Summary
القشرة معزولة جزئيا ("تقوض") هو نموذج حيواني كفاءة epileptogenesis ما بعد الصدمة. نحن هنا لشرح كيفية جعل جهاز رواية الجراحية واستخدامها لجعل الآفات أكثر دقة ومتسقة لتوليد هذا الطراز.
Abstract
القشرة معزولة جزئيا ("تقوض") هو نموذج حيواني من epileptogenesis ما بعد الصدمة. الإجراء الجراحي يشمل عدة قطاعات من خلال القشرة الحسية وتحتها المادة البيضاء (تقوض) بحيث يتم معزولة الى حد كبير منطقة محددة من القشرة الدماغية من القشرة والمناطق المجاورة تحت القشرية 1-3 بعد زمن من اثنين أو أكثر من أسابيع بعد الجراحة ، يمكن تسجيل التصريف صرعي في شرائح من الدماغ القوارض 1 ، ويمكن ملاحظة السلوك أو مضبوطات الكهربائية في الجسم الحي من الأنواع الأخرى مثل القط والقرد 4-6. هذا النموذج هو الحيوان راسخة فعالة لتوليد ويحاكي العديد من الخصائص المهمة للإصابات في الدماغ. ومع ذلك ، فإنه يمثل تحديا تقنيا محاولة لجعل الآفات القشرية دقيقة في الدماغ القوارض الصغيرة ذات اليد الحرة. استنادا للإجراءات المتبعة في البداية في مختبر الدكتور ديفيد الأمير في جامعة ستانفورد 1 ، وهنا نقدم تقنية محسنة لإجراء عملية جراحية لإعداد هذا النموذج في الفئران والجرذان. نحن لشرح كيفية جعل جهاز جراحية بسيطة واستخدامه للحصول على سيطرة أفضل على عمق القطع وزاوية لتوليد نتائج أكثر دقة ومتسقة. الجهاز سهل لجعل ، وإجراءات سريعة للتعلم. هذا الجيل من نموذج حيواني يتيح نظام فعال للدراسة في آليات epileptogenesis ما بعد الصدمة.
Protocol
1. صنع جهاز بسيط لتقويض عملية جراحية
- الجهاز تقويض أنشأنا يتكون من ثلاثة أجزاء (الشكل 1) : (1) لوحة دعم مصنوع من الفولاذ المقاوم للصدأ أو البلاستيك الذي يسمح المرفق من أنبوب توجيه وإبرة ، ويجلس في إطار الجمجمة أثناء الجراحة ، (2) أنبوب التوجيهية التي يحمل الإبرة في الموقف ، وتناوب على تصاريح الإبرة ، و (3) إبرة أن عازمة على 90 درجة مم 3 ~ من طرف ، والمنقولة عن طريق التناوب والإدراج.
- قطع قطعة من 1-1،5 ملم ، 7 ~ 10 × 30 مم الفولاذ المقاوم للصدأ أو البلاستيك الشفاف مستطيلة (1) لجعل لوحة الداعمة. إعداد 1.5 بوصة عيار 22 دينار بحريني (شركة ، # 305156) و1.5 بوصة عيار 25 دينار بحريني (شركة ، # 305127) إبرة المحقنة. لجعل أنبوب التوجيهية ، وقطع من البلاستيك ونهاية الحافة السفلى إبرة إبرة حقنة عيار 22 بحيث طوله الإجمالي حوالي 31-32 ملم (2). الرمال نهاية المعادن لجعلها مسطحة وناعمة. وينبغي أن طول النهائي لهذا الانبوب يتم توجيه حوالي 5-6 ملم أقصر من إبرة حقنة من عيار 25.
- استخدام الغراء cyanoacrylate لإصلاح أنبوب التوجيهية على لوحة دعم ، والتأكد من أن الإبرة عمودية على حافة معدنية.
- إدراج إبرة حقنة من عيار 25 في أنبوب التوجيهية ، والانحناء الإبرة 90 درجة في 2،5-3 ملم من طرف (الشكل 1).
