Summary
הליך פשוט של vibratome חתך את האיבר של קורטי, ואחריו מיקרוסקופיה אימונוהיסטוכימיה ו confocal מתואר. הליך זה מאפשר שימור משופר של cytoarchitecture את הקנס של האיבר של קורטי יונקים, וכתוצאה מכך מאפשר כימות מדויק של סוגי תאים.
Abstract
האיבר של קורטי יונקים הוא פסיפס הסלולר הורה מאוד של שיער mechanosensory ותאים תומכים nonsensory
(הנסקרת ב 1,2). ויזואליזציה של הפסיפס הזה הסלולר לעתים קרובות מחייב את האיבר של קורטי הוא בחתך רוחב. בפרט, עמוד nonsensory ותאי "Deiters, שאת הגרעינים נמצאים basally ביחס לתאי שיער, לא יכול להיות דמיינו מבלי לחצות חתך את האיבר של קורטי. עם זאת, cytoarchitecture עדין של האיבר של קורטי היונקים, כולל תהליכים cytoplasmic קנס של העמוד ותאי "Deiters, קשה לשמור על נהלים היסטולוגית שגרתיות כגון פרפין cryo-חתך, אשר תואם תקן טכניקות צביעה immunohistochemical.
הנה אני מתארת תהליך פשוט וחזק המורכב vibratome חתך של שבלול, מכתים immunohistochemical מהסעיפים האלה vibratome בהר שלמה, ואחריו מיקרוסקופיה confocal. הליך זה כבר בשימוש נרחב לניתוח immunhistochemical של איברים מרובים, לרבות ניצן העכבר איבר, בטן דג הזברה, כבד, לבלב, לב (ראו 3-6 דוגמאות נבחרות). בנוסף, הליך זה היה sucessful הדמיה והן quantitificaton של מספר העמוד תא באיברים מוטציה ובקרה של קורטי בשני עוברי עכברים בוגרים ו 7. שיטה זו, עם זאת, כרגע לא בשימוש נרחב לבחון את איבר יונקים של קורטי. הפוטנציאל עבור הליך זה הן לספק שימור משופר של cytoarchitecture את הקנס של איבר הבוגרת של קורטי לאפשר כימות של סוגי תאים שונים מתואר.
Protocol
1. בידוד קיבוע פנימי של האוזניים
- ניתוח של דפוסים הסלולר האיבר של קורטי, להרדים כראוי מבוים עוברים או מבוגרים.
- לנתח את הקפסולה otic, המכיל את האוזן הפנימית קרומי. בשנת העכבר, זה יכול להיעשות בקלות על העוברים על העובר (ה) ביום 14.5 ומעלה, שבה E0.5 הוא היום שבו תקע הנרתיק זוהה. Dissection של הקפסולה otic נעשה לראשונה על ידי עריפת ראש ופתיחת הגולגולת על קו האמצע. הסר המוח לחשוף כל אוזן (איור 1A). האוזניים הפנימי ניתן הפגיזו את מלקחיים באמצעות שלמים (כגון 1B דומון # 5, איור.). אם הדמיה האיבר של קורטי, הסרה זהירה של כל רקמות החיבור ואת עצבי הקשור הקפסולה otic אינו הכרחי.
- תיקון אוזניים פנימי שלם על ידי טבילה paraformaldehyde 4% (PFA) עם נדנדה עדין ב 4 ° C במשך הלילה 1.8 בורג הכתיר מ"ל NUNC cryo-צינור בקבוקונים, או מכולה בגודל מתאים אחרים. פתרון PFA צריכה להיעשות טרי DDH 2 0, מאוחסן אז -20 ° C עד הצורך.
- למחרת, לשטוף את מקבע עם שלושה שינויים של פוספט 1X בופר סליין (PBS). רקמות ניתן לאחסן סטרילי 1X PBS במשך ימים עד חודשים עד מוכן לעיבוד. עבור רקמות למבוגרים, decalcify ב EDTA 10% (0.27 מ ') בשעה 4 ° C למשך 5 ימים, ואחריהם שטיפה אחסון 1X PBS.
2. חיתוך חלקים vibratome
- הכן 4% טמפ 'התכה נמוכה agarose ב 1X PBS. הוסף נקודת התכה נמוכה agarose אל 1X PBS ומיקרוגל עד agarose נמצא פתרון. תשמרי על עצמך כי הפתרון אינו בועה על - להוציא במיקרוגל מעת לעת מערבולת לערבב. שמור על פתרון אמבטיה 55 מעלות צלזיוס מים עד מוכן לשימוש.
- בעזרת מלקחיים, להסיר את האוזן הפנימית מפתרון PBS 1X ואת המיקום בתחתית התבנית פיל-A-Way הטבעה. Pipet משם כל עודף 1X PBS מן התבנית. מלא עובש כדי לכסות את הרקמה עם שפע של נוזל 4% טמפ 'התכה נמוכה agarose (איור 2 א).
