Summary
Dendritiska celler upptag antigener och vandrar mot immun organ för att presentera behandlas antigen till T celler. Qdot nanocrystal märkningen ger en långvarig och stabil fluorescerande signal. Detta möjliggör spårning av dendritiska celler till olika organ med fluorescerande mikroskopi.
Abstract
Dendritiska celler (DC) är professionella antigenpresenterande celler (APC) som finns i perifera vävnader och i immunologiska organ såsom tymus, benmärg, mjälte, lymfkörtlar och Peyers plack 1-3. DCs som finns i perifera vävnader prov organismen för förekomsten av antigener, som de tar upp, bearbeta och presentera i sin yta i samband med större histocompatibility molekyler (MHC). Sedan antigen-loaded DC migrera till immunologiska organ där de presenterar de bearbetade antigenet för T-lymfocyter som utlöser specifika immunsvar. Ett sätt att utvärdera flyttande förmåga DCS är att märka dem med fluorescerande färger 4.
Härmed har vi demonstrera användningen av Qdot fluorescerande nanokristaller att märka murina härledd från benmärg DC. Fördelen med denna märkning är att Qdot nanokristaller har stabila och långvariga fluorescens som gör dem idealiska för att upptäcka märkta celler i återhämtat vävnader. För att uppnå detta kommer först cellerna skall återkrävas från murina ben squash och odlade i 8 dagar i närvaro av granulocyt makrofag-kolonistimulerande faktor för att framkalla DC differentiering. Dessa celler ska sedan märkta med fluorescerande Qdots genom att korta in vitro inkubation. Färgade celler kan visualiseras med en fluorescerande mikroskopi. Celler kan injiceras i försöksdjuren vid denna punkt eller kan till mogna celler på in vitro inkubation med inflammatoriska stimuli. I våra händer gjorde DC mognad avgör inte förlust av fluorescerande signal heller Qdot färgning påverkar biologiska egenskaper av DCS. Efter injektionen, kan dessa celler identifieras i immun organ med fluorescerande mikroskop följande typiska dissektion och förfaranden fixering.
Protocol
1. Dissektion av mus lårben och tibiae och kultur av benmärgsceller
- Offra två möss med CO 2 kvävning och noggrant dissekera skenben och lårben utan att skära benet slutar.
- Rengör ben från alla anslutna vävnader med hjälp av silkespapper. Var noga med att inte bryta benen.
- Sterilisera benen genom nedsänkning i 70% etanol i 10 min i en 35 mm petriskål. Från detta ögonblick, arbeta inuti en biosäkerhet huva för att undvika kontaminering av cellkulturer.
- Återhämta benen från etanol och låt dem lufttorka i 5 minuter i en petriskål inuti biosäkerhet skåpet.
- Skär lårben på mitten och skenbenet av dess tunnaste spets. Ingjuta insidan av benet med 1 ml RPMI medium (utan serum men med antibiotika) med hjälp av en steril spruta på en steril petriskål.
- Cellsuspensionen samlas in och tvättas 2X i RPMI medium genom 10 min centrifugering i ett 15 ml centrifugrör vid 1100 rpm i en kyld centrifug (4 ° C) med en svängig hink rotor.
- Efter den sista tvättningen, resuspendera cellerna i 2 ml ACK lyseringsbuffert och inkubera i 5 minuter i rumstemperatur i syfte att eliminera röda blodkroppar.
- Tillsätt 13 ml RPMI med 10% FBS, resuspendera och tvätta 2X i detta medium med samma inställningar som beskrivs i 1.6.
- Räkna celler, justera till 2 x 10 5 celler / ml med RPMI 10% FBS och lägger RM-GM-CSF (20 ng / ml slutkoncentration) 5.
- Tillsätt 10 ml av denna suspension till en steril, mikrobiologisk kvalitet, 10 cm petriskål och kultur i en CO 2-inkubator (37 ° C, 5% CO 2).
- Tre dagar senare, lägga till ytterligare 10 ml RPMI 10% FBS med 20 ng / l rmgm-CSF till varje förberedda tallrikar.
