Summary
돌기 세포의 이해의 항원과 T 세포 항원 처리를 제시 면역 기관으로 마이 그 레이션. Qdot nanocrystal 라벨은 오랫동안 안정 형광 신호를 제공합니다. 이것은 형광 현미경에 의해 다른 기관에 돌기 세포 추적하실 수 있습니다.
Abstract
돌기 세포 (DCS)는 주변 조직과 같은 thymus, 골수, 비장, 림프절과 Peyer의 패치를 1-3으로 면역 장기에서 발견 항원 제시 세포 전문 (APCs)입니다. DC가가 주변 조직 샘플에 그들이 걸릴 프로세스 및 주요 histocompatibility 분자 (MHC)의 맥락에서 그들의 표면에있는 항원의 존재에 대한 유기체를 제시한다. 그런 다음, 항원 - 로드된 DC가들은 특정 면역 반응을 실행 T lymphocytes로 처리 항원을 제시 면역 장기로 마이 그 레이션. DC가의 철새 기능을 평가하는 한 가지 방법은 형광 염료 4 그들을 분류하는 것입니다.
즉결 우리는 murine 골수 파생 DC 레이블을 Qdot 형광 nanocrystals의 사용을 보여줍니다. 이 분류의 장점은 Qdot nanocrystals가 회복 조직에 표시된 세포를 검출에 이상적하게 안정적이고 오래 지속 형광을 가지고있다. 이것을 달성하기 위해, 최초의 세포는 DC의 차별을 유도하기 위해 murine 뼈 marrows에서 발견한 및 과립구 대식 세포 콜로니 자극 인자 -의 존재에 8 일 동안 교양 것입니다. 이러한 전지는 다음 체외 보육의 짧은하여 형광 Qdots이 표시됩니다. 스테인드 세포는 형광 현미경과 시각 수 있습니다. 세포는이 시점에서 실험 동물에 주입 수있다 또는 염증성 자극과 함께 체외 보육시 성숙한 세포로 수 있습니다. 우리 손에, DC의 성숙은 형광 신호의 손실을 결정 안이나 Qdot의 얼룩은 DC가의 생물 학적 특성에는 영향을 미치지 않습니다. 주입시 이들 세포는 전형적인 해부와 고정 절차를 다음과 형광 현미경에 의해 면역 장기에서 확인할 수 있습니다.
Protocol
1. 마우스 대퇴골 및 골수 세포의 tibiae과 문화의 해부
- CO 2 질식을 2 마우스를 희생하고 조심스럽게 뼈 끝을 절단하지 않고 tibias과 대퇴골을 해부하다.
- 조직 용지를 사용하여 모든 첨부된 조직에서 뼈를 청소합니다. 뼈를 부러하지 않도록주의하십시오.
- 35mm 페트리 접시에서 10 분 70 % 에탄올에 집중하여 뼈를 소독. 지금이 순간부터, 세포 문화의 오염을 피하기 위해 biosafety 후드 내부 작동합니다.
- 에탄올에서 뼈를 복구하고 biosafety 캐비닛 내부는 배양 접시에 5 분 위해 공기가 건조 보자.
- 그 껍질이 얇고 팁에 의해 절반으로 대퇴골과 경골을 잘라요. 멸균 페트리 접시에 멸균 주사기를 사용하여 RPMI 매체 1 ML (혈청없이하지만 항생제 포함)과 뼈 안쪽을 달이다.
- 세포 현탁액은 스윙 버킷 회전자와 냉장 원심 분리기에서 1,100 RPM (4 ° C)에서 15 ML의 원심 분리기 튜브에서 10 분 원심 분리하여 RPMI 매체에서 수집하고 배 세탁합니다.
- 마지막 세척 후, ACK 용해 버퍼 2 ML에있는 세포를 resuspend와 적혈구를 제거하기 위해 상온에서 5 분 알을 품다.
- 10% FBS와 RPMI 13 ML 추가 resuspend과 같은 1.6에서 설명한 동일한 설정이 매체 배 세척.
- 2 조정, 세포를 카운트 RPMI 10% FBS 및 RM - GM - CSF (20 NG / ML 최종 농도) 5를 추가로 X 10 5 세포 / ML.
- CO 2 배양기 (37 ° C, 5 % CO 2)의 살균, 미생물 품질, 10cm 페트리 접시, 문화이 정지 10 ML을 추가합니다.
