Summary
Дендритные поглощение клетками антигены и мигрировать в органах иммунной системы в настоящее время обрабатываются антигенов Т-клеток. Qdot нанокристаллов маркировка обеспечивает длительную и стабильную флуоресцентный сигнал. Это позволяет отслеживать дендритных клеток в различных органах методом флуоресцентной микроскопии.
Abstract
Дендритные клетки (ДК) являются профессиональными антиген представляющих клеток (БТР) обнаружили в периферических тканях и в иммунологических органов, таких как вилочковая железа, костный мозг, селезенку, лимфатические узлы и патчи Пейера 1-3. РС присутствуют в периферических тканях образец организма на наличие антигенов, которые они занимают, обработки и представления в их поверхности в контексте крупных молекул гистосовместимости (MHC). Затем антиген-загружалась домена перейти на иммунологические органах, где они представляют обработанные антигена Т-лимфоцитов запуска специфических иммунных реакций. Один из способов оценки миграционных возможностей контроллеров домена является маркировать их с флуоресцентными красителями 4.
При этом мы демонстрируем использование Qdot флуоресцентных нанокристаллов для обозначения мышиный мозг происхождения кости, округ Колумбия. Преимущество этой маркировки является то, что Qdot нанокристаллов обладают стабильной и долговечной флуоресценции, что делает их идеальными для обнаружения меченых клеток в восстановленных тканей. Чтобы достичь этого, первые клетки будут восстановлены из мышиных кабачки кости и культивировали в течение 8 дней в присутствии макрофагов гранулоцитов-колониестимулирующий фактор для того, чтобы побудить DC дифференциации. Эти клетки затем будут помечены флуоресцентным Qdots короткой инкубации в пробирке. Витражи клетки могут быть визуализированы с флуоресцентной микроскопии. Клетки могут быть введены в экспериментальных животных в этот момент или может быть в зрелые клетки в пробирке после инкубации с воспалительными стимулами. В наших руках, округ Колумбия созревания не определяли потерю флуоресцентный сигнал и не Qdot окрашивание влияют на биологические свойства домена. После инъекции этих клеток могут быть идентифицированы в органах иммунной системы методом флуоресцентной микроскопии следующие типичные рассечения и фиксации процедур.
Protocol
1. Препарирование мышей бедра и голени и культуры клеток костного мозга
- Жертва 2 мыши СО 2 удушья и тщательно анализировать большеберцовые кости и бедра, не сокращая кости концами.
- Чистая кости из всех подключенных тканей с помощью папиросной бумаги. Будьте осторожны, чтобы не сломать кости.
- Стерилизовать кости путем погружения в 70% этаноле в течение 10 мин в 35 мм чашки Петри. С этого момента работа внутри капота биобезопасности, чтобы избежать загрязнения клеточных культур.
- Восстановление кости из этанола и позволить им высохнуть на воздухе в течение 5 минут в чашке Петри внутри шкафа биобезопасности.
- Вырезать бедра в два раза, и голени его тонкий кончик. Настаивать внутри кости с 1 мл среды RPMI (без сыворотки, но с антибиотиками) с помощью стерильного шприца на стерильную чашку Петри.
- Клеточной суспензии собираются и промывают 2 раза в среде RPMI на 10 мин центрифугирования в центрифуге 15 трубки мл при 1100 оборотов в охлажденном центрифуги (4 ° С), размахивая ведром ротора.
- После последней стирки, ресуспендирования клеток в 2 мл буфера для лизиса ACK, инкубировать 5 минут при комнатной температуре в целях устранения красных кровяных телец.
- Добавить 13 мл RPMI с 10% FBS, ресуспендирования и мыть 2 раза в этой среде с теми же настройками, как описано в 1.6.
- Граф клеток, приспособиться к 2 х 10 5 клеток / мл RPMI 10% FBS, а также добавить RM-GM-CSF (20 нг / мл, конечная концентрация) 5.
- Добавьте 10 мл этой суспензии в стерильной, микробиологического качества, 10 см, чашка Петри, и культуры в CO 2 инкубаторе (37 ° C, 5% СО 2).