- מקם את האוזן הפנימית עבור חתך במישור המתאים. אני השיגו טוב חתכים של האיבר של קורטי על ידי קירוב את המיקום של הקפסולה otic כאילו הושארו באתרם בראש חתך במישור רוחבי. עבור E14.5 עוברים למבוגרים, מקם את האוזן הפנימית, כך הוא מוצג בצורה רוחבית, עם התעלה חצי עגול לרוחב גלוי (איור 2B). זווית האוזן הפנימית, כך שנוצר על ידי קו הצד האחורי של הקפסולה otic כ בזווית של 45 מעלות מהמטוס המיועד של חתך (איור 2 א ', ב). כאשר הקפסולה otic מוצג כך את החלק הגבי של הקפסולה otic נמצא בראש, להפוך את הבסיס של שבלול צריך להיות ממוקם בתחתית (ראש חץ, איור. 2B) ואת תעלת קדמית חצי עגול (עולה) צריך להיות בחלק העליון (איור 2B).
- Agarose תקבע ב RT בתוך 30 דקות. פיל, הרחק תבניות העברה המכיל רקמות מוטבע על 4 מעלות צלזיוס עד מוכן סעיף. אם חתך יהיה לדחות עד למחרת, להוסיף 1X PBS כדי לכסות את agarose במתכונת ומאחסנים בקופסה המכילה מגבות נייר לח טבול 1X PBS.
- לקלף עובש הפלסטיק. באמצעות סכין גילוח, לגזור תיבת agarose המכיל את רקמות האוזן הפנימית. תשמרי על מנת להבטיח כי מטוס של סעיף זה ישר מקביל בצד השני של הרחוב, אשר יהיה משטח שעליו לחסום agarose מודבק למטה. מאז agarose לא לחדור את הרקמה, לא לקצץ יותר מדי agarose מרחבי הרקמה, כך רקמות יהיה נתמכות היטב.
- השתמש בדבק לצרף את גוש למשטח החיתוך.
- סעיף ב עובי 40-100 מיקרומטר ידי vibratome. שמור סעיפים בצלחת רקמות תרבות מלא 1X PBS, 0.1% TritonX-100. סעיף נציג דרך הספירלה שבלול מוצג באיור. 2C.
- שימוש במלקחיים לנתח משם את agarose מן הרקמה. Agarose לא יחדרו את הרקמה, אבל פשוט יהיה תקוע על פני השטח החיצוני של האוזן הפנימית.
- אם תרצה, בריכת agarose חינם, רקמה מחולק באמצעות pipet עם פתח גדול חור כדי למנוע מריחה מוגזמת של הרקמה. אם ביצוע כתמים נוגדן מרובים על רקמות שונות מרובות, ניתן לזהות קטעים מאורגן 16 - או 24 גם תרבות צלחת רקמות.
3. מכתים נוגדן vibratome בסעיפים
המשך עם נוגדן הכתם. תהליך מקטעים שלמים הר, ריחוף ללא פתרון. להלן נוגדן למשל מכתים פרוטוקול סמן S100 של תאים מעמודי התווך של האיבר של קורטי, אבל הפרוטוקול יכול לשמש נוגדן כלשהו. שוטף כל נערכות בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת.
- בכל צלחת רב גם בתרבית רקמה, דגירה חופשי צף חלקים עם נדנדה עדין PBT (1X PBS, 1% שור טריטון בסרום אלבומין, 0.1% X-100) במשך 30 דקות.
- Pipet את הפתרון הישן לחסום חופשי floating קטעים עם נדנדה עדין PBT + עז בסרום נורמלי (50 NGS μl / 1 מ"ל PBT) במשך 30 דקות.
- Pipet את הפתרון הישן להוסיף נוגדן ראשוני בדילול מלא + PBT NGS (1:200 דילול S100 ב PBT + NGS). דגירה לילה ב 4 ° C עם נדנדה עדין.
- Pipet את הפתרון נוגדן ראשוני. לשטוף 3X, 5 דקות. עם PBT, 4X ואז, 30 דקות. עם PBT.
- בלוק עם PBT + NGS, 30 דקות.
- דגירה עם נוגדנים משני fluorescently-מצומדות (שהועלו עז) בדילול מלא + PBT NGS. דגירה לילה ב 4 ° C, או כמה שעות, RT, נדנדה עדין.
- Pipet את הפתרון נוגדנים משני. לשטוף 3X, 5 דקות. אז 4X, 30 דקות. עם PBT.
- Pipet את PBT האחרון לשטוף ולהחליף עם המדיום המתאים הרכבה מימית המכילה counterstain גרעיני.