- 사흘 후, 준비된 접시 각 rmGM - CSF 20 NG / L로 RPMI 10% FBS의 또 다른 10 ML를 추가합니다.
- 세포 현탁액 3 일 이후 10 ML은 각 페트리 접시에서 발견한 1.6에서와 같이 centrifuged, rmGM - CSF와 RPMI 10% FBS 같은 볼륨에서 resuspended하고 페트리 접시에 반환됩니다. 세포가 CO 2 배양기에서 2 일간 추가 양식입니다.
2. 수집 및 DC가의 라벨
- 문화 8 일 후에 느슨하게 자기편 세포는 새로운 매체와 배양 접시를 세척하여 복구할 수 있습니다. 이 프로토콜은 우리 손에 2-4 X10 8 DC가 주위를 렌더링. 세포 유동세포계측법로 직류에 대한 표현형 분석하실 수 있습니다.
- 수집된 세포는 다음 엄격히 제조 업체의 지침에 따라 Qtracker 655 셀 라벨링 키트와 함께 표시됩니다.
- 우리는 우수한 결과를 10 nm의 농도에서 Qdots 함께 murine 골수 파생 DC가를 라벨어요. 이것을 달성하기 위해, Qtracker 셀 라벨링 키트 구성 요소 aliquots는 A와 B는 동일한 볼륨에 혼합 상온에서 5 분 incubated하고, 즉시 30 S.에 대한 vortexing 신선한 중간의 1 / 100 희석 아르
- 5 X 10 6 DC가를 얼룩이, 각각의 키트 구성 요소 eppendorf 튜브와 온도는 실온에서 5 분 품어에서 A와 B의 5 μl를 섞는다. 그런 다음, 1 RPMI 10% FBS 부화의 ML, 30 초 와동를 추가합니다.
- 5 X10 6 DC가를 포함하는 세포 현탁액의 0.5 ML를 추가하고, 37 품어 ° C를 60 분.
- 그런 다음, RPMI 10% FBS (1100 RPM)에 배 세포를 씻으십시오. 세포 실험 생쥐에 주입에 대한 자세한 문화 또는 PBS의 RPMI에 resuspended 수 있습니다.
3. 분류 DC 평가
- 셀 라벨은 형광 현미경에 의해 평가할 수있다. 이것을 달성하기 위해, 세포 현탁액의 드롭은 (그림 3, 현미경 슬라이드에 추가 유리 coverslip으로 덮여 및 형광 현미경은 각각이 Qdots는 565nm와 405 - 525nm의 방출 및 여기 스펙트럼을 가지고 고려와 평가 )
- 이 시점에서, 라벨 세포는 동물을 주입하는 데 사용할 수있는, 또는 성숙은 48 H 이러한 세포를 잠복기에 의해 유도된 수 있습니다 (37 ° C, 5 CO 2) LPS (100 NG / ML)와 TNF - (존재 20 NG / ML). 형광 라벨은 DC의 성숙 (그림 4)에 의해 영향을받지 않습니다.
4. 대표 결과 :
즉결 우리는 murine 골수 파생 DC가를 준비하는 방법을 설명 방법과 형광 Qdots으로 그들을 분류. 그림. 그림 동안 1, 세포를 얻을 수있는 절차를 요약한 것입니다. 2 Qdots 그들을 분류하는 절차를 묘사. 마찬가지로 그림에 표시됩니다. 3, 거의 모든 세포가이 절차에 의해 표시되며, 이것은 염증 요인과 DC의 성숙 (그림 4). 그림에 영향을받지 않습니다. 염증성 칵테일로 치료하면 Qdot 묻은 DC가 (Fig.5a)가 아닌 묻은 세포와 유사한 동작되는 5 보여줍니다. 두 세포 준비는 비슷하게 costimulatory 분자의 표현 (그림의 5B)를 upregulate 및 성숙의 자극시 IL - 6 (그림 5C)와 질산 산화물 (그림 5D)의 유사한 양을 생산하고 있습니다. 이것은 previ 동의그 Qdot의 얼룩을 나타내는 ous 게시된 데이터는 면역 응답을 할 [6]을 도출 능력 성숙 세포로 전환될 DC의 능력에 영향을주지 않습니다. 이러한 세포는 다음 실험 동물을 주입 사용할 수 있습니다. 마찬가지로 그림에 표시됩니다. 6 2 일 생쥐로 분류 DC가의 정맥 주사 후, 우리는 비장의 Qdot 묻은 세포를 감지할 수 있었다. 이것은 또한 생체내에서 DC의 마이 그 레이션을 평가 Qdot nanocrystals의 사용을 보여주는 이전 게시된 데이터와 계약에 [6] 비침습 이미징 및 유동세포계측법에 의해.