- Три дня спустя, добавьте еще 10 мл RPMI 10% FBS с 20 нг / л rmGM-КСФ на каждом из подготовленных пластин.
- Через три дня 10 мл клеточной суспензии взыскиваются с каждой чашке Петри, центрифугируют, как в 1.6, ресуспендировали в том же объеме RPMI 10% FBS с rmGM-CSF и вернулся в чашке Петри. Клетки культивировали в течение 2 дополнительных дней в CO 2 инкубаторе.
2. Сбор и маркировка РС
- Через 8 дней в культуре слабо прилипшие клетки восстанавливаются промывкой чашки Петри со свежей средой. Этот протокол предоставляет около 2-4 x10 8 контроллеров домена в наших руках. Клетки могут быть проанализированы на фенотип DC с помощью проточной цитометрии.
- Сборник Затем клетки помечены Qtracker 655 Сотовые Маркировка Kit строго следуя инструкциям производителя.
- Мы получили отличные результаты маркировки мышиный мозг происхождения кости контроллеры домена с Qdots на 10 нМ концентрации. Чтобы достичь этого, аликвоты Qtracker клеточных компонентов Маркировка Kit и Б смешивают в равных объемах, инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре, и сразу же разбавленного 1 / 100 в свежую среду с вортексе в течение 30 сек
- Чтобы пятна 5 х 10 6 DC, смешайте 5 мкл каждого комплекта компонентов А и В в пробирку Эппендорфа и инкубировать 5 минут при комнатной температуре. Затем добавьте 1 мл RPMI инкубировать 10% FBS, и вихрь в течение 30 секунды.
- Добавить 0,5 мл клеточной суспензии, содержащей 5 x10 6 контроллеров домена, и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 60 мин.
- Затем вымыть клетки 2X в RPMI 10% FBS (1100 RPM). Клетки могут быть ресуспендировали в RPMI для дальнейшего культуры или в ФБР для инъекций в экспериментальных мышей.
3. Оценка меченых DC
- Сотовые маркировки может быть оценена с помощью флуоресцентной микроскопии. Для этого каплю суспензии клеток добавляется в стекло микроскопа, покрытое стекло покровное, и оценивается с флуоресцентным микроскопом, принимая во внимание, что эти Qdots имеют излучения и спектров возбуждения 565nm и 405-525nm соответственно (рис. 3 )
- На данный момент, меченые клетки могут быть использованы для введения животным или созревания могут быть вызваны путем инкубации этих клеток в течение 48 ч (37 ° C, 5 CO 2) в присутствии ЛПС (100 нг / мл) и ФНО-( 20 нг / мл). Флуоресцентная маркировка не зависит от постоянного созревания (рис. 4).
4. Представитель Результаты:
При этом мы рассказали, как подготовить мышиный мозг происхождения кости контроллеры домена и как обозначил их с люминесцентными Qdots. Рис. 1 приведены процедура получения клетки, а на рис. 2 представлена процедура оформления с Qdots. Как показано на рис. 3, почти все клетки помечены этой процедуры, и это не зависит от постоянного созревания при воспалительных факторов (рис. 4). Рис. 5 показывает, что Qdot окрашенных РС (Fig.5a) ведут себя подобно не-окрашенных клеток при лечении воспалительных коктейль. Оба клеточных препаратов аналогичным upregulate выражение костимуляторных молекул (рис. 5, б), а также производить одинаковое количество IL-6 (рис. 5) и оксида азота (рис. 5, г) при созревании раздражители. Это согласуется с previПодразделения опубликованы данные о том, что окрашивание Qdot не влияет на возможность постоянного превращаться в зрелые клетки способны вызвать иммунный ответ [6]. Эти клетки затем можно использовать для введения экспериментальным животным. Как показано на рис. 6, 2-х дней после внутривенного введения меченого контроллеры домена в мышей, мы были в состоянии обнаружить Qdot-окрашенных клеток в селезенке. Это также согласуется с ранее опубликованные данные, показывающие использование Qdot нанокристаллов для оценки миграции постоянного тока в естественных условиях [6] неинвазивной визуализации и проточной цитометрии.