- ضبط مجموعة العمودي للنقل بواسطة إبرة الإلتصاق أنبوب بلاستيكي صغير يصل إلى نهاية من الإبرة (الشكل 1 ، والتوقف عن إبرة). مجموعة النهائية من الإبرة تتحرك يحدد مدى عمق يمكن إدراجها الإبرة في القشرة ، وينبغي 1،6-1،8 مم لP21 الفئران و1،3-1،5 مم لP21 الفئران. طول هذا بحاجة إلى تعديل لمختلف الأنواع والأعمار من الحيوانات.
- إرفاق الأسلاك النحاسية الصغيرة أو قطعة صغيرة من الشريط إلى نهاية العلوي من الإبرة في نفس اتجاه الطرف عازمة (Fig.1 مؤشر الإبرة). السلك أو الشريط يدل على تحول في زاوية إبرة أثناء الجراحة تقوض (الشكل 1).
2. إعداد الحيوان
- جميع الأدوات الجراحية يلزم تعقيمها ، معقم للتعقيم الزجاج حبة ، أو تطهيرها مع الايثانول 70 ٪.
- نستخدم سبراغ / داولي الفئران بعد الولادة في سن 20 حتي 22 يوما (P20 - 22) أو CD1 فئران في العمر نفسه. ويمكن استخدام سلالات مختلفة من الفئران او الجرذان لمشاريع محددة.
- تخدير الفأر مع حقنة IP الكيتامين 80 ملغ / كغ وزيلازين 8 ملغم / كغم. العملية الجراحية يبدأ بعد هذا الحيوان لا يستجيب لقرصة الذيل. أثناء الجراحة ، وإذا لزم الأمر ، يمكن لجرعة منشطة من ثلث إعطاء الجرعة الأصلي للكوكتيل مخدر لاستعادة حالة التخدير الأصلي.
- قص الشعر على فروة الرأس من الحيوان مع الانتهازي الشعر الكهربائية. تنطبق على كمية صغيرة من مرهم للعين على أعين الحيوانات للحماية من الجفاف أثناء التخدير. تطهير فروة الرأس باستخدام 10 ٪ محلول البوفيدون اليودي ، تليها الايثانول 70 ٪.
- جبل الحيوان على جهاز التجسيمي لإبقاء الرأس في وضع ثابت مستقر. طوال الجراحة ، وعلينا أن نحافظ على الحيوان على وسادة تدفئة لمنع انخفاض حرارة الجسم.
- جعل خط الوسط الأمامي الخلفي شق في فروة الرأس باستخدام مشرط ، وتمتد من لامدا الى ما بين العينين. استخدام المرقأة لسحب الجلد جانبا وفضح الجمجمة اليسار بما فيه الكفاية.
- اجراء خفض مستطيلة على الجمجمة الأيسر ، واستخدم مشرط لكشط غشاء العظم. وهذه الخطوة تقليل النزف ، وتسهيل عمليات الحفر في الجمجمة.
3. مما يضعف
- إضافة كمية صغيرة من المياه المالحة عقيمة على الجمجمة إلى منطقة مكشوفة ، ومن ثم استخدام عدة Q - نصائح لتنظيف الدم والجفاف في المنطقة.
- تحت المجهر الجراحي ، وبدء الحفر في أخدود مستطيل (~ 5 × 7 ملم في الفئران ، و 4 × 5 ملم في الفئران) في وسط الجمجمة اليسرى (تقريبا فوق القشرة الحسية اليسرى). تطبيق قطرة من المياه المالحة على الجمجمة يسهل الحفر وتبدد الحرارة. بعد ما يقرب من 2 / 3 عمق حفر العظام ، وإزالة الملوحة الزائدة وتنظيف المنطقة الحفر مع Q - تلميح. ببطء وبعناية حفر أعمق حتى قطعة من العظم هو مركز المنقولة على لمسة رقيقة ملقط.
- إزالة بعناية قطعة من العظم المركزية عن طريق إدراج غيض من حاد ملقط على حافة العظم ورفع ببطء ملقط لفضح نصف الكرة المخية الأيسر.
- تحت المجهر الجراحي ، وعقد الجهاز تقوض ، وتوجيه الإبرة في اتجاه عمودي مجاور للسهمي والداعمة لوحة خط الوسط ، إمالة الجهاز caudally قليلا وذلك للحفاظ على التصور من طرف الإبرة والمنطقة المستهدفة القشرية. الهدف غيض من الإبرة إلى منطقة 1-2 ملم الجانبي لالدرز السهمي ومتفوقة ، في منتصف النافذة في الجمجمة ، وتجنب الاختراق المباشر من السفن الكبيرة.
- ادخال الإبرة في اتجاه أفقي خلال الجافية وتحت الحنون ، وذلك لتجنيب الأوعية الدموية. الجلوس في الجزء السفلي من الجهاز تقوضعلى كل من حواف الجمجمة نافذة بحيث يتم وضع إبرة العادي إلى السطح القشري (الشكل 1). وسوف يستريح الجهاز على حواف الجمجمة كلا من نافذة باليد تقلل إلى حد كبير أو القضاء على المصافحة أثناء الإجراء التالي. ترفع الإبرة إلى أسفل الحنون ، ومن ثم انخفاض ببطء لإنشاء قطع بطريق القشرة الإبرة حتى لا تذهب أعمق. ~ تدوير 135 درجة بعيدا عن خط الوسط لخلق المسألة نصف دائرة بيضاء / طبقة عميقة تقوض السادس. ثم رفع الإبرة مرة أخرى إلى أسفل الحنون. إمالة الجهاز إلى الخلف وسحب الإبرة.
- اختياريا ، يمكن للمرء أن تكرار الإجراء أعلاه (الخطوة 2.5) ولكن من دون تحول الإبرة وذلك لتهيئة قطع إضافية بطريق القشرة عند الحواف الجانبية من النافذة. وهذا يخلق عزلة أكثر اكتمالا القشرية.
- ضع قطعة من البلاستيك فيلم (6 × 6 ملم) على نافذة الجمجمة للحماية ، وخياطة وفروة الرأس. وضع الحيوان على وسادة ساخنة حتى شفي تماما من التخدير.
4. ممثل النتائج :
يمكن تحضير شرائح القشرية الاكليلية لتأكيد نجاح العملية الجراحية تقوض. في إعداد شرائح> 2 أسابيع بعد الجراحة ، والتخفيضات بطريق القشرة وتقويض تتجلى تحت الهدف منخفضة الطاقة من مجهر (الشكل 2). القشرة عادة معزولة جزئيا يصبح أرق قليلا ، ويمكن أن يتم الكشف عن نشاط صرعي في غالبية شرائح القشرية مع تسجيل حقل المحتملة (الشكل 3).
في تشكيل ، وعلى النقيض من الثقوب الكبيرة في المادة البيضاء أو في الطبقات العميقة القشرية ، وسوف دراماتيكية ترقق القشرة lesioned ، أو قطع المخطئين يجري فوق أو تحت المادة البيضاء في الدماغ تجعل غير صالحة للاستعمال لمزيد من التجارب.
الشكل 1. يتم لصقها وتطبيق هيكل جهاز تقوض. أنبوب التوجيهية (2) على لوحة دعم (1) التي هي مصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ أو البلاستيك الشفاف. يتم إدخال إبرة حقنة (3) من خلال أنبوب عازمة على توجيه ومم 3 ~ إلى الحافة. إبرة وقف مصنوعة من أنابيب بلاستيكية يتم لصقها على الجزء العلوي من نهاية الإبرة بحيث يقتصر على مجموعة العمودي تتحرك من الإبرة إلى 1.2 مم ~ ~ و 1.5 مم لاستخدامها في P21 الفئران والجرذان على التوالي. وتثبت قطعة من الأسلاك النحاسية الصغيرة تحت مقبض كما إبرة مؤشر لاتجاه الإبرة عازمة. علما بأن إمالة الجهاز وعلى اتصال مع كل من حافة النافذة الجمجمة حتى يمكن إجراء خفض مواز لسطح حنوني.
