Summary
immunohistochemistry과 공촛점 현미경 다음 Corti의 기관을 sectioning vibratome의 간단한 절차 설명합니다. 이 절차는 Corti의 포유 동물 장기의 벌금 cytoarchitecture 개선 보존을 허용하고, 결과적으로 세포 유형의 정확한 양을 정함을 허용합니다.
Abstract
Corti의 포유류의 기관은 mechanosensory 머리 nonsensory 지원 세포의 높은 주문한 세포 모자이크입니다
(1,2에서 검토)이 세포 모자이크. 시각화는 종종 Corti의 기관 간 sectioned되어 있어야합니다. 특히, 그의 핵 세포와 관련하여 basally 있습니다 nonsensory 기둥과 Deiters '세포는, Corti의 오르간을 교차 sectioning없이 시각 수 없습니다. 그러나, 기둥 및 Deiters '세포의 미세 세포질 프로세스를 포함 Corti의 포유류의 기관의 섬세한 cytoarchitecture는, 표준 immunohistochemical 얼룩 기술과 호환되는 이러한 파라핀과 cryo - sectioning 같은 일상 histological 절차에 의해 보존하기가 어렵습니다.
난 여기 공촛점 현미경 다음 달팽이관 전체 마운트 이러한 vibratome 섹션 immunohistochemical 얼룩의 sectioning vibratome 구성된 단순하고 강력한 절차를 설명합니다. 이 절차는 마우스 사지 봉오리, zebrafish 굿, 간, 췌장, 그리고 마음 (선택한 예제 3-6 참조)를 포함하여 여러 기관의 immunhistochemical 분석 널리 사용되고 있습니다. 또한이 절차는 배아와 성인 생쥐 일곱 모두 Corti의 돌연변이 및 제어 장기 기둥 휴대폰 번호의 이미징 및 quantitificaton 모두 sucessful했다. 이 방법은 그러나, 현재 널리 Corti의 포유 동물 장기를 검사하는 데 사용되지 않습니다. Corti의 성인용 기관의 벌금 cytoarchitecture의 향상된 보존을 제공하고 다양한 세포 유형의 부량 수 있도록 모두이 절차에 대한 가능성을 설명합니다.
Protocol
1. 내부의 귀를 분리 및 고정
- Corti의 장기에서 세포 patterning의 분석을 위해, 안락사가 적절하게 배아 또는 성인 개최.
- 막의 내이 (内耳)를 포함, 귀의 캡슐을 절개하다. 마우스에서, 이것은 쉽게 (E) 일 14.5 세 이상이있는 E0.5가 질 플러그가 발견했습니다되는 날이 배아에서 배아에서 할 수 있습니다. 귀의 캡슐의 절개는 정중선에서 잘린과 두개골의 개방에 의해 첫번째 수행됩니다. 각각의 귀를 (그림 1A) 노출 두뇌를 제거합니다. 내부 귀는 그대로 사용 포셉 (예 : 더몬트 # 5, 그림. 1B)를 했대 수 있습니다. 이미지 Corti 기관의 경우, 귀의 캡슐과 관련된 모든의 연결 및 결합 조직의주의 제거가 필요하지 않습니다.
- 4 부드러운 락을과 4 % paraformaldehyde에 집중 (PFA)에 의해 전체 내부 귀를 수정 ° C 1.8 ML 나사 덮인 NUNC Cryo - 튜브 튜브 또는 기타 적절한 크기의 용기에 하룻밤. PFA 솔루션이 필요 때까지 -20 ° C에 보관 ddH 2 0에서 신선한하여야한다.
- 그 다음날, 1X 인산 세 변화로 정착액을 씻어 호수 (PBS)를 버퍼. 처리를위한 준비까지 조직은 개월 일 최대 살균 1X PBS에 저장할 수 있습니다. 성인 조직에 대한 4 10 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (0.27 M)에 decalcify ° rinsing 및 1X PBS에 보관하여 다음에 오일에 대한 C,.
2. vibratome 섹션을 절단
- 1X PBS에서 4% 낮은 녹는 포인트 아가로 오스를 준비합니다. 아가로 오스는 솔루션에까지 1X PBS, 전자렌지에 낮은 용융 점 아가로 오스를 추가합니다. 솔루션을 통해 거품하지 않는 부탁해 - 정기적으로 전자 레인지와 섞어 소용돌이 밖으로 가져가라. 사용할 준비가 될 때까지 55 ° C의 물을 욕조의 솔루션을 유지.