Рисунок 1. Блок-схема DC поколения из костного мозга. При этом мы изобразить процесс получения костномозгового происхождения постоянного тока. Оба большеберцовые кости и бедра расчленены и очистить от окружающих тканей. Кость советы сохранились и интерьер кости сбрасываются со средой. После устранения красных кровяных клеток, клеток костного мозга выращивают в течение 8 дней в присутствии GM-CSF, чтобы отличить их на РС.
Рисунок 2. Блок-схема процедуры маркировки. Равные аликвоты Qtracker клеточных компонентов Маркировка Kit и B должны быть смешаны в трубке Эппендорф. Дендритные клетки собираются с 8-дневным костного мозга культур с ГМ-КСФ и смешивается с маркировки красителя в течение 60 минут при температуре 37С. Затем клетки промывают в средствах массовой информации по ликвидации избыточных частиц маркировки.
Рисунок 3. Флуоресцентные микрофотографии ДК сразу после маркировки. Капля меченых клеток наносили на предметное стекло и покрывается покровным. Затем образцы были оценены в флуоресцентный микроскоп и изображения были приобретены в результате Micropublisher 5,0 Цифровой CCD цветная камера (Qimaging, графство Суррей, Британская Колумбия, Канада).
Рисунок 4. Флуоресцентные микрофотографии ДК после 48 ч созревания в лабораторных условиях. Маркированный домена культивировали в течение 48 ч с LPS (100 нг / мл) и ФНО-α (20 нг / мл) на стеклах на СО 2 инкубатора (37 ° C, 5% СО 2). Затем образцы промывают PBS (5 мин, 2X), фиксированный с ацетоном (15 мин, 4 ° С) и контрастно с DAPI. Клетки были оценены в флуоресцентный микроскоп как указано выше.
Рисунок 5. Биологическая активность Qdot окрашенных зрелых ДК. Маркированный домена созрел в пробирке, как выше, были проанализированы с помощью проточной цитометрии (А) и (Б). (А) Qdot-окрашенных клеток дают сильный сигнал в FL3 (PercP) канала. Затененные гистограммы: неокрашенных контроля. (B) Qdot окрашенных и неокрашенных домена были дополнительно окрашивали специфических антител против созревание маркеров CD86 и CD40, а изотипа управления. Клетки затем анализируются в цитометр FACSort потока (Becton Dickinson, San Jose, CA). Кроме того, ИЛ-6 (С) и оксида азота (NO) были определены в супернатантах зрелых Qdot окрашенных ДК и контроля. Уровни ИЛ-6 и оксида азота определяли с помощью ELISA анализа и анализа Грисса как мы уже ранее описанных 7, 8. Все данные показали, на этом рисунке является представителем двух или трех независимых экспериментов показывает аналогичные результаты. Данные были проанализированы с помощью дисперсионного анализа GraphPad программного обеспечения.
Рисунок 6. Обнаружение меченых контроллеры расчлененный тканей. Маркированный зрелых РС (1x10 6 клеток) были внутривенно вводят в C57BL / 6 мышей. (А) Через два дня мышей умерщвляли и селезенки собраны, оснастки заморожены, встроенные в октябре, и 8 мкМ разделы подготовлены с использованием криостата. Затем образцы были зафиксированы с помощью ацетона (15 мин, 4 ° С) и контрастно с DAPI. Клетки были оценены в флуоресцентный микроскоп, как и выше рис 6а. 40х увеличением, рис 6б: 100X увеличение, рис. 6С, 400X увеличении.
