات مثل الأسيتون ، على عكس ما يحدث إذا تم استخدام البطاقات في البلدان النامية GFP 14 ، وإعطاء المزيد من المرونة في اختيار الوقت المناسب لتلوين البروتوكولات. أخيرا ، إشارة عالية الفلورسنت التي قدمتها هذه الجزيئات التصور يسمح للخلايا الأنسجة على الرغم من السيارات ومضان. 6 كما هو موضح سابقا ، لم Qdot تلطيخ لا يؤثر على القدرة نضوج هذه الخلايا. طيه نظهر أن Qdot الملطخة البلدان النامية تتصرف بطريقة مشابهة للبلدان النامية غير الملون ، upregulating costimulatory الجزيئات ، وإنتاج IL - 6 وأكسيد النتريك في الاستجابة للمحفزات للالتهابات. على الرغم من أن البلدان النامية هي خلايا متخصصة في إحداث استجابة مناعية ، وقد تبين لهم بالمشاركة في الحالات المرضية مثل السرطان وتصلب الشرايين 4 ، 15 ، 16. وقد زعموا أيضا المشاركة في عملية عائية 17 ، 18 ، كما اقترح حتى المشاركة هيكليا في البلدان النامية من السفن الجديدة 19 و 20. وهكذا ، والطرق التي تسمح العاصمة تتبع في الجسم الحي ، وتحديد موقعها الجغرافي التوطين في الأنسجة المختلفة 4 ، 21 ، 22 هي قيمة للغاية.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
يؤيد هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة في إطار المنحة CA137499 R15 - 01 (اف ب) وصندوق بدء التشغيل من جامعة ولاية أوهايو (اف ب).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratory | Females, 6-8 weeks old | |
| RPMI | Invitrogen | 11875-119 | |
| Fetal bovine serum, qualified | Invitrogen | 10437-028 | |
| Antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15240-096 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-049 | |
| ACK Lysing Buffer | Lonza Inc. | 10-548E | |
| Recombinant murine GM-CSF | PeproTech Inc | 315-03 | |
| Qtracker 655 Cell Labeling Kit | Invitrogen | Q25021MP | |
| Lipopolysaccharide | Invitrogen | tlrl-eblps | |
| Recombinant murine TNF alpha | PeproTech Inc | 315-01A | |
| CD86 antibody | BD Biosciences | 553691 | |
| CD40 antibody | BD Biosciences | 553791 | |
| Griess reagent system | Promega Corp. | G2930 | |
| IL-6 capture antibody | eBioscience | 13-7061-81 | |
| IL-6 detection antibody | eBioscience | 13-7062-81 |
References
- Banchereau, J., Briere, F., Caux, C., Davoust, J., Lebecque, S., Liu, Y. J., Pulendran, B., Palucka, K. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).
- Bonasio, R., von Andrian, U. H. Generation, migration and function of circulating dendritic cells. Curr Opin Immunol. 18, 503-511 (2006).
- Lanzavecchia, A., Sallusto, F. The instructive role of dendritic cells on T cell responses: lineages, plasticity and kinetics. Curr Opin Immunol. 13, 291-298 (2001).
- Conejo-Garcia, J. R., Benencia, F., Courreges, M. C., Kang, E., Mohamed-Hadley, A., Buckanovich, R. J., Holtz, D. O., Jenkins, A., Na, H., Zhang, L. Tumor-infiltrating dendritic cell precursors recruited by a beta-defensin contribute to vasculogenesis under the influence of Vegf-A. Nat Med. 10, 950-958 (2004).
- Lutz, M. B., Kukutsch, N., Ogilvie, A. L., Rossner, S., Koch, F., Romani, N., Schuler, G. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223, 77-92 (1999).
- Noh, Y. W., Lim, Y. T., Chung, B. H. Noninvasive imaging of dendritic cell migration into lymph nodes using near-infrared fluorescent semiconductor nanocrystals. Faseb J. 22, 3908-3918 (2008).