- Tre dagar senare 10 ml cellsuspension återvinns från varje petriskål, centrifugeras som i 1,6, suspenderade i samma volym RPMI 10% FBS med rmgm-CSF och återvände till petriskål. Cellerna odlas för 2 extra dagar i CO 2 inkubator.
2. Insamling och märkning av DCS
- Efter 8 dagar i kultur löst vidhäftande celler återvinns genom att tvätta de petriskålar med färska medium. Detta protokoll gör runt 2-4 x10 8 DCs i våra händer. Celler kan analyseras för DC-fenotyp med flödescytometri.
- Insamlade cellerna då märkta med Qtracker 655 Cell Märkning Kit strikt efter tillverkarens anvisningar.
- Vi fick mycket bra resultat märkning murin härledd från benmärg utvecklingsländerna med Qdots på en 10 nm koncentration. För att uppnå detta, A och B alikvoter av märkning Qtracker Cell Kit komponenter blandas i lika stora volymer, inkuberas i 5 minuter i rumstemperatur, och omedelbart utspädd 1 / 100 i färskt medium med vortexa i 30 s.
- Att fläcken 5 x 10 6 DC, blanda 5 ìl av varje sats komponenter A och B i ett Eppendorf-rör och inkubera 5 min vid rumstemp. Lägg sedan till 1 ml RPMI 10% FBS inkubera och vortexa i 30 sekunder.
- Tillsätt 0,5 ml cellsuspension innehåller 5 x10 6 utvecklingsländerna, och inkubera vid 37 ° C i 60 min.
- Sedan tvätta cellerna 2X i RPMI 10% FBS (1100 RPM). Celler kan resuspenderas i RPMI för vidare kultur eller i PBS för injektion i experimentell möss.
3. Utvärdering av märkt DC
- Cell märkning kan utvärderas med hjälp av fluorescerande mikroskopi. För att åstadkomma detta är en minskning med cellsuspension läggs till ett objektglas, täckt med ett glas täckglas, och utvärderas med ett fluorescerande mikroskop med hänsyn till att dessa Qdots har utsläpp och excitation spektra av 565nm och 405-525nm respektive (Fig. 3 )
- Vid denna punkt kan de märkta cellerna ska användas för injektion djur eller mognad kan induceras genom inkubering dessa celler i 48 timmar (37 ° C, 5 CO 2) i närvaro av LPS (100 ng / ml) och TNF-( 20 ng / ml). Fluorescerande märkningen påverkas inte av DC-mognad (bild 4).
4. Representativa resultat:
Härmed har vi beskrivit hur man förbereder murina härledd från benmärg DC och hur märkt dem med fluorescerande Qdots. FIG. 1 sammanfattas förfarandet för att få celler, medan figur. 2 beskriver förfarandet för att märka dem med Qdots. Som visas i figur. 3, nästan alla celler är märkta på detta sätt, och detta påverkas inte av DC-mognad med inflammatoriska faktorer (bild 4). FIG. 5 visar att Qdot-färgade DCS (Fig.5a) beter sig snarlikt icke-färgade cellerna när de behandlas med en inflammatorisk cocktail. Både cell förberedelser upregulate liknande uttryck av co-stimulerande molekyler (bild 5b), och producerar liknande mängder av IL-6 (figur 5c) och kväveoxid (Fig. 5d) vid mognad stimuli. Detta överensstämmer med tidigareOU publicerade data indikerar att Qdot färgning påverkar inte förmågan att DC förvandlas till mogna celler kan framkalla immunsvar [6]. Dessa celler kan sedan användas för att injicera försöksdjur. Som visas i figur. 6, 2 dagar efter intravenös injektion av märkt DC på möss, kunde vi upptäcka Qdot färgade celler i mjälten. Detta är också överens med tidigare publicerade data som visar användningen av Qdot nanokristaller att utvärdera migration av DC in vivo [6] av icke-invasiv imaging och flödescytometri.
