Summary
一个组织准备用于可视化和生活微循环的实验操作。在麻醉雄性小鼠，薄，高度血管提睾肌准备活体显微镜来研究，包括动脉，毛细血管和静脉的微血管网络。本制剂对大鼠和仓鼠很容易适应。
Abstract
整个身体，保持动态平衡，需要去除代谢副产品氧气和营养物质随之而来的不断的供应。实现这种平衡是通过血液微循环的运动，其中包括在整个所有组织和器官的血管供应的最小的分支。从动脉的动脉分支，形成网络，控制流入毛细血管的实质细胞密切相关的多种含氧血液的分布和幅度。毛细管提供了组织细胞的血液供应之间的扩散交换的表面积大。静脉收集毛细管污水和收敛，因为他们返回无氧对心脏的血液。实时观察这些过程，需要一个可视化和操纵的生活微循环的实验方法。
首次使用的组织学和电子显微镜后验尸1,2研究炎症模型大鼠提睾肌。第一次在体内的暴露完整的大鼠提睾肌报告调查反射光的使用血管活性药物的微血管反应。但曲率的肌肉和重点照明的缺乏限制了该制剂的实用性。重大突破，需要开放的肌肉，脱离睾丸和蔓延，为平板透径向下一个复合式显微镜4。虽然证明是一个宝贵的准备，以研究大鼠和仓鼠 6微循环的生理，提睾肌在小鼠7已被证明特别有用解剖参与调节8-11微血管功能和实时成像间的细胞通路信号12。
提睾肌是来自内部的倾斜和横向abdominus肌肉，睾丸下降通过腹股沟管13。它提供支持（希腊语：睾=吊杆）和维持睾丸的温度。此处所述，提睾肌准备作为一个优秀的光学分辨率平板薄。用鼠标保持在一个稳定的体温和麻醉平面，手术准备摆脱周围组织和睾丸的肌肉，蔓延到透明的硅橡胶橡胶底座，与昆虫引脚的边缘，而灌溉与生理盐溶液不断。本协议利用转基因小鼠动脉内皮细胞中表达GCaMP2。 GCaMP2是一个基因编码的荧光钙指标分子 12 。宽视场成像和加强电荷耦合器件摄像机， 使体内的钙信号在动脉内皮细胞的研究。
Protocol
1。鼠标板，肌肉底座，身体的楔形和灌流解决方案
- 鼠板：一个长方形的透明有机玻璃板（6“宽x 8”长X 3 / 16“厚）适合在显微镜的阶段。”鼠板“是麻醉鼠标固定在手术准备提睾肌。
- 肌肉基座：一个透明的硅胶橡胶底座Sylgard 184，这是根据制造商° S指示的混合的准备。一个方便的模具是15毫米厚x 50毫米直径的直径一次性培养皿。 Sylgard块切割成所需的形状，用刀片（见图1c）。。一个清晰的防水硅酮胶薄薄的一层是用于安全Sylgard块鼠板。有用的提示：在一个小时的真空室脱气后浇入培养皿Sylgard，消除气泡和提高清晰度。以下脱气，固化为Sylgard时间缩短为50 ° C数小时的菜放置在实验室烘箱。
- 楔形车身和加热平台：一个楔子（2“× 4”× 15 °），下面的鼠标和定位对基座倾斜身体前倾，有利于延长从它的起源底座，提睾肌。结合在表面上的铝制平台，提供导热。该平台是加热电阻连接到直流电源（图1A）。校正平台温度〜40℃食管温度保持在〜37 ° C。否则，从一盏灯的辐射热。
- 销。为了确保提睾肌的底座上，别针准备从0.15毫米的昆虫引脚已进入一个“L”形弯曲。
- 生理盐溶液（PSS）。准备工作正在灌流（灌溉）准备在超纯水（18.2MΩ）H 2 O的碳酸氢盐缓冲PSS的不断股票的解决方案是准备在20X最终工作浓度和消毒，通过一个0.2微米的过滤器。好几个星期，当股票的解决方案仍然保存在4 ° C。准备分开的碳酸氢盐和盐混合与稀释实验的一天，他们阻止的碳酸氢钙沉淀。该公司股价由盐溶液（mmol / L的）：2638氯化钠，氯化钾94，40 MgS0 4，23.4氯化钙 。股票碳酸氢钠碳酸氢钠3 360。在当天的实验，都带来了各自的解决方案容量瓶终体积（通常为2升）对于一个给定的实验〜37 ° C水浴中放置非平衡的PSS与5％的CO 2 / 95〜15分钟使用气体分散％N为2调节pH值至7.4〜和防止沉淀。用5％的CO 2 / 95％，在整个实验二氮的PSS是不断冒泡。最后的工作液成分（mmol / L的）：132氯化钠，4.7氯化钾，1.2 MgS0 4，2，2氯化钙18 碳酸氢钠 3 。
2。麻醉和手术的准备
- 从体制上的动物护理和使用委员会的批准后，至少12周龄雄性小鼠。鼠标与戊巴比妥钠（60毫克/公斤）经腹腔（IP）注射麻醉。限制管确保鼠标在最初的注射证明是有用的。整个手术过程中和实验协议，麻醉维持补充剂（10-20％初始注射，IP）（每次30-60分钟;表示戒断反应到脚趾或尾巴捏）。提示：稀释苯巴比妥10毫克/毫升无菌生理盐水，注射前减少了过量的可能性。
- 麻醉会影响体温调节，因此鼠标必须保持第一次注射后立即热烈。鼠标放置在一个金属载体上一个加热板的顶部（通风铝篮）（校准〜37 ° C）的效果很好。另外，热灯可用于照顾在一个适当的距离从鼠标位置。鼠标应监测每隔5-10分钟，直到适当的麻醉水平达到（缺乏撤退到脚趾或尾巴捏）。 15-20分钟后，可能需要的补充剂量。这是最好的，要耐心谨慎行事，以避免过量，特别是与肥胖或年龄的动物，。
- 从下腹部，腰部，阴囊和腿通过仔细剃各自区域的头发被删除。应特别注意采取阴囊和睾丸，否则会损害提睾肌，避免创伤。将松散的头发，用一个新的酒精棉签。
- 如果膀胱满了，会觉得像小葡萄经腹壁。排空膀胱，使用温和的压力，以防止鼠标，从小便在实验过程中睾准备。一个Kimwipe效果海绵，以收集T的尿液。
- 鼠标在它的后面的位置，就趴在楔形，与它的腿跨越底座。每只脚绑一个丝线缝合（4-0或5-0）提供了一个系绳确保其对底座的裆鼠标。放置在胸前松散地固定楔形的磁带，保持整体车身的位置。通过使用显微切割剪刀和直角钳体视显微镜观察时，手术程序进行。