- 포셉를 사용 1X PBS 솔루션과 필 - A - 웨이 포함 금형의 하단에있는 위치에서 내이 (内耳)를 제거합니다. 금형에서 Pipet 거리 초과 1X PBS. 액체 4퍼센트 낮은 녹는 포인트 아가로 오스 (그림 2A) 많이있는 조직을 커버하기 위해 금형을 입력합니다.
- 해당 비행기에 sectioning에 대한 내이 (内耳)를 놓습니다. 난 그게 머리에 현장에 남아 있던 것처럼 귀의 캡슐의 위치를 approximating 및 가로 비행기에 sectioning에 의해 Corti의 기관의 좋은 크로스 섹션을 획득했습니다. 그것이 눈에 보이는 측면 반 원형 운하 (그림 2B)로, 옆으로 볼 수 있도록 성인, 위치, 내이 (内耳)를 E14.5 배아하십시오. 귀의 캡슐의 사후 옆 형성 라인 (그림 2A, B) sectioning의 의도된 비행기에서 45도 각도로 약되도록 내이 (内耳)를 각도. 귀의 캡슐이 귀의 캡슐의 지느러미 부분이 상단에 너무 많이하면 달팽이관의 기초 설정은 하단 (화살촉, 그림. 2B)에 위치하고 앞쪽에 반 원형 운하 (ASC)이되어야한다 상단 (그림 2B)에 있습니다.
- 아가로 오스는 30 분 이내에 RT로 설정합니다. 전송 필 - 어웨이 금형은 ° C 섹션 준비까지 4 임베디드 조직을 포함하는. sectioning가 다음날까지 연기되는 경우, 1X PBS는 1X PBS에 담가 젖은 종이 타월을 포함 상자에 금형 및 저장소의 아가로 오스를 충당하기 위해 추가합니다.
- 플라스틱 금형 벗겨내는 거지. 면도날을 사용하여 내이 (内耳)의 조직을 포함하는 아가로 오스 상자를 잘라. 섹션의 비행기가 똑바로 아가로 오스 블록이 아래로 접착되는 표면 될 블록의 반대편에 평행하게되도록하는데주의를 기울여야. 아가로 오스가 조직에 침투하지 않기 때문에, 조직이 잘 지원되도록, 조직 주위에서 너무 많은 아가로 오스를 잘라하지 않습니다.
- 절단 표면에 블록을 연결하는 superglue를 사용합니다.
- vibratome으로 40-100 μm의 두께로 섹션을 참조하십시오. 1X PBS, 0.1 % TritonX - 100 가득한 조직 문화 요리에 섹션을 저장합니다. 달팽이 나선형을 통해 대표적인 부분은 그림에 표시됩니다. 2C.
- 조직의 아가로 오스 멀리 해부하다하는 포셉를 사용합니다. 아가로 오스는 조직을 침투하지 않지만 단지 내이 (内耳)의 바깥 표면에 붙어 것입니다.
- 원하는 경우, 수영장, 아가로 오스 프리, sectioned 조직은 조직의 과도한 전단을 방지하기 위해 큰 구멍이 열고있는 pipet을 사용합니다. 또는 24 - 잘 조직 문화 요리 - 여러 다른 조직에 여러 항체 얼룩을 수행하는 경우, 섹션은 16 구성할 수 있습니다.
3. 항체 얼룩의 vibratome 섹션
항체는 얼룩 진행합니다. 솔루션에 무료 부동 전체 - 마운트의 프로세스 섹션. 아래 Corti의 기관의 기둥 세포의 S100 표시에 대한 예제 항체 얼룩 프로토콜이지만, 프로토콜은 모든 항체에 대해 사용할 수 있습니다. 별도의 언급이없는 한 모든 세척은 상온에서 실시하고 있습니다.
- 멀티 잘 조직 문화 요리에서 30 분 대한 PBT의 부드러운 락을 (1X PBS, 1 % 소 혈청 알부민, 0.1 % 트리톤 X - 100) 무료 - 부동 섹션을 품어.
- 이전 솔루션과 블록 자유 층에서 Pipet30 분 대한 PBT + 정상 염소 혈청에 부드러운 락을 (50 μl NGS / 1 ML PBT)와 섹션을 oating.
- 이전 솔루션에서 Pipet와 PBT + NGS (PBT + NGS의 S100의 1:200 희석)에 희석 기본 항체를 추가합니다. 4 밤새 품어 ° C를 부드러운 락을 함께.