Figur 1. Flödesschema för DC generationen från benmärg. Härmed har vi skildra processen att få härledd från benmärg DC. Både skenben och lårben är dissekeras och rena från omgivande vävnad. Bone tips är bevarade och det inre av ben spolas med medium. Efter eliminering av röda blodkroppar, är benmärgsceller odlade under 8 dagar i närvaro av GM-CSF för att skilja dem i utvecklingsländer.
Figur 2. Flödesschema av märkningen förfarande. Lika alikvoter av märkning Qtracker Cell Kit komponenter A och B blandas i ett Eppendorf-rör. Dendritiska celler samlas in från 8-dagars kulturer benmärg med GM-CSF och blandas med märkning färgen i 60 minuter vid 37C. Då cellerna tvättas i media för att eliminera överskott märkning partiklar.
Figur 3. Lysrör microphotography av DCS omedelbart efter märkning. En droppe märkt celler deponeras på en glasplatta och täcks av ett täckglas. Därefter togs prover utvärderades i en fluorescensmikroskop och bilder har förvärvats genom en Micropublisher 5,0 digital CCD färgkamera (Qimaging, Surrey, BC Kanada).
Figur 4. Lysrör microphotography av DCS efter 48 timmar mognad in vitro. Märkta DCs odlades i 48 timmar med LPS (100 ng / ml) och TNF-α (20 ng / ml) på glas bilder på en CO 2-inkubator (37 ° C, 5% CO 2). Därefter togs prover tvättas med PBS (5 min, 2X), fast med aceton (15 min, 4 ° C) och counterstained med DAPI. Celler utvärderades i ett fluorescerande mikroskop som ovan.
Figur 5. Biologiska aktiviteten hos Qdot färgade mogna DC. Märkta DCs mognat in vitro som ovan analyserades med flödescytometri (A) och (B). (A) Qdot färgade celler ger en stark signal i FL3 (PercP) kanal. Skuggade histogram: ofärgade kontroll. (B) Qdot-färgade och ofärgade utvecklingsländerna har dessutom målat med specifika antikroppar mot mognad markörer CD86 och CD40, och kontroller isotyp. Celler har sedan analyserats i ett FACSort flödescytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA). Dessutom var IL-6 (C) och kväveoxid (NO) bestäms i supernatanterna mogna Qdot färgade utvecklingsländerna och kontroller. Nivåer av IL-6 och kväveoxid bestämdes med hjälp av ELISA-analys och Griess analys som vi tidigare har beskrivit 7, 8. Alla data visade i denna siffra är representativ för två eller tre oberoende försök visar liknande resultat. Data analyserades med ANOVA med hjälp av GraphPad programvara.
Figur 6. Detektion av märkta DCs i dissekeras vävnader. Märkta mogna DCS (1x10 6 celler) var intravenöst injiceras i C57BL / 6 möss. (A) Två dagar senare möss offrades och mjälte samlas in, snap frysta, inbäddade i oktober och 8 mikroM sektioner prepareras med en kryostat. Därefter togs prover fast med aceton (15 min, 4 ° C) och counterstained med DAPI. Celler utvärderades i ett fluorescerande mikroskop som ovan Fig. 6a:. 40X förstoring, Fig. 6b: 100x förstoring, bild. 6C, 400X förstoring.