3。开放提睾肌的手术准备
- 阴囊的顶点（左边或右边）通过一个引脚放置和固定在底座放置在皮肤上的紧张局势。 PSS（34-35℃）灌流手术领域发起和维持整个清扫，保持暴露组织的温暖和潮湿。灯芯（从Kimwipe）的一端，旁边的阴囊和其他真空线定位，消除了污水PSS的。一个坚持有机玻璃板，并完全包围楔形底座作为“护城河”，以收集任何不送气的PSS的服务，作为一种有效的预防措施防止泄漏到显微镜的PSS的硅酮密封胶珠。
- 切口是沿阴囊腹面。如果睾丸一直缩回进入腹腔提睾肌，小腹温柔的压力指示到国资委的睾丸。提睾肌的表面覆睾丸应确定在这个时候。小心取出摆脱提睾肌周围组织之间的阴囊皮肤和提睾肌的结缔组织。
- 阴囊皮肤轻轻地缩回背后底座近端边缘和用大头针两侧固定。提睾肌表面的外表面，然后清除结缔组织。连续灌流期间清扫水合物的结缔组织，促进知名度和清除。
- 通过提睾肌的顶点针是用来放置纵向张力下。一纵形切口，通过采取非常谨慎，以尽量减少血管供应中断的肌肉腹面的。这个组织损伤14准备外围附近的血流动力学改变。因此，最大限度地减少这些影响是用于数据的收集，编制中心附近的血管成像和生理研究。
- 提睾肌是连接由一个薄的韧带下方睾丸附睾。一个侧面反映睾丸暴露此韧带，这是从附睾仔细分离。近提睾肌的顶点是小动脉和静脉，将它连接到附睾。阻断钳之间的这些船只，他们除了拉最大限度地减少出血。睾丸，附睾，睾丸动脉和静脉结扎近端（4-0或5-0丝线缝合），切断，连同相关的腹股沟脂肪垫丢弃（睾丸）。此外，睾丸可以轻轻推回腹腔，并用一块棉或Kimwipe保留。睾丸供应推入腹腔时，睾丸组织，以避免可能出现的创伤。我们没有发现明显的差异，在提睾肌微循环的准备的质量（见3.8节），无论是使用过程7,15。
- 提睾肌的外表面被清除剩余的结缔组织，然后基座表面呈放射状蔓延。边缘固定在5-6地方创建一个完整的微循环横纹肌平板引脚（参见1.4节）。
- 完成准备转移到一个活体显微镜的阶段，连续灌流（3-5毫升/分钟，34℃）和30分钟的平衡。
- 提睾编制的完整性，是根据以下几个标准进行评估。自发以最小的手术创伤舒缩音是由动脉和静脉壁白细胞缺乏亮眼流表示。一个负责任的准备，最敏感的指标是提高动脉的灌流液5-10分钟的氧含量收缩。这是平衡与O 2的 21％（与5％O 2的 ;见第1.5节; 5％的CO 2，平衡N 2）。在动脉的白细胞存在，红血细胞通过毛细血管流动的情况下，和/或积累静脉及周围组织的白细胞组织损伤和炎症的迹象。
4。提睾肌微循环的活体成像
- 活体成像后，奥林巴斯MVX10立体声变焦平台基于一个自定义显微镜。 MVX10镜身安装到MVX10混合的立场与透明（科勒）成像（卤素灯），并配备与外延照明（汞灯）荧光成像。使用EPI -照明，GCaMP2兴奋30分之472纳米三十五分之五百二纳米收集排放。获得的图像通过一个MV PLAPO 2XC镜头（数值孔径= 0.50;奥林巴斯）使用XR/Mega-10加剧的数码相机（斯坦福Photonics公司，SPI）通过派控制软件（SPI），在个人电脑上。有了这个系统，观察视角（FOV）领域可以是多种多样的，从553微米X 442微米至22毫米x 18毫米。
- 活体成像实验完成后，麻醉鼠标安乐死与颈椎脱位过量苯巴比妥。
5。代表性的成果
图1。鼠板鼠标提睾准备活体成像。一）与铝的平台楔形车身（黄色塑料绝缘），从底部看待。固定平台底部的加热电阻器进行热。二）加热平台的基础上的塑料楔。三）身体楔放在一个有机玻璃板手术，随后转移到的活体显微镜阶段。 Sylgard基座是用红色箭头表示。一个防水硅珠包围整个准备包含任何解决方案，在活体的过程中可能会泄漏，防止它滴在显微镜上。
图2：自定义宽视场成像MacroZoom显微镜。一）MVX10显微镜体XR/Mega-10 ICCD相机（奥林巴斯）（斯坦福大学光电子），安装在三目端口。 b）关闭视图显微镜体。 （一）变焦控制（0.63〜6.3X）;（二）滤光轮（三）图像倍频25X光学放大（NA = 0.50）。三）明（科勒）照明（冷凝器NA = 0.55，工作距离= 27毫米）的显微镜台下聚光器。
图3。完成鼠标提睾准备。在热烈的塑料涂层的铝平台（黄色）仰卧位麻醉鼠标。用胶带固定身体位置。提睾肌是呈放射状蔓延的透明硅橡胶的橡胶底座边缘的寄托。灌流的解决方案是在近端介绍，通过一个塑料滴头（白色箭头）。真空线（白箭头），删除解决方案通过Kimwipe灯芯。两个微量显示他们的秘诀在组织定位。参比电极（银线）是安全的提睾肌的下缘。
图4。龙虎斗动脉内皮细胞中的表达GCaMP2的网络可视化的放大倍率范围。一）荧光灯和B）明形象的3.2倍的光学放大倍率为总放大倍率= 42X在视频监视器上。 [视场（FOV）= 4375 x 3470微米]。比例尺= 500微米。在此放大倍率工作，有利于微量放置在所需位置。三）荧光和D）明影像总放大倍率6.4X光学放大倍率= 83X（视场= 2200 × 1759微米）。比例尺= 200微米。 E）荧光灯和F）明影像总放大倍率12.6X光学倍率= 165X（FOV = 1100 × 885微米）。比例尺= 100微米。 g）与图像倍频，光学倍率= 25.2X。比例尺= 50微米。
Discussion