Discussion
Мышей миелоидной) РС широко используются в целях определения эффективности и улучшение округ Колумбия, вакцин; исследовать DC: Т-клеток взаимодействия или постоянного развития, и определить их роль в различных болезней 9-11. При этом мы показываем, как для создания домена из предшественников оправился от костного мозга от большеберцовые кости и бедра. Мы восстановления костей без разреза советы, позволяющие стерилизовать их погружение в этанол 70%, тем самым снижая вероятность заражения. Чтобы дифференцировать РС из клеток костного мозга мы используем только GM-CSF, как описано выше 5. Хотя некоторые протоколы также использовать Ил-4, было сообщено, что этого цитокина не является обязательным при работе с высоким уровнем ГМ-КСФ 12. В самом деле, мы уже показали, что эти контроллеры домена могут вызывать иммунный ответ 13. Кроме того, помощь должна быть предприняты для восстановления лишь слабо прилипшие клетки из 8-дневных культур промывкой чашки Петри со средним поскольку прилагается клетки показывают более моноцитов-подобный фенотип. Здесь мы показываем, маркировка РС с флуоресцентными частицами Qdot. Это маркировка имеет некоторые преимущества по отношению к другим методам. Во-первых, Qdots частиц вещества легко внедряются в клетки. Во-вторых, флуоресцентный сигнал очень высок и не меняется при созревании постоянного тока. В-третьих, флуоресценция не теряется, когда клетки или ткани крепятся с помощью растворителей, таких как ацетон, вопреки тому, что произойдет, если GFP используется для тега РС 14, что дает большую гибкость в момент выбора окрашивания протоколы. Наконец, высокий флуоресцентный сигнал, предоставляемых этими частицами позволяет выявлять клетки, несмотря на ткани авто-флуоресценции. Как описано выше 6, Qdot окрашивание не влияет созревание способность этих клеток. При этом мы показываем, что Qdot окрашенных РС ведут себя таким же образом, как не окрашенные DC, upregulating костимуляторных молекул, и производство IL-6 и оксида азота в ответ на воспалительные стимулы. Хотя контроллеры домена являются клетки, специализированные в запуске иммунного ответа, они были показаны на участие в патологических состояний, таких как рак и атеросклероз 4, 15, 16. Они также утверждали, участвовать в процессе ангиогенеза 17, 18, даже предположил, как структурно, участвующие в разработке новых судов 19, 20. Таким образом, методы, которые позволяют для постоянного слежения в естественных условиях, а также определение их географической локализации в различных тканях 4, 21, 22 являются очень ценными.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа выполнена при частичной поддержке гранта NIH под R15 CA137499-01 (FB) и запуска фонд из университета Огайо (FB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratory | Females, 6-8 weeks old | |
| RPMI | Invitrogen | 11875-119 | |
| Fetal bovine serum, qualified | Invitrogen | 10437-028 | |
| Antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15240-096 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-049 | |
| ACK Lysing Buffer | Lonza Inc. | 10-548E | |
| Recombinant murine GM-CSF | PeproTech Inc | 315-03 | |
| Qtracker 655 Cell Labeling Kit | Invitrogen | Q25021MP | |
| Lipopolysaccharide | Invitrogen | tlrl-eblps | |
| Recombinant murine TNF alpha | PeproTech Inc | 315-01A | |
| CD86 antibody | BD Biosciences | 553691 | |
| CD40 antibody | BD Biosciences | 553791 | |
| Griess reagent system | Promega Corp. | G2930 | |
| IL-6 capture antibody | eBioscience | 13-7061-81 | |
| IL-6 detection antibody | eBioscience | 13-7062-81 |
References
- Banchereau, J., Briere, F., Caux, C., Davoust, J., Lebecque, S., Liu, Y. J., Pulendran, B., Palucka, K. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).
- Bonasio, R., von Andrian, U. H. Generation, migration and function of circulating dendritic cells. Curr Opin Immunol. 18, 503-511 (2006).
- Lanzavecchia, A., Sallusto, F. The instructive role of dendritic cells on T cell responses: lineages, plasticity and kinetics. Curr Opin Immunol. 13, 291-298 (2001).
- Conejo-Garcia, J. R., Benencia, F., Courreges, M. C., Kang, E., Mohamed-Hadley, A., Buckanovich, R. J., Holtz, D. O., Jenkins, A., Na, H., Zhang, L. Tumor-infiltrating dendritic cell precursors recruited by a beta-defensin contribute to vasculogenesis under the influence of Vegf-A. Nat Med. 10, 950-958 (2004).
- Lutz, M. B., Kukutsch, N., Ogilvie, A. L., Rossner, S., Koch, F., Romani, N., Schuler, G. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223, 77-92 (1999).
- Noh, Y. W., Lim, Y. T., Chung, B. H. Noninvasive imaging of dendritic cell migration into lymph nodes using near-infrared fluorescent semiconductor nanocrystals. Faseb J. 22, 3908-3918 (2008).
