Summary
树突状细胞摄取抗原和迁移对目前处理的T细胞抗原的免疫器官。 Qdot纳米晶体的标签提供了一个长期和稳定的的荧光信号。这使得跟踪树突状细胞的荧光显微镜的不同器官。
Abstract
树突状细胞（DC）的专业抗原提呈细胞（APCs）在外围组织和免疫器官，如胸腺，骨髓，脾，淋巴结和Peyer氏斑 1-3发现。区议会目前在外围组织样本的有机体抗原的存在，他们采取了，过程，并在其表面主要组织相容性分子（MHC）的背景下出现在。然后，抗原加载DCS迁移到他们目前处理的抗原引发特异性免疫反应的T淋巴细胞的免疫器官。评估区议会的迁徙能力的方法之一是标签与荧光染料 4 。
我们特此证明Qdot荧光纳米晶体的使用标签小鼠骨髓来源的DC。这种标签的优点是，Qdot纳米晶体具有稳定和持久的荧光检测标记细胞，恢复组织，使他们的理想。而要做到这一点，第一个细胞将恢复从小鼠骨髓培养8天粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的存在，以诱导DC分化。这些细胞就会然后用荧光Qdots标记，在体外孵化。用荧光显微镜，可以可视化染色细胞。细胞可注入实验动物，在这一点上，或可以成为成熟的细胞在体外孵化后炎症刺激。在我们手中，DC的成熟并没有确定的荧光信号的损失也不Qdot染色影响区议会的生物学特性。注射后，这些细胞可以通过荧光显微镜下面的典型解剖和固定程序，免疫器官。
Protocol
1。小鼠股骨和胫骨和骨髓细胞的文化剖析
- 牺牲的CO 2窒息2鼠标和仔细剖析未经切割的骨端的胫骨和股骨。
- 从所有连接的组织，用纸巾清洁的骨头。一定要小心，不要打破骨头。
- 在70％乙醇10分钟在35毫米培养皿中浸泡消毒的骨头。从这一刻起，一个生物安全罩内工作，以避免污染的细胞培养。
- 从乙醇中恢复的骨头，让他们在培养皿内的生物安全柜5分钟空气干燥。
- 削减一半的股骨和胫骨最薄的提示。骨内注入1毫升的RPMI培养基，无菌培养皿上使用无菌注射器（无血清，但用抗生素）。
- 收集细胞悬液，洗涤2X的RPMI培养基在1100 RPM在冷冻离心机（4℃）离心10 min与水平转头15 mL离心管中。
- 最后一次洗涤后，重悬细胞ACK裂解液在2毫升，在室温下5分钟孵育以消除红细胞。
- 加入含10％胎牛血清的RPMI 13毫升，重悬，如1.6中所述的相同的设置，在这个中型的2X清洗。
- 计数细胞，调整至2 × 10 5细胞/ ml的RPMI 10％FBS，并添加RM GM - CSF（20 ng / ml的终浓度）5。
- 添加10毫升这种悬挂无菌，微生物质量，10厘米的培养皿，和文化中的CO 2培养箱（37℃，5％CO 2）。
- 三天后，加入10毫升20毫微克/升rmGM - CSF的RPMI 10％胎牛血清的另一个准备板块。
- 三天后的10 ml的细胞悬液从每个培养皿中恢复，1.6离心，重悬在相同体积的RPMI 10％FBS的rmGM - CSF和返回的培养皿中。细胞培养中的CO 2培养箱为2天。
2。区议会的收集和标签
- 经过8天的文化松散贴壁细胞恢复洗新鲜培养基的培养皿。此协议呈现约2-4 X10 8区议会在我们手中。流式细胞仪检测细胞可以为DC表型分析。
- 收集细胞，然后655 Qtracker细胞标记试剂盒，严格按照制造商的指示标记。
- 我们得到了优异的成绩，在浓度为10 nm Qdots标签小鼠骨髓来源的区议会。而要做到这一点，Qtracker细胞标记试剂盒组成等分A和B是在等量混合，在室温下5分钟的孵育，并立即稀释震荡30秒1 / 100新鲜培养基
- 染色5 × 10 6区议会，混合5μL每个套件的组件A和乙在Eppendorf管中，在室温5分钟孵化。然后，加入1 ml的RPMI 10％FBS的孵化，和30秒的旋涡。
- 加入0.5毫升细胞悬浮液含5 × 10 6区议会，37 ° 60分钟的彗星。
- 然后，洗细胞在RPMI 10％FBS（1100 RPM）的2倍。可以为进一步的文化，或在PBS重悬细胞注射在实验小鼠的RPMI。