在这里，我们描述了在体内的微循环观察鼠标打开提睾肌准备。此过程是仿照“打开”睾准备首次在大鼠4。在不到1个小时就可以完成整个手术过程与实践。作为该制剂的多功能性使各种实验操作，很容易适应仓鼠和大鼠，实现了各种实验模型，要以类似的方式研究。准备工作是有限的雄性动物和测量应作出对中心的组织，避免损坏附近的肌肉 14边缘地区。它也应该认识到，虽然压力和流量分布改变时，提睾肌的互连船只被削减 16，微血管保持响应和适合再生的数据收集。可视化的提睾肌微循环的主要限制因素是结缔组织的建设，特别是在老鼠，但在仓鼠作为动物的成熟和大小增加。此外，由于动物发胖，它变得更加困难，因为苯巴比妥是亲脂性，可在脂肪组织中吸收，以控制麻醉。最好的办法是通过耐心，同时确保动物°的体温保持在〜37 ° C，而暴露组织与PSS的不断灌溉。
Disclosures
所有的程序和协议，涉及动物，美国密苏里大学动物护理和使用委员会的批准，符合美国国立卫生研究院实验动物的照顾和使用指南进行。
制作这个视频文章已经由斯坦福大学光电子发起。
Acknowledgments
作者实验室的研究是由美国国立卫生赠款R37 - HL041026，R01 - HL086483和R01 - HL056786（SSS）和F32 - HL097463和T32 - AR048523由美国公共卫生服务（PB）研究院的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S642-212 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233 | |
| Nembutal Sodium Solution | Lundbeck Inc | NDC 67386-501-55 | Also referred to as sodium pentobarbital |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | Alternate: adjustable 12V DC power supply |
| Series 20 platform heater kit RH-2 | Warner Instruments | 64-0274 | Requires custom-built aluminum plate |
| Mega-10 Camera | Stanford Photonics Inc | XR/Mega-10 | |
| MVX10 | Olympus Corporation | ||
| MV PLAPO 2XC lens | Olympus Corporation | ||
| MVX10 hybrid stand | Leeds | LBX-Hybrid | |
| Piper Control Software | Stanford Photonics Inc | Program for Mega-10 camera | |
| Stereo Microscope | Nikon Instruments | SMZ645 | |
| Waterproof Silicone Sealant (Clear) | GE Healthcare | 47970-72643-LW5000 | Other clear silicone sealants also work |
| 60 x 15mm Petri Dish | Fisher Scientific | 08-757-13A | |
| Sylgard | Dow Corning | 184 | |
| Microdissection Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Dumont Forceps | Fine Science Tools | #5/45 | |
| GP Millipore Express PLUS Membrane | EMD Millipore | SCGPT05RE | |
| Minutiens Insect Pins | Austerlitz | M size 0.15 mm | |
| Compact Pet Trimmer | Wahl Clipper Corp. | Model 9966 | Clean after each use |
References
- Majno, G., Palade, G. E. Studies on inflammation. 1. The effect of histamine and serotonin on vascular permeability: an electron microscopic study. J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 571-605 (1961).
- Majno, G., Palade, G. E., Schoefl, G. I. Studies on inflammation. II. The site of action of histamine and serotonin along the vascular tree: a topographic study. J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 607-626 (1961).