- 기본 항체 용액에서 Pipet. , 5 분 배 씻으십시오. PBT와 다음, 4X, 30 분. PBT와 함께.
- PBT + NGS와 블록, 30 분.
- PBT + NGS의 희석 찬란 - 복합 이차 항체 (염소의 사육)와 부화. 4 밤새 품어 ° C, 또는 몇 시간, RT, 부드러운 락을.
- 차 항체 용액에서 Pipet. , 5 분 배 씻으십시오. 다음, 4X, 30 분. PBT와 함께.
- 마지막 PBT에서 Pipet은 씻어과 핵 counterstain를 포함하는 적절한 수성 장착 매체로 바꿉니다.
4. 슬라이드 및 공촛점 현미경에 장착 섹션
coverslip으로 두꺼운 부분을 깔아 뭉 갠다고 방지하기 위해, 각각의 섹션을 장착하면, 공백은 현미경 슬라이드와 coverslip 사이에 삽입해야합니다. 아래 두꺼운 vibratome 섹션을 장착 두 가지 다른 방법은 다음과 같습니다
- 스페이서는 조직 섹션 주변 광장에 진공 그리스의 림을 배치하여 만들 수 있습니다. 따라서 coverslip를 내려놓고 때 coverslip의 가장자리는 진공 그리스와 함께 날인 것입니다. 단단히 슬라이드에 그것을 준수하여 엄지와 coverslip의 가장자리 아래로 누르십시오. 진공 그리스는 coverslip의 가장자리 주위에 깔끔하게하고 균일하게 존재하는 경우, 슬라이드가 거꾸로 공촛점 현미경에서 사용하기 위해 충분한 날인 것입니다.
- 또는 공백이 알려진 메쉬 크기의 아가로 오스 크로마 토그래피 수지 (예 : Affi - 젤 블루 젤, 바이오 래드 등)를 사용하여 만들 수 있습니다. coverslip가 배치됩니다 네 개의 모서리 각 현미경 슬라이드에 수지 Pipet 1 μl. 수지의 4 개의 점을 한 가운데에 Pipet 한 조직 섹션 및 장착 미디어. Coverslip. 거꾸로 공촛점 현미경을 사용하는 경우 nailpolish를 사용하여 현미경 슬라이드에 coverslip을 봉쇄.
- 공촛점 현미경을 사용하여 스테인드 vibratome 슬라이스의 광학 부분을 구합니다. Corti의 기관 내에 다양한 셀 유형을 수치, 정의 단계 크기 (1.5 및 3 μm의 사이)에서 Z - 스택을 얻습니다. 섹션 핵 염색 (3.8 단계)와 카운터 묻은해야합니다. 이미지 공촛점 이미지 모음 후에 컴퓨터 화면에 검사하실 수 있습니다. 세포 이미지가 Z - 스택을 통해 순차적으로 검사 있으므로 수동으로 핵의 모양과 실종 사건을 관찰 할 계산하실 수 있습니다.
5. 대표 결과 :
기둥과 Deiters '세포에 존재하고, 핵 염색 (그림 3A - F)와 counterstained S100 단백질에 대한 스테인드 vibratome 섹션을 통해 대표 공촛점 Z - 스택. 각 패널은 패널, 3 μm의 - 단계에서 촬영한 공촛점 이미지 공촛점 이미지 vibratome 섹션 패널 F vibratome 섹션 내에서 가장 내부 얻은 공촛점 이미지의 표면에 가까운 얻을. Corti의 기관의 형태는 최소한 방해가 나타납니다. 특히, 기둥 세포의 세포질 확장이 깨진되지 않습니다. Z - 스택 (그림의 3A 층)를 통해 기둥 세포 핵의 모양과 실종 사건을 지적하여 모두 내부와 외부 기둥의 휴대폰 번호는 (. - F 번호, 그림 3A 참조) 계산하실 수 있습니다. 공촛점 이미지마다 각각의 셀 타입의 소수으로 인해,이 접근법은 Corti의 기관 내에서 가장 셀 유형을 계산하는 데 사용할 수 있습니다.