골수에서 DC 생성 그림 1. 플로우 차트. 즉결 우리는 골수 파생 DC를 얻는 과정을 묘사. 모두 tibias 및 대퇴골은 해부와 조직을 주변에서 청소됩니다. 본 도움말은 보존되고 뼈 내부는 매체로 플러시됩니다. 적혈구를 제거 후, 골수 세포는 DC가로 그들을 차별화하는 GM - CSF의 존재에 8 일간 양식입니다.
상표 절차 그림 2. 플로우 차트. Qtracker 셀 라벨링 키트 구성 요소의 동일 aliquots는 A와 B는 eppendorf 튜브에 혼합됩니다. 돌기 세포는 GM - CSF와 함께 8 일 골수 문화에서 수집하고 37C에서 60 분에 대한 상표 염료와 혼합됩니다. 그러면 세포는 과도한 라벨 입자를 제거 미디어 씻어 수 있습니다.
그림 3. 즉시 라벨링 후 DC가의 형광등 microphotography. 분류 세포의 방울은 유리 슬라이드에 예치하고 coverslip이 적용되었습니다. 그런 다음 샘플은 형광 현미경으로 평가되었고 이미지는 Micropublisher 5.0 디지털 CCD 컬러 카메라 (Qimaging, 써리, BC 캐나다)를 통해 획득한되었습니다.
그림 4. 체외에서 48 H의 성숙 이후에 DC가의 형광등 microphotography. 분류 DC가이 LPS (100 NG / ML)과 CO 2 배양기 (37 ° C, 5 % CO 2)에 유리 슬라이드에 TNF - α (20 NG / ML) 48 H에 대한 교양되었습니다. 그런 다음 샘플은 PBS (5 분, 2X)로 씻은 아세톤 (15 분, 4 ° C)에 고정하고 DAPI와 counterstained되었습니다. 세포는 위와 같이 형광 현미경으로 평가했다.
그림 5. Qdot 스테인드 성숙 DC가의 생물 학적 활동. 위와 같이 체외에서 성숙 표시 DC가이 유동세포계측법 (A)에 의해 분석 (B) 하였다. (A) Qdot 묻은 세포는 FL3 (PercP) 채널에 강력한 신호를 제공합니다. 음영 히스토그램 : 흠없는 제어할 수 있습니다. 그리고 isotype 컨트롤, (B) Qdot 묻은과 흠없는 DC가가 추가로 성숙 마커 CD86과 CD40에 대한 구체적인 항체 물들일되었습니다. 세포는 다음 FACSort 흐름 cytometer (백톤 디킨슨, 산호세, CA)에서 분석했다. 또한 IL - 6 (C)과 질소의 산화물은 (NO) 성숙 Qdot 묻은 DCS 및 컨트롤 supernatants에서 결정됩니다. IL - 6와 질산 산화물의 수준은 엘리사 분석 및 우리가 이전에 7 설명한 것처럼 Griess 분석 8에 의해 결정됩니다. 이 그림에서 보여준 모든 데이터는 유사한 결과를 보여주는 두 개 또는 세 독립적인 실험의 대표입니다. 데이터 GraphPad 소프트웨어를 사용하여 ANOVA로 분석되었다.
그림 6. 해부 조직에 표시 DC가 탐지. 분류 성숙한 DC가 (1x10 6 셀)를 정맥 C57BL / 6 마우스에 주입했다. (A) 2 일 후 생쥐가 희생되었고 수집 spleens, 냉동 스냅, 10 월에 박혀 8 μm의 섹션 그라 이오 스탯을 사용하여 준비 하였다. 그런 다음 샘플은 아세톤 (15 분, 4 ° C)에 고정하고 DAPI와 counterstained되었습니다. 세포는 위와 같이 형광 현미경으로 평가되었다 그림 6A :. 40X 배율, 그림 6B : 100X 확대, 그림이. 6C, 400X 확대.