4. חלקים הרכבה על שקופיות מיקרוסקופיה confocal
כדי למנוע ריסוק בסעיפים עבה עם coverslip, כאשר גובר חלקים בודדים, spacer חייב להיות מוכנס בין שקופיות מיקרוסקופ ואת coverslip. להלן שתי שיטות חלופיות של חלקים הרכבה vibratome עבה:
- Spacer אפשר ליצור על ידי הנחת שפה של שומן ואקום בתוך ריבוע סביב החלק רקמות. לכן, כאשר הנחת את coverslip, קצוות של coverslip יהיה חתום גריז ואקום. לחץ כלפי מטה על שולי coverslip עם האגודל כדי לדבוק בנחישות אותו לשקופית. אם גריז ואקום היא יפה אחיד הנוכחי סביב כל הקצוות של coverslip, החלק יהיה אטום מספיק לשימוש מיקרוסקופ confocal הפוכה.
- לחלופין, spacer יכול להיות שנוצרו באמצעות agarose שרף כרומטוגרפיה של גודל רשת ידועה (כגון Affi-Gel ג'ל כחול, Bio-Rad). 1 Pipet μl של שרף לשקופית מיקרוסקופ בכל אחת מארבע פינות coverslip שבו יוצב. One Pipet רקמות סעיף התקשורת הרכבה לאמצע של ארבע נקודות של שרף. Coverslip. אם באמצעות מיקרוסקופ confocal הפוכה, לאטום את coverslip לשקופית באמצעות מיקרוסקופ nailpolish.
- השג סעיפים אופטי של פרוסות vibratome מוכתמים באמצעות מיקרוסקופיה confocal. כדי לכמת את סוגי תאים שונים בתוך האיבר של קורטי, להשיג Z-מחסנית בגודל צעד מוגדר (בין 1.5 ל -3 מיקרומטר). מדורים צריך להיות נגד מוכתם לצבוע גרעינית (שלב 3.8). דמויות יכולות להיבחן על כל מסך המחשב לאחר אוסף תמונה confocal. תאים ניתן לספור ידני להיות התבוננות הופעה והיעלמות של הגרעינים כתמונות נבחנות ברצף באמצעות מחסנית-z.
5. נציג תוצאות:
Confocal נציג Z-מחסנית באמצעות קטע vibratome, מוכתם עבור חלבון S100, אשר שוהה עמוד ותאי "Deiters, ו counterstained עם צבע גרעיני (איור 3A-F). פאנל כל התמונה confocal נלקחה ב 3 מיקרומטר, צעדים, עם פאנל התמונה confocal שהושגו הקרובים אל פני השטח של סעיף הפאנל vibratome ו-F התמונה confocal השיג רוב פנימי בתוך הקטע vibratome. מורפולוגיה של האיבר של קורטי מופיע שיבשו מינימלית. בפרט, שלוחות cytoplasmic של תאים עמוד אינם שבורים. לפי לציין את המראה ואת היעלמותו של גרעיני תאים באמצעות עמוד מחסנית-z (איור 3A ל 3F), תא פנימי וחיצוני כאחד מספר העמוד ניתן לספור (ראה מספור, איור 3A -. F). בשל המספר הקטן של כל סוג תא לכל תמונה confocal, גישה זו ניתן להשתמש כדי לספור תאים מסוגים ביותר בתוך האיבר של קורטי.
באיור 1. אינטקט, 15 בן שבועיים, האוזניים הפנימי מבוגר עטוף הקפסולה otic. (א) קפסולה otic ימינה (בסוגריים) עטוף הגולגולת, שנצפו מנקודת מבט של בתוך הראש, לאחר ההסרה של המוח. Anterior נמצאת מימין. (ב) שלמים, 15 שבועות בן באוזן הפנימית לאחר דיסקציה מהגולגולת. משטח הרוחב של האוזן הפנימית שמאל גלוי; השטח המדיאלי של האוזן הפנימית זכות גלוי. תוויות לציין את מיקומם של הקדמי חצי עגול תעלה (עולה), שיתוף (שבלול), ו ow (חלון סגלגל).
איור 2. (א) האוזן הפנימית שלמים מן מבוגר 15 בן שבוע, מוטבע agarose במרכז עובש פיל פרידה. המטוס מיועד סעיף מצוין. (ב) תקריב תמונה של אוזן, 15 בן שבועיים פנימי שלם לפני ההטבעה. חלק מן העצם שמסביב כבר גזור משם כך מבוך קרומי יכול לראות בצורה ברורה יותר. התעלה לרוחב חצי עגול (LSC), תעלה קדמית חצי עגול (עולה), וכן שבלול (במשותף) הם לייחס (עקומות לבן). להפוך את הבסיס של שבלול (ראש חץ) והמטוס נועד סעיף (קו מקווקו) מצוינים. (ג) נציג CROss-קטע דרך שבלול. בחתך אחד דרך צינור שבלול, האיבר של קורטי (OC) הוא התאגרף, vascularis stria (ד"ה) הוא בסוגריים, ואת הממברנה של Reissner (RM) מצוין.
