Summary
En vävnad förberedelse beskrivs för visualisering och experimentell manipulation av levande mikrocirkulation. Hos sövda hanmöss, är tunn, mycket vaskulariserad cremaster muskeln förberedd för intravital mikroskopi för att studera mikrovaskulära nätverk, inklusive arterioler, kapillärer och venoler. Denna beredning är lätt anpassad för råttor och hamstrar.
Abstract
I hela kroppen, kräver upprätthållande av homeostas i ständig tillförsel av syre och näringsämnen samtidigt med avlägsnandet av metaboliska biprodukter. Denna balans uppnås genom rörelse av blod genom mikrocirkulationen, som omfattar de minsta grenarna av den vaskulära utbudet i alla vävnader och organ. Arterioler filial från artärerna att bilda nätverk som styr fördelningen och omfattningen av syresatt blod strömmar in i mängd kapillärer intimt förknippad med parenkymceller. Kapillärer ger en stor yta för diffusion utbyte mellan vävnaden celler och blodtillförsel. Venoler samla kapillär avloppsvatten och konvergera allt eftersom de kommer tillbaka syrefattigt blod till hjärtat. För att observera dessa processer i realtid kräver en experimentell metod för att visualisera och manipulera den levande mikrocirkulation.
Den cremaster muskel hos råttor användes först som modell för att studera inflammation med histologi och elektronmikroskopi efter slakt 1,2. Den första in vivo-rapport av de exponerade intakt råtta cremaster muskel undersöks mikrovaskulära svar på vasoaktiva läkemedel med hjälp av reflekterat ljus 3. Men krökning av muskler och brist på fokus belysning begränsade nyttan av produkten. Det stora genombrottet innebar att öppna muskler, lossa den från testikel och sprida den radiellt som en platt blad för genomlysning under ett sammansatt mikroskop 4. Samtidigt som visat sig vara en värdefull förberedelse för att studera fysiologi mikrocirkulationen i råtta 5 och hamstrar 6 har cremaster muskeln i möss 7 visat sig särskilt användbar i dissekera cellulära som är involverade i regleringen av mikrovaskulära funktionen 8-11 och i realtid avbildning av intercellulära signalering 12.
Den cremaster muskel kommer från interna sneda och tvärgående abdominus muskler som testiklarna sjunka genom inguinal kanalen 13. Det tjänar som stöd (grekiska: cremaster = hängslen) och bibehålla temperaturen i testiklarna. Som beskrivs här, är cremaster muskler utarbetats som en tunn platt blad för enastående optisk upplösning. Med musen hålls på en stabil kroppstemperatur och plan anestesi innebär kirurgisk förberedelse befria muskler från omgivande vävnad och testiklarna, sprida den på transparent piedestal av silastic gummi och säkra kanterna med insekten stift medan bevattning det kontinuerligt med fysiologisk saltlösning . Detta protokoll använder sig av transgena möss som uttrycker GCaMP2 i arteriolär endotelceller. GCaMP2 är en genetiskt kodad fluorescerande kalcium indikator molekyl 12. Widefield bildbehandling och ett intensifierat chipet kameran Aktivera in vivo-studie av kalcium signalering i arteriolär endotelