تحليل فسيفساء من وظائف الجينات في الدماغ بعد الولادة ماوس التنمية عن طريق استخدام فيروس لجنة المساواة العرقية القائمة على التوحد
Summary
و<em> في الجسم الحي</emيوصف> طريقة لاختبار وظيفة الجين في الدماغ بعد الولادة. يتم حقن AAVs المؤتلف معربا عن لجنة المساواة العرقية و / أو بروتين فلوري في مخ الفأر الولدان. وتتحقق الفسيفساء تعطيل الجينات ووضع العلامات العصبية متناثر ، مما يسمح التحليل السريع وظيفة الجين في العمليات الحرجة للتنمية الدوائر العصبية.
Abstract
وظيفة الدماغ طبيعي يعتمد ليس فقط على التطور الجنيني عندما يتم تأسيس المسارات العصبية الرئيسية ، ولكن أيضا على التنمية ما بعد الولادة عندما نضجت الدوائر العصبية وصقلها. قد Misregulation في هذه المرحلة يؤدي إلى اضطرابات عصبية ونفسية مثل التوحد وانفصام الشخصية 1،2. وقد تم دراسة العديد من الجينات في الدماغ قبل الولادة وجدت حاسمة لكثير من العمليات التنموية 3-5. ومع ذلك ، فإن وظيفتها في الدماغ بعد الولادة غير معروف إلى حد كبير ، ويرجع ذلك جزئيا الحذف في الفئران غالبا ما يؤدي إلى الفتك التنمية خلال حديثي الولادة ، ويرجع ذلك جزئيا إلى ما يتطلبه المبكر يعيق التنمية في تحليل ما بعد الولادة. للتغلب على هذه العقبات ، ويتم حاليا الأليلات floxed من هذه الجينات في الفئران التي يتم توليدها 6. عندما يقترن الأليلات المعدلة وراثيا التي تعبر عن لجنة المساواة العرقية recombinase في أنواع معينة من الخلايا ، ويمكن تحقيق الحذف مشروط لدراسة وظائف الجينات في الدماغ بعد الولادة. ومع ذلك ، يتطلب هذا الأسلوب الأليلات إضافية والوقت الاضافي (3-6 أشهر) لتوليد الفئران مع المورثات المناسبة ، مما يحد من التوسع في التحليل الوراثي على نطاق واسع في مخ الفأر.
نحن هنا يبرهن على وجود نهج متكامل يستخدم لجنة المساواة العرقية فيروسي ، وأعرب لدراسة هذه الأليلات floxed بسرعة وبشكل منهجي في تطور الدماغ بعد الولادة. عن طريق حقن الغدة المؤتلف المرتبطة الفيروسات (rAAVs) 7،8 الترميز لجنة المساواة العرقية في الدماغ حديثي الولادة ، ونحن قادرون على حذف هذا الجين من الاهتمام في مناطق مختلفة من الدماغ. من خلال التحكم في عيار الفيروسية وcoexpressing علامة بروتين فلوري ، في وقت واحد يمكن أن نحقق الفسيفساء تعطيل الجينات ووضع العلامات العصبية متفرق. هذا الأسلوب يتجاوز متطلبات التنمية في العديد من الجينات في وقت مبكر ، ويسمح لنا لدراسة الخلايا وظيفتها الحكم الذاتي في العديد من العمليات الحرجة في نمو المخ بعد الولادة ، بما في ذلك النمو محواري والجذعية ، والمتفرعة ، والتبليط ، وكذلك تشكيل المشبك والصقل. وقد استخدمت هذه الطريقة بنجاح في المختبر منطقتنا (نتائج غير منشورة) وغيرهم 8،9 ، ويمكن أن تمتد إلى غيرها من الفيروسات ، مثل الفيروسة البطيئة 9 ، فضلا عن التعبير عن shRNA أو البروتينات النشطة المهيمن 10. علاوة على ذلك ، من خلال الجمع بين هذه التقنية مع الكهربية وكذلك في الآونة الأخيرة نموا أدوات التصوير الضوئي 11 ، هذا الأسلوب يقدم استراتيجية جديدة لدراسة كيفية تأثير العصبية الوراثية مسارات التنمية الدوائر وظيفة في الفئران والجرذان.
Protocol
Discussion
والولدان طريقة الحقن الفيروسية المعروضة هنا يوفر وسيلة بسيطة وسريعة لتوليد الفسيفساء في الجسم الحي لدراسة تطور الدماغ بعد الولادة. الأسلوب يستفيد من الأليلات floxed المتوفرة حاليا فضلا عن تلك التي تبذل من خلال الجينات إنتاجية عالية استهداف المشروع 6. بالمقا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا العمل عن طريق منحة من المعاهد القومية للصحة RO1 (NINDS).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| rAAV8-Cre, -GFP, -DsRed, | Vector Biolabs | #7060, #7061, custom order | http://www.vectorbiolabs.com |
| Harvard Pump 11 Plus | Harvard Apparatus | #702208 | (No foot pedal port) |
| Retinal Pigment Epithelium Injection Kit | World Precision Instruments | RPE-KIT | Contains connective tubing, injection needles (36G), and needle holder |
| NanoFil Syringe, 100μl | World Precision Instruments | NANOFIL-100 | Includes reusable loading needle |
| D-PBS | Invitrogen | 14040-117 | |
| GFP antibody | Aves | GFP-1020 | |
| DsRed antibody | Clontech | 632496 | |
| Heating Block | VWR | 97042-610 | |
| ROSA26R mouse | Jackson Laboratory | 003309 |
References
- Geschwind, D. H., Levitt, P. Autism spectrum disorders: developmental disconnection syndromes. Curr Opin Neurobiol. 17, 103-111 (2007).
- Giedd, J. N., Rapoport, J. L. Structural MRI of pediatric brain development: what have we learned and where are we going?. Neuron. 67, 728-734 (2010).
- Chedotal, A., Richards, L. J. Wiring the brain: the biology of neuronal guidance. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).
- Shen, K., Cowan, C. W. Guidance molecules in synapse formation and plasticity. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).
- Chen, S. Y., Cheng, H. J. Functions of axon guidance molecules in synapse formation. Curr Opin Neurobiol. 19, 471-478 (2009).
- Guan, C., Ye, C., Yang, X., Gao, J. A review of current large-scale mouse knockout efforts. Genesis. 48, 73-85 (2010).
- Tenenbaum, L. Recombinant AAV-mediated gene delivery to the central nervous system. J Gene Med. 6, 212-222 (2004).
- Broekman, M. L., Comer, L. A., Hyman, B. T., Sena-Esteves, M. Adeno-associated virus vectors serotyped with AAV8 capsid are more efficient than AAV-1 or -2 serotypes for widespread gene delivery to the neonatal mouse brain. Neuroscience. 138, 501-510 (2006).
- Pilpel, N., Landeck, N., Klugmann, M., Seeburg, P. H., Schwarz, M. K. Rapid reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain. J Neurosci Methods. 182, 55-63 (2009).
- Szulc, J., Aebischer, P. Conditional gene expression and knockdown using lentivirus vectors encoding shRNA. Methods Mol Biol. 434, 291-309 (2008).
- Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21, 70-701 (1999).
- Madisen, L. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13, 133-1340 (2010).
- Tong, C., Li, P., Wu, N. L., Yan, Y., Ying, Q. L. Production of p53 gene knockout rats by homologous recombination in embryonic stem cells. Nature. 467, 211-213 (2010).