3。标记直流评价
- 通过荧光显微镜观察细胞标记，可以评估。而要做到这一点，一滴细胞悬液加入到载玻片，玻璃盖玻片覆盖，并用荧光显微镜考虑到这些Qdots排放和565nm的405 - 525nm的激发光谱分别评估（ 图3 ）
- 在这一点上，可以使用标记的细胞注入动物，或成熟，可诱导这些细胞孵育48小时（37 ° C，5 CO 2）中存在的LPS（100毫微克/毫升）和TNF -α（ 20毫微克/毫升）。荧光标记不会影响DC的成熟（ 图4）。
4。代表性的成果：
特此，我们介绍了如何准备小鼠骨髓来源的区议会，并标有荧光Qdots图。 1总结了程序，以获取细胞，而图。 2描述了程序标签Qdots他们。 如图所示。 3，几乎所有的细胞被标记此过程中，这是不是DC的成熟与炎症因子（ 图4）图的影响 。 5显示Qdot染色DCS（图5A）的行为类似非染色细胞，与炎症的鸡尾酒治疗。这两种细胞的准备工作同样上调共刺激分子的表达（ 图 5b）;并出示类似IL - 6（ 图 5c）和一氧化氮（图5D）的成熟刺激。这同意与先前类公布的数据表明Qdot染色不会影响DC的能力，变成成熟的细胞，从而引发免疫反应[6]。然后，这些细胞可以用于注射实验动物。 如图所示。 6，术后第2天静脉注射到小鼠体内标记的DC，我们能够发现在脾Qdot染色细胞。这也是与以前公布的数据显示Qdot纳米晶体的使用，以评估的DC在体内的迁移协议[6]通过非侵入性的成像和流式细胞仪。
图1 DC从骨髓中生成的流程图。现将我们描绘的过程中获得的骨髓来源的DC。两个胫骨和股骨的解剖和周围组织的清洁。骨提示保存和内部的骨骼中等刷新。消除红细胞后，骨髓细胞培养8天在GM - CSF的存在，分化成区议会。
图2 标签程序流程图 。 Qtracker细胞标记试剂盒组成的平等等分A和B是一个Eppendorf管中混合。树突状细胞是从8天骨骨髓文化与GM - CSF和收集与标签的染料混合在37C 60分钟。然后细胞被冲在媒体，消除多余的标签颗粒。
图3。 议会荧光显微后立即标签 。标记的细胞下降沉积在载玻片和盖玻片覆盖。然后，样品进行了评估在荧光显微镜和图像通过一个Micropublisher 5.0数字CCD彩色摄像机（Qimaging，加拿大不列颠哥伦比亚省萨里）收购。
图4 48 h后，在体外成熟的区议会的荧光显微。培养48小时与LPS（100毫微克/毫升）和肿瘤坏死因子-α（20毫微克/毫升），以CO 2培养箱（37℃，5％的CO 2）的玻片上的标记区议会。然后，样品分别洗净，用PBS（5分钟，2X）（15分钟，4 ° C），用丙酮固定，并用DAPI counterstained。细胞在荧光显微镜上述评价。
图5。Qdot 染成熟DC的生物活性。上述体外成熟的标记区议会进行了分析流式细胞仪（一）及（B） 。 （一）Qdot染的细胞会在FL3（PercP）通道的一个强烈的信号。直方图：不染控制阴影。 （二）Qdot染色和未染色区议会此外对成熟的标志物CD86和CD40的特异性抗体和同型对照染色。细胞，然后分析在FACSort流式细胞仪（Becton Dickinson公司，加利福尼亚州圣何塞）。此外，IL - 6（C）和一氧化氮（NO）测定上清成熟Qdot染区议会和控制。通过ELISA分析和Griess检测正如我们前面描述的7，8，IL - 6和一氧化氮水平测定。所有在此图中显示的数据是代表两个或三个独立的实验显示了类似的结果。数据是通过方差分析，使用的GraphPad软件。
图6。 检测标记在解剖组织的区议会。成熟DCs标记（1 × 10 6细胞）静脉注射到C57BL / 6小鼠。 （一）两天后，小鼠处死，脾脏收集，管理单元冻结，OCT包埋，8微米的部分使用低温恒温器。然后，样品固定，用丙酮（15分钟，4 ° C），用DAPI counterstained。细胞在荧光显微镜上述评估图6A：40倍的放大倍率， 图6B：100X的放大倍率， 图。 6C，400X的放大倍率。
Discussion