الشكل 2. صورة ممثل شريحة تقوض. ألف صورة نيون للشريحة التي تم إعدادها بعد اسبوعين من آفة فأر في تقويض P48. وقد وصفت الجرح القطع الفلورسنت الجاذبة صباغة. السهام البيضاء على اليمين تشير إلى خفض بطريق القشرة ، وتشير إلى أن تنتقص من الأسهم في القاع التي مرت على الرغم من أن الحدود بين الرابع طبقة والمادة البيضاء.
الشكل 3. عرض تسجيل الميدانية الممكنة من شريحة تقوض. الميدانية تسجيل المحتملة من شريحة الدماغ تقويض نشاط صرعي ، مما يشير إلى فرط الاستثارية من النسيج القشرية الجرحى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
النموذج هو تقويض نظام فعال للغاية لدراسة epileptogenesis ما بعد الصدمة. عملية جراحية نموذجية يستغرق حوالي 20-30 دقيقة فقط حتى النهاية ، وأثار أو يمكن تسجيل نشاط تلقائي صرعي في شرائح من معظم الحيوانات بعد اسبوعين من الجراحة 1-2. الأهم من ذلك ، وهذا نموذج يحاكي جوانب التغييرات التالية إصابات في الدماغ ، مثل التهاب النزيف ، axotomy ، وذمة وفاة الخلايا العصبية 7. لا يقتصر الأمر على نشاط صرعي لوحظ في القوارض والحيوانات الأخرى ، ولكن أيضا قد تم توثيق نوبات الصرع لدى البشر الذين يعانون من الآفات القشرية مقارنة 8. وقد أحرز تقدم كبير في توضيح الآليات الكامنة في السنوات الأخيرة. وقد سجلت عفوية وأثار النشبات التصريف صرعي في شرائح الدماغ> 2 بعد أسابيع من الآفة ، وعثر على هذه الأنشطة تنشأ في الطبقة القشرية الفئران الخامس 1. كما تم إعادة تنظيم الدائرة من الأدلة ، وفقدان interneurons GABAergic والسلوك الفاضح ، ويزيد في استثارة غشاء الخلايا العصبية ، والزيادات في اقتران متشابك مثير تظاهر ، ولا سيما في الطبقة القشرية الخامس 2،9-13.
قدم هنا ونحن أداة لصنع رواية الآفات تقوض. عند واحد ينفذ عملية جراحية تقويض مع يد ، واليد تهتز كثيرا ما يسبب صعوبة في اتخاذ الآفات القشرية مستقرة ودقيقة. على الرغم من الممارسة والخبرة قد تؤدي إلى تحسين نوعية الجراحة ، والتباين الكبير في عمق ونوعية الآفات موجودة. الجهاز لدينا هنا هو مفيد وعرض في ثلاثة جوانب. أولا ، يستريح على حواف النافذة في الجمجمة ، والجهاز يزيل إلى حد كبير مشكلة اهتزاز اليد أثناء الجراحة ، مما يجعل من الممكن اجراء خفض على نحو سلس من خلال أنسجة الدماغ الحساسة. ثانيا ، يمكن للعمق إبرة ودرجة الاستدارة يمكن السيطرة عليها بعناية ، مما يجعل من الممكن لخفض مزيد من الدقة وباستمرار في المادة البيضاء تحت طبقة السادس. الثالثة ، هي منحنية على سطح الكرة الأرضية القشرية : مع الإنسي كانت أعلى من الجانب الوحشي (الشكل 1) ، والتي يمكن أن تتسبب في عداد المفقودين في هذه المسألة استهدفت الأبيض إذا لم يتم تعديل زاوية الإبرة وفقا لذلك. يستريح من قبل الجهاز على نافذة في الجمجمة ، إمالة الإبرة أفقيا ، ويتم تعديلها تلقائيا زاوية القطع بحيث تناوب الإبرة دائما موازية لسطح القشرة وآفة دقيقة يتم الحصول على (الشكل 2). مشكلة واحدة مع إمكانية استخدام هذا الجهاز هو أنه قد تتداخل مع رؤية مباشرة من الإبرة تحت المجهر. يمكن حل هذه المشكلة عن طريق الجهاز تميل قليلا نحو اتجاه الذيلية عند اختراق حنوني والقشرة. حالما يتم خفض