איור 3. איבר קורטי בעכבר wild-type ב p21. (AF) סדרה confocal סדרתית, על תאים 3 מיקרומטר צעד בגודל, דרך איבר S100 נוגדן מוכתם של קורטי לדמיין את התאים העמוד Deiters ". ספירת התאים עמוד הפנימיים והחיצוניים מההתחלה עד הסוף של הסדרה ממוספרים. קיצורים: IHC (תא השיער הפנימי), aIHC (שיער סמוך התאים הפנימית), OHC (תא השיער החיצונית), מחשב (תא העמוד), DC (תא 'Deiters).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההליך של חתך vibratome, ואחריו הדמיה אימונוהיסטוכימיה ו confocal מאפשר להדמיה של האיבר של קורטי עם נזק לרקמות מינימלית. ברור confocal תמונות שנלקחו האזורים הפנימיים בסעיף vibratome להראות שימור מעולה של מורפולוגיה תאית מוגבל רק על ידי חפצים קיבעון. תמונות שצולמו Confocal קרוב לשני משטחים לחתוך קטע vibratome לעיתים קשה להבדיל בין תמונות מאזורים פנימיים, למרות השיבושים הסלולר מפעם לפעם, כמו הפסקות סיומות cytoplasmic של תאים עמוד נצפו (לא מוצג). גישה זו היא פשוטה, ואת הפריטים הציוד הגדולות - מכונה vibratome ו מיקרוסקופ confocal - הם פריטי ציוד משותף, כי הם בדרך כלל נגיש ביותר החוקרים. בנוסף, גישה זו יכולה לשמש נוגדן כלשהו שמראה מכתים ספציפיים האיבר של קורטי. אכן, המגבלה העיקרית של גישה זו היא הספציפיות של הנוגדן, והשינויים בשלב 3 של פרוטוקול זה עשוי להיות נחוץ כדי להבטיח כי נוגדן נתון תגרום מכתים ספציפיים. לסיכום, אני מתארת תהליך פשוט, אשר להכליל את כל הנוגדנים ומבטיח שימור ניתוח מירבית של הארגון הסלולר של האיבר של קורטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי בית הספר לרפואה של ויסקונסין IACUC.
Acknowledgments
המחבר מבקש להודות השימוש המחקר Core הילדים הדמיה המכון מיקרוסקופיה confocal ד"ר ג'אנג ג'יאן על ההצעה לעלות חלקים באמצעות חרוזים agarose. עבודה זו מומנה על ידי מענק NIH DC010387.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leica VT1000S Vibrating Blade Microtome | Leica Microsystems | ||
| Zeiss LSM510 laser scanning confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Peel-A-Way embedding mold | Polysciences, Inc. | 18986 or 18646A | |
| bovine serum albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| Goat Serum | Invitrogen | 16210-064 | |
| S100 | Dako | Z0311 | |
| Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-11036 | 1:1000 dilution |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| YO-PRO-1 | Invitrogen | Y3603 | |
| vacuum grease | Fisher Scientific | S41718 | |
| Affi-Gel Blue Gel | Bio-Rad | 153-7301 |
References
- Lim, D. J. Functional structure of the organ of Corti: a review. Hear Res. 22, 117-146 (1986).
- Raphael, Y., Altschuler, R. A. Structure and innervation of the cochlea. Brain Res Bull. 60, 397-422 (2003).
- Chung, W. S., Shin, C. H., Stainier, D. Y. Bmp2 signaling regulates the hepatic versus pancreatic fate decision. Dev Cell. 15, 738-748 (2008).
- Sun, X., Mariani, F. V., Martin, G. R. Functions of FGF signalling from the apical ectodermal ridge in limb development. Nature. 418, 501-508 (2002).
- Trinh, L. A., Stainier, D. Y. Fibronectin regulates epithelial organization during myocardial migration in zebrafish. Dev Cell. 6, 371-382 (2004).
- Yin, C., Kikuchi, K., Hochgreb, T., Poss, K. D., Stainier, D. Y. Hand2 regulates extracellular matrix remodeling essential for gut-looping morphogenesis in zebrafish. Dev Cell. 18, 973-984 (2010).
- Shim, K., Minowada, G., Coling, D. E., Martin, G. R. Sprouty2, a mouse deafness gene, regulates cell fate decisions in the auditory sensory epithelium by antagonizing FGF signaling. Dev Cell. 8, 553-564 (2005).