Discussion
Murina myeloisk) Utvecklingsländerna har i stor utsträckning använts för att fastställa effekt och förbättring av DC-baserade vacciner, undersöka DC: T-cell interaktioner eller DC utveckling, och bestämma deras roll i olika sjukdomar 9-11. Härmed visar vi hur du skapar utvecklingsländerna från prekursorer återhämtat sig från ben squash av skenben och lårben. Vi återhämta benen utan att skära av tips, tillåter oss att sterilisera dem genom nedsänkning i etanol 70%, vilket minskar sannolikheten för förorening. För att skilja DCs från benmärgsceller använder vi bara GM-CSF som tidigare beskrivits 5. Även om vissa protokoll också använda IL-4, har det rapporterats att detta cytokin är inte nödvändigt när man arbetar med höga halter av GM-CSF 12. I själva verket har vi visat tidigare att dessa DCs kan inducera immunsvar 13. Dessutom har vård vidtas för att återkräva bara löst vidhäftande celler från 8-dagars kulturer genom att tvätta de petriskålar med medium sedan fäst celler visar en mer monocyte-liknande fenotyp. Här visar vi märkning av utvecklingsländerna med fluorescerande Qdot partiklar. Denna märkning har vissa fördelar gentemot andra metoder. Först är de Qdots partiklar lätt införlivas i cellerna. För det andra är fluorescerande signal mycket hög och ändras inte av DC-mognad. För det tredje är fluorescensen inte förlorade när cellerna eller vävnaderna fixeras med lösningsmedel som aceton, i motsats till vad som händer om GFP används för att märka utvecklingsländerna 14, vilket ger mer flexibilitet för tillfället att välja färgning protokoll. Slutligen ger den höga fluorescerande signal som ges av dessa partiklar visualisering av celler trots vävnaden auto-fluorescens. Som tidigare beskrivits 6, gjorde Qdot färgning påverkar inte mognaden kapaciteten av dessa celler. Härmed visar vi att Qdot-färgade DCs beter sig på ett liknande sätt som icke-färgade utvecklingsländerna, upregulating co-stimulerande molekyler och producera IL-6 och kväveoxid som svar på inflammatoriska stimuli. Även Utvecklingsländerna celler specialiserade på att utlösa immunsvar, de har visat att delta i sjukdomstillstånd som cancer och åderförkalkning 4, 15, 16. De har också hävdat att delta i angiogena process 17, 18, även föreslagits som strukturellt deltar i utvecklingen av nya fartyg 19, 20. Således metoder som möjliggör DC spåra in vivo, och bestämma deras geografiska lokalisering i olika vävnader 4, 21, 22 är mycket värdefulla.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöds delvis av NIH i Grant R15 CA137499-01 (FB) och en start fond vid Ohio University (FB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratory | Females, 6-8 weeks old | |
| RPMI | Invitrogen | 11875-119 | |
| Fetal bovine serum, qualified | Invitrogen | 10437-028 | |
| Antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15240-096 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-049 | |
| ACK Lysing Buffer | Lonza Inc. | 10-548E | |
| Recombinant murine GM-CSF | PeproTech Inc | 315-03 | |
| Qtracker 655 Cell Labeling Kit | Invitrogen | Q25021MP | |
| Lipopolysaccharide | Invitrogen | tlrl-eblps | |
| Recombinant murine TNF alpha | PeproTech Inc | 315-01A | |
| CD86 antibody | BD Biosciences | 553691 | |
| CD40 antibody | BD Biosciences | 553791 | |
| Griess reagent system | Promega Corp. | G2930 | |
| IL-6 capture antibody | eBioscience | 13-7061-81 | |
| IL-6 detection antibody | eBioscience | 13-7062-81 |
References
- Banchereau, J., Briere, F., Caux, C., Davoust, J., Lebecque, S., Liu, Y. J., Pulendran, B., Palucka, K. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).
- Bonasio, R., von Andrian, U. H. Generation, migration and function of circulating dendritic cells. Curr Opin Immunol. 18, 503-511 (2006).
- Lanzavecchia, A., Sallusto, F. The instructive role of dendritic cells on T cell responses: lineages, plasticity and kinetics. Curr Opin Immunol. 13, 291-298 (2001).
- Conejo-Garcia, J. R., Benencia, F., Courreges, M. C., Kang, E., Mohamed-Hadley, A., Buckanovich, R. J., Holtz, D. O., Jenkins, A., Na, H., Zhang, L. Tumor-infiltrating dendritic cell precursors recruited by a beta-defensin contribute to vasculogenesis under the influence of Vegf-A. Nat Med. 10, 950-958 (2004).
- Lutz, M. B., Kukutsch, N., Ogilvie, A. L., Rossner, S., Koch, F., Romani, N., Schuler, G. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223, 77-92 (1999).
- Noh, Y. W., Lim, Y. T., Chung, B. H. Noninvasive imaging of dendritic cell migration into lymph nodes using near-infrared fluorescent semiconductor nanocrystals. Faseb J. 22, 3908-3918 (2008).