- Grant, R. T. Direct Observation of Skeletal Muscle Blood Vessels (Rat Cremaster). J. Physiol. 172, 123-137 (1964).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).
- Bohlen, H. G., Gore, R. W., Hutchins, P. M. Comparison of microvascular pressures in normal and spontaneously hypertensive rats. Microvasc. Res. 13, 125-130 (1977).
- Klitzman, B., Duling, B. R. Microvascular hematocrit and red cell flow in resting and contracting striated muscle. Am. J. Physiol. 237, 481-490 (1979).
- Hungerford, J. E., Sessa, W. C., &, S. egal, S, S. Vasomotor control in arterioles of the mouse cremaster muscle. FASEB J. 14, 197-207 (2000).
- Figueroa, X. F., Paul, D. L., Simon, A. M., Goodenough, D. A., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. Central role of connexin40 in the propagation of electrically activated vasodilation in mouse cremasteric arterioles in vivo. Circ. Res. 92, 793-800 (2003).
- Wolfle, S. E., Schmidt, V. J., Hoepfl, B., Gebert, A., Alcolea, S., Gros, D., de Wit, C. Connexin45 cannot replace the function of connexin40 in conducting endothelium-dependent dilations along arterioles. Circ. Res. 101, 292-1299 (2007).
- Milkau, M., Kohler, R., de Wit, C. Crucial importance of the endothelial K+ channel SK3 and connexin40 in arteriolar dilations during skeletal muscle contraction. FASEB J. 24, 3572-3579 (2010).
- Bagher, P., Duan, D., Segal, S. S. Evidence for impaired neurovascular transmission in a murine model of Duchenne Muscular Dystrophy. J. Appl. Physiol. 110, 601-610 (2011).
- Tallini, Y. N., Brekke, J. F., Shui, B., Doran, R., Hwang, S. M., Nakai, J., Salama, G., Segal, S. S., Kotlikoff, M. I. Propagated endothelial Ca2+ waves and arteriolar dilation in vivo: measurements in Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice. Circ. Res. 101, 1300-1309 (2007).
- Grant, R. T. The effects of denervation on skeletal muscle blood vessels (rat cremaster). J. Anat. 100, 305-316 (1966).
- Proctor, K. G., Busija, D. W. Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle. Am. J. Physiol. 249, H34-H41 (1985).
- Bagher, P., Segal, S. S. Regulation of blood flow in the microcirculation: Role of conducted vasodilation. Acta Physiol. , (2011).
- Hill, M. A., Simpson, B. E., Meininger, G. A. Altered cremaster muscle hemodynamics due to disruption of the deferential feed vessels. Microvasc. Res. 39, 349-363 (1990).