小鼠髓系）区议会已被广泛应用于以DC为基础的疫苗，以确定疗效和改善;调查DC：T细胞相互作用或DC发展; 在 9-11各种疾病，并确定它们的作用。现将我们展示了如何从从胫骨和股骨的骨髓恢复的前兆生成区议会。我们的骨头，没有切割提示恢复，使我们能够消毒浸没在乙醇70％，从而减少污染的可能性。为了从骨髓细胞分化议会，我们只用了 5先前所描述的GM - CSF的。尽管有些协议还使用IL - 4，据报道，这种因子是与GM - CSF的水平高12的工作时，没有必要。事实上，我们先前已经表明，这些区议会能诱导免疫反应 13 。此外，应采取恢复为期8天的文化的洗涤培养基的培养皿中，只是笼统地贴壁细胞，因为贴壁细胞表现出更多的类似单核细胞表型。在这里，我们展示区议会与荧光Qdot颗粒标签。这种标签有一些优势，尊重其他方法。首先，Qdots颗粒细胞很容易被纳入。二，荧光信号是非常高的，不是由DC的成熟而改变。三，荧光的细胞或组织固定溶剂，如丙酮，相反会发生什么，如果GFP是用来标记 14区议会，给予更多的时刻选择染色协议的灵活性时不会丢失。最后，尽管这些粒子的高荧光信号允许组织自体荧光的细胞可视化。如前所述6，Qdot染色并不影响这些细胞的成熟能力。现将我们Qdot染色DCS的行为在非染DCS类似的方式，上调共刺激分子，IL - 6和一氧化氮在炎症刺激生产。虽然区议会专门触发免疫反应的细胞，它们已被证明参与在病理条件下，如癌症和动脉粥样硬化4，15，16 。他们还声称，参与血管生成过程中甚至建议为参与结构，在发展的新船19，20 17，18 ，。因此，允许直流跟踪体内，并确定他们在不同的组织4，21的地域本地化的方法 ，22个是非常有价值的。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作由美国国立卫生研究院的支持下批准R15 CA137499 - 01（FB）和来自俄亥俄州立大学（FB）的启动资金的一部分。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratory | Females, 6-8 weeks old | |
| RPMI | Invitrogen | 11875-119 | |
| Fetal bovine serum, qualified | Invitrogen | 10437-028 | |
| Antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15240-096 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-049 | |
| ACK Lysing Buffer | Lonza Inc. | 10-548E | |
| Recombinant murine GM-CSF | PeproTech Inc | 315-03 | |
| Qtracker 655 Cell Labeling Kit | Invitrogen | Q25021MP | |
| Lipopolysaccharide | Invitrogen | tlrl-eblps | |
| Recombinant murine TNF alpha | PeproTech Inc | 315-01A | |
| CD86 antibody | BD Biosciences | 553691 | |
| CD40 antibody | BD Biosciences | 553791 | |
| Griess reagent system | Promega Corp. | G2930 | |
| IL-6 capture antibody | eBioscience | 13-7061-81 | |
| IL-6 detection antibody | eBioscience | 13-7062-81 |
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