그림 1. 손대지 15 주 된, 어른 내부 귀는 귀의 캡슐으로 쌌다. (A) 오른쪽 귀의 캡슐 (괄호)는 두뇌의 제거 후, 머리 내부의 밴티지 포인트에서 조회, 두개골으로 쌌다. 앞쪽에는 오른쪽에 있습니다. (B) 손상, 15 주 된 내부 귀 두개골의 절개 후. 왼쪽 내이 (内耳)의 측면 표면은 표시되며 오른쪽 내이 (内耳)의 중간 표면은 볼 수 있습니다. 레이블은 앞쪽에 반 원형 운하 (ASC), 공동 (달팽이관), 그리고 아야 (난원 창)의 위치를 나타냅니다.
그림 2. 필 - 어웨이 금형의 중심에 아가로 오스에 포함된 15 주 된 성인에서 (A) 전체 내이 (内耳). 섹션의 대상 비행기가 표시됩니다. 전에 삽입하기 15 주 된, 전체 내이 (内耳)의 (B) 클로즈업 이미지. 막의 미로 더 명확하게 본 수 있도록 주위의 뼈 부분은 거리를 해부했습니다. 측면 세미 원형 운하 (LSC), 앞쪽에 세미 원형 운하 (ASC), 그리고 달팽이관 (공동) (화이트 곡선) 추적하고 있습니다. 달팽이관 (화살촉)의 기초 설정 및 섹션 (점선)의 목적으로 비행기가 표시됩니다. (C) 대표 크로스달팽이관을 통해 S - 절을 참조하십시오. 달팽이 덕트 관통 단면에서 Corti (OC)의 기관이 박스는, 자국 vascularis (SV)는 괄호이며, Reissner의 막은 (RM) 표시됩니다.
그림 3. P21에서 야생 타입 마우스 Corti의 기관. 기둥 세포와 Deiters을 시각화하기 위해 Corti의 S100 항체 묻은 기관을 통해 3 μm의 스텝 크기를 '세포에서 (AF) 선형 공촛점 시리즈. 시리즈의 마지막에 처음부터 내부 및 외부 기둥 세포의 카운트 번호가 있습니다. 약어 : IHC (내부 머리 세포), aIHC (인접 내부 머리 세포), OHC (외부 머리카락 세포), PC (기둥 세포), DC (Deiters '셀).
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Discussion
immunohistochemistry와 공촛점 이미징 다음 vibratome sectioning의 절차는 최소한의 조직 손상 Corti의 기관의 시각화를위한 수 있습니다. 분명 vibratome 섹션에서 내부 지역에서 가져온 공촛점 이미지는 고정 아티팩트에 의해 제한됩니다 세포 형태 우수 보전을 보여줍니다. 이러한 기둥 세포의 세포질 확장 나누기로 가끔 세포 중단이 (표시되지 않음) 관찰 되었으나 vibratome 섹션의 두 컷 - 표면에 가까운 촬영 공촛점 이미지, 내부 지역의 이미지에서 자주 구별할 수 있습니다. 이러한 접근 방식은 간단하고, 주요 장비 아이템 - vibratome 기계 및 공촛점 현미경 - 일반적으로 대부분의 수사관으로 액세스할 수있는 공통 장비 아이템입니다. 또한,이 접근법은 Corti의 기관에서 특정 얼룩을 보여줍니다 모든 항체에 대해 사용할 수 있습니다. 사실,이 방법의 주요 한계는 항체의 특이성이며,이 프로토콜의 3 단계로 수정 주어진 항체가 특정 얼룩집니다 있도록해야 할 수도 있습니다. 요약, 난 어떤 항체에 generalizable하고 Corti의 기관의 세포 조직의 최대한의 보존 및 분석을 보장하는 간단한 절차를 설명합니다.
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Disclosures
동물 실험 위스콘신 IACUC의 메디컬 칼리지에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.
Acknowledgments
저자는 아가로 오스 비즈를 사용하여 섹션을 탑재하는 제안에 대한 공촛점 현미경 박사 지앤 장을위한 어린이 연구소 이미징 코어의 사용을 인정하고 싶습니다. 이 작품은 NIH에 의해 투자 DC010387 부여했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leica VT1000S Vibrating Blade Microtome | Leica Microsystems | ||
| Zeiss LSM510 laser scanning confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Peel-A-Way embedding mold | Polysciences, Inc. | 18986 or 18646A | |
| bovine serum albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| Goat Serum | Invitrogen | 16210-064 | |
| S100 | Dako | Z0311 | |
| Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-11036 | 1:1000 dilution |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| YO-PRO-1 | Invitrogen | Y3603 | |
| vacuum grease | Fisher Scientific | S41718 | |
| Affi-Gel Blue Gel | Bio-Rad | 153-7301 |
References
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