الإبرة إلى المادة البيضاء ، الجهاز يحتاج إلى تعديل لتصبح عمودية على السطح القشري ، واستراح في الجمجمة. عند هذه النقطة ، وتبحث في مؤشر الإبرة كافية لرصد دوران الإبرة. باختصار ، مع هذه العديد من المزايا النسبية وسهولة البناء ، وسوف تقوض نموذج تصبح متاحة ومفيدة لدراسة epileptogenesis ما بعد الصدمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة / NINDS NS 4R00 057940 منحة ، ومنحة SCBI 200-12 من الحبل الشوكي وتمويل أبحاث الدماغ من الإصابات من وزارة الخارجية انديانا الصحة.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Foredom micromotor kit | equipment | Foredom | K.1070 | |
| 1.5 inch 22-gauge syringe needle | material | BD Biosciences | 305156 | |
| 1.5 inch 25-gauge syringe needle | material | BD Biosciences | 305127 | |
| Cyanoacrylate glue | material | Ted Pella, Inc. | 14450 |
References
- Hoffman, S. N., Salin, P. A., Prince, D. A.
- Topolnik, L., Steriade, M., Timofeev, I. Hyperexcitability of intact neurons underlies acute development of trauma-related electrographic seizures in cats in vivo. Eur J Neurosci. 18, 486-496 (2003).
- Graber, K., Prince, D. A. Models of Seizures and Epilepsy. , Elsevier. 477-493 (2005).
- Nita, D. A., Cisse, Y., Timofeev, I., Steriade, M. Increased propensity to seizures after chronic cortical deafferentation in vivo. J Neurophysiol. 95, 902-913 (2006).
- Sharpless, S. K., Halpern, L. M. The electrical excitability of chronically isolated cortex studied by means of permanently implanted electrodes. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 14, 244-255 (1962).
- Echlin, F. A., Battista, A. Epileptiform Seizures from Chronic Isolated Cortex. Arch Neurol. 9, 154-170 (1963).
- Prince, D. A.
- Marin-Padilla, M. Developmental neuropathology and impact of perinatal brain damage. II: white matter lesions of the neocortex. J Neuropathol Exp Neurol. 56, 219-235 (1997).
- Jin, X., Prince, D. A., Huguenard, J. R. Enhanced excitatory synaptic connectivity in layer v pyramidal neurons of chronically injured epileptogenic neocortex in rats. J Neurosci. 26, 4891-4900 (2006).
- Li, H., Prince, D. A. Synaptic activity in chronically injured, epileptogenic sensory-motor neocortex. J Neurophysiol. 88, 2-12 (2002).
- Salin, P., Tseng, G. F., Hoffman, S., Parada, I., Prince, D. A. Axonal sprouting in layer V pyramidal neurons of chronically injured cerebral cortex. J Neurosci. 15, 8234-8245 (1995).
- Avramescu, S., Nita, D. A., Timofeev, I. Neocortical post-traumatic epileptogenesis is associated with loss of GABAergic neurons. J Neurotrauma. 26, 799-812 (2009).
- Avramescu, S., Timofeev, I. Synaptic strength modulation after cortical trauma: a role in epileptogenesis. J Neurosci. 28, 6760-6772 (2008).