- Benencia, F., Courreges, M. C., Conejo-Garcia, J. R., Mohamed-Hadley, A., Zhang, L., Buckanovich, R. J., Carroll, R., Fraser, N., Coukos, G., Franco, L. G. HSV oncolytic therapy upregulates interferon-inducible chemokines and recruits immune effector cells in ovarian cancer. Mol Ther. 12, 789-802 (2005).
- Gilboa, E., Vieweg, J. Cancer immunotherapy with mRNA-transfected dendritic cells. Immunol Rev. 199, 251-263 (2004).
- Grolleau-Julius, A., Abernathy, L., Harning, E., Yung, R. L. Mechanisms of murine dendritic cell antitumor dysfunction in aging. Cancer Immunol Immunother. 58, 1935-1939 (2009).
- Yrlid, U., Svensson, M., Johansson, C., Wick, M. J. Salmonella infection of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells: influence on antigen presentation and initiating an immune response. FEMS Immunol Med Microbiol. 27, 313-320 (2000).
- Lutz, M. B., Schnare, M., Menges, M., Rossner, S., Rollinghoff, M., Schuler, G., Gessner, A. Differential functions of IL-4 receptor types I and II for dendritic cell maturation and IL-12 production and their dependency on GM-CSF. J Immunol. 169, 3574-3580 (2002).
- Benencia, F., Courreges, M. C., Coukos, G. Whole tumor antigen vaccination using dendritic cells: comparison of RNA electroporation and pulsing with UV-irradiated tumor cells. J Transl Med. 6, 21-21 (2008).
- Probst, H. C., Tschannen, K., Odermatt, B., Schwendener, R., Zinkernagel, R. M., Van Den Broek, M. Histological analysis of CD11c-DTR/GFP mice after in vivo depletion of dendritic cells. Clin Exp Immunol. 141, 398-404 (2005).
- Fainaru, O., Adini, A., Benny, O., Adini, I., Short, S., Bazinet, L., Nakai, K., Pravda, E., Hornstein, M. D., D'Amato, R. J., Folkman, J. Dendritic cells support angiogenesis and promote lesion growth in a murine model of endometriosis. Faseb J. 22, 522-529 (2008).
- Bobryshev, Y. V., Lord, R. S., Rainer, S., Jamal, O. S., Munro, V. F. Vascular dendritic cells and atherosclerosis. Pathol Res Pract. 192, 462-467 (1996).
- Nakai, K., Fainaru, O., Bazinet, L., Pakneshan, P., Benny, O., Pravda, E., Folkman, J., D'Amato, R. J. Dendritic cells augment choroidal neovascularization. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 3666-3670 (2008).
- Huarte, E., Cubillos-Ruiz, J. R., Nesbeth, Y. C., Scarlett, U. K., Martinez, D. G., Buckanovich, R. J., Benencia, F., Stan, R. V., Keler, T., Sarobe, P. Depletion of dendritic cells delays ovarian cancer progression by boosting antitumor immunity. Cancer Res. 68, 7684-7691 (2008).
- Fernandez Pujol, B., Lucibello, F. C., Zuzarte, M., Lutjens, P., Muller, R., Havemann, K. Dendritic cells derived from peripheral monocytes express endothelial markers and in the presence of angiogenic growth factors differentiate into endothelial-like cells. Eur J Cell Biol. 80, 99-110 (2001).
- Gottfried, E., Kreutz, M., Haffner, S., Holler, E., Iacobelli, M., Andreesen, R., Eissner, G. Differentiation of human tumour-associated dendritic cells into endothelial-like cells: an alternative pathway of tumour angiogenesis. Scand J Immunol. 65, 329-335 (2007).
- Bobryshev, Y. V., Lord, R. S. Mapping of vascular dendritic cells in atherosclerotic arteries suggests their involvement in local immune-inflammatory reactions. Cardiovasc Res. 37, 799-810 (1998).
- Bobryshev, Y. V., Lord, R. S. Co-accumulation of dendritic cells and natural killer T cells within rupture-prone regions in human atherosclerotic plaques. J Histochem Cytochem. 53, 781-785 (2005).