- Benencia, F., Courreges, M. C., Conejo-Garcia, J. R., Mohamed-Hadley, A., Zhang, L., Buckanovich, R. J., Carroll, R., Fraser, N., Coukos, G., Franco, L. G. HSV oncolytic therapy upregulates interferon-inducible chemokines and recruits immune effector cells in ovarian cancer. Mol Ther. 12, 789-802 (2005).
- Gilboa, E., Vieweg, J. Cancer immunotherapy with mRNA-transfected dendritic cells. Immunol Rev. 199, 251-263 (2004).
- Grolleau-Julius, A., Abernathy, L., Harning, E., Yung, R. L. Mechanisms of murine dendritic cell antitumor dysfunction in aging. Cancer Immunol Immunother. 58, 1935-1939 (2009).
- Yrlid, U., Svensson, M., Johansson, C., Wick, M. J. Salmonella infection of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells: influence on antigen presentation and initiating an immune response. FEMS Immunol Med Microbiol. 27, 313-320 (2000).
- Lutz, M. B., Schnare, M., Menges, M., Rossner, S., Rollinghoff, M., Schuler, G., Gessner, A. Differential functions of IL-4 receptor types I and II for dendritic cell maturation and IL-12 production and their dependency on GM-CSF. J Immunol. 169, 3574-3580 (2002).
- Benencia, F., Courreges, M. C., Coukos, G. Whole tumor antigen vaccination using dendritic cells: comparison of RNA electroporation and pulsing with UV-irradiated tumor cells. J Transl Med. 6, 21-21 (2008).
- Probst, H. C., Tschannen, K., Odermatt, B., Schwendener, R., Zinkernagel, R. M., Van Den Broek, M. Histological analysis of CD11c-DTR/GFP mice after in vivo depletion of dendritic cells. Clin Exp Immunol. 141, 398-404 (2005).
- Fainaru, O., Adini, A., Benny, O., Adini, I., Short, S., Bazinet, L., Nakai, K., Pravda, E., Hornstein, M. D., D'Amato, R. J., Folkman, J. Dendritic cells support angiogenesis and promote lesion growth in a murine model of endometriosis. Faseb J. 22, 522-529 (2008).
- Bobryshev, Y. V., Lord, R. S., Rainer, S., Jamal, O. S., Munro, V. F. Vascular dendritic cells and atherosclerosis. Pathol Res Pract. 192, 462-467 (1996).
- Nakai, K., Fainaru, O., Bazinet, L., Pakneshan, P., Benny, O., Pravda, E., Folkman, J., D'Amato, R. J. Dendritic cells augment choroidal neovascularization. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 3666-3670 (2008).
- Huarte, E., Cubillos-Ruiz, J. R., Nesbeth, Y. C., Scarlett, U. K., Martinez, D. G., Buckanovich, R. J., Benencia, F., Stan, R. V., Keler, T., Sarobe, P. Depletion of dendritic cells delays ovarian cancer progression by boosting antitumor immunity. Cancer Res. 68, 7684-7691 (2008).
- Fernandez Pujol, B., Lucibello, F. C., Zuzarte, M., Lutjens, P., Muller, R., Havemann, K. Dendritic cells derived from peripheral monocytes express endothelial markers and in the presence of angiogenic growth factors differentiate into endothelial-like cells. Eur J Cell Biol. 80, 99-110 (2001).
- Gottfried, E., Kreutz, M., Haffner, S., Holler, E., Iacobelli, M., Andreesen, R., Eissner, G. Differentiation of human tumour-associated dendritic cells into endothelial-like cells: an alternative pathway of tumour angiogenesis. Scand J Immunol. 65, 329-335 (2007).
- Bobryshev, Y. V., Lord, R. S. Mapping of vascular dendritic cells in atherosclerotic arteries suggests their involvement in local immune-inflammatory reactions. Cardiovasc Res. 37, 799-810 (1998).
- Bobryshev, Y. V., Lord, R. S. Co-accumulation of dendritic cells and natural killer T cells within rupture-prone regions in human atherosclerotic plaques. J Histochem Cytochem. 53, 781-785 (2005).