Discussion
T 세포 상호 작용 또는 DC 개발 및 다양한 질병 9-11에서 역할을 결정 : DC를 조사, Murine 골수양) DC가이 광범위 DC 기반의 백신의 효능 및 개선을 결정하기 위해 사용되었습니다. 즉결 우리는 tibias 및 대퇴골 뼈 marrows에서 발견한 엽 성의 전구 물질에서 DC가를 생성하는 방법을 보여줍니다. 우리는 따라서 오염의 가능성을 줄이고, 우리가 에탄올 70%에 잠수하여 그들을 소독 수 있도록 도움말을 절단하지 않고 뼈를 복구합니다. 골수 세포에서 DC가을 차별화하는 데 우리는 이전에 설명한 5 GM - CSF를 사용합니다. 일부 프로토콜은 또한 IL - 4를 사용하지만, 그것은 GM - CSF 12 높은 수준의 작업을 때이 시토킨가 필요 없다는보고되었습니다. 사실, 우리는 이전에 다음과 DC가이 면역 반응 13 유도 할 수 있다고 증명하고있다. 또한, 관심이 첨부된 세포가보다 단핵구와 같은 표현형을 보여 이후 매체와 배양 접시를 세척하여 8 일간의 문화에서 불과 느슨하게 자기편 세포를 복구하는 데주의가 필요하다. 여기 형광 Qdot 입자와 DC가의 라벨을 보여줍니다. 이 레이블은 다른 방법을 몇 가지 장점을 존중하고 있습니다. 첫째, Qdots 입자는 쉽게 세포에 포함됩니다. 둘째, 형광 신호가 매우 높은 및 DC 성숙에 의해 변경되지 않습니다. 세포 또는 조직이 GFP가 얼룩 프로토콜을 선택하는 순간에 더 많은 유연성을 제공, DC가 14 태그를 사용하면 어떻게 반대로 같은 아세톤과 같은 용매와 고정하는 경우 셋째, 형광가 손실되지 않습니다. 마지막으로,이 입자에 의해 주어진 높은 형광 신호는 조직 자동 형광에도 불구하고 세포의 시각화 수 있습니다. 이전 6 설명한 바와 같이, Qdot의 얼룩이 세포의 성숙 기능에 영향을주지 않았다. 즉결 우리는 Qdot 묻은 DC가이 costimulatory 분자를 upregulating하고, 염증성 자극에 대한 응답으로 IL - 6와 질산 산화물을 생산, 비 - 스테인드 DC가 같은 유사한 방식으로 동작한다는 것을 보여주기. DC가이 면역 반응을 트리거링 전문 세포가 있지만, 그들은 이러한 암, 죽상 경화증 4, 15, 16과 같은 병적인 조건에 참여하는 표시되었습니다. 그들은 또한 구조적도 새로운 혈관 19, 20 개발에 참여하는 등 제안 angiogenic 과정 17, 18,에 참여하는 주장했습니다. 따라서, DC는 생체내에서 추적하고, 다른 조직 4 21 그들의 지리적 지역화를 결정하는 허용 방법은, 22 매우 가치가 있습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 그랜트 R15 CA137499 - 01 (FB)와 오하이오 대학교 (FB)에서 시작 기금에서 NIH에 의해 부분적으로 지원.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratory | Females, 6-8 weeks old | |
| RPMI | Invitrogen | 11875-119 | |
| Fetal bovine serum, qualified | Invitrogen | 10437-028 | |
| Antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15240-096 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-049 | |
| ACK Lysing Buffer | Lonza Inc. | 10-548E | |
| Recombinant murine GM-CSF | PeproTech Inc | 315-03 | |
| Qtracker 655 Cell Labeling Kit | Invitrogen | Q25021MP | |
| Lipopolysaccharide | Invitrogen | tlrl-eblps | |
| Recombinant murine TNF alpha | PeproTech Inc | 315-01A | |
| CD86 antibody | BD Biosciences | 553691 | |
| CD40 antibody | BD Biosciences | 553791 | |
| Griess reagent system | Promega Corp. | G2930 | |
| IL-6 capture antibody | eBioscience | 13-7061-81 | |
| IL-6 detection antibody | eBioscience | 13-7062-81 |
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