- Benencia, F., Courreges, M. C., Conejo-Garcia, J. R., Mohamed-Hadley, A., Zhang, L., Buckanovich, R. J., Carroll, R., Fraser, N., Coukos, G., Franco, L. G. HSV oncolytic therapy upregulates interferon-inducible chemokines and recruits immune effector cells in ovarian cancer. Mol Ther. 12, 789-802 (2005).
- Gilboa, E., Vieweg, J. Cancer immunotherapy with mRNA-transfected dendritic cells. Immunol Rev. 199, 251-263 (2004).
- Grolleau-Julius, A., Abernathy, L., Harning, E., Yung, R. L. Mechanisms of murine dendritic cell antitumor dysfunction in aging. Cancer Immunol Immunother. 58, 1935-1939 (2009).
- Yrlid, U., Svensson, M., Johansson, C., Wick, M. J. Salmonella infection of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells: influence on antigen presentation and initiating an immune response. FEMS Immunol Med Microbiol. 27, 313-320 (2000).
- Lutz, M. B., Schnare, M., Menges, M., Rossner, S., Rollinghoff, M., Schuler, G., Gessner, A. Differential functions of IL-4 receptor types I and II for dendritic cell maturation and IL-12 production and their dependency on GM-CSF. J Immunol. 169, 3574-3580 (2002).
- Benencia, F., Courreges, M. C., Coukos, G. Whole tumor antigen vaccination using dendritic cells: comparison of RNA electroporation and pulsing with UV-irradiated tumor cells. J Transl Med. 6, 21-21 (2008).
- Probst, H. C., Tschannen, K., Odermatt, B., Schwendener, R., Zinkernagel, R. M., Van Den Broek, M. Histological analysis of CD11c-DTR/GFP mice after in vivo depletion of dendritic cells. Clin Exp Immunol. 141, 398-404 (2005).
- Fainaru, O., Adini, A., Benny, O., Adini, I., Short, S., Bazinet, L., Nakai, K., Pravda, E., Hornstein, M. D., D'Amato, R. J., Folkman, J. Dendritic cells support angiogenesis and promote lesion growth in a murine model of endometriosis. Faseb J. 22, 522-529 (2008).
- Bobryshev, Y. V., Lord, R. S., Rainer, S., Jamal, O. S., Munro, V. F. Vascular dendritic cells and atherosclerosis. Pathol Res Pract. 192, 462-467 (1996).
- Nakai, K., Fainaru, O., Bazinet, L., Pakneshan, P., Benny, O., Pravda, E., Folkman, J., D'Amato, R. J. Dendritic cells augment choroidal neovascularization. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 3666-3670 (2008).
- Huarte, E., Cubillos-Ruiz, J. R., Nesbeth, Y. C., Scarlett, U. K., Martinez, D. G., Buckanovich, R. J., Benencia, F., Stan, R. V., Keler, T., Sarobe, P. Depletion of dendritic cells delays ovarian cancer progression by boosting antitumor immunity. Cancer Res. 68, 7684-7691 (2008).
- Fernandez Pujol, B., Lucibello, F. C., Zuzarte, M., Lutjens, P., Muller, R., Havemann, K. Dendritic cells derived from peripheral monocytes express endothelial markers and in the presence of angiogenic growth factors differentiate into endothelial-like cells. Eur J Cell Biol. 80, 99-110 (2001).
- Gottfried, E., Kreutz, M., Haffner, S., Holler, E., Iacobelli, M., Andreesen, R., Eissner, G. Differentiation of human tumour-associated dendritic cells into endothelial-like cells: an alternative pathway of tumour angiogenesis. Scand J Immunol. 65, 329-335 (2007).
- Bobryshev, Y. V., Lord, R. S. Mapping of vascular dendritic cells in atherosclerotic arteries suggests their involvement in local immune-inflammatory reactions. Cardiovasc Res. 37, 799-810 (1998).
- Bobryshev, Y. V., Lord, R. S. Co-accumulation of dendritic cells and natural killer T cells within rupture-prone regions in human atherosclerotic plaques. J Histochem Cytochem. 53, 781-785 (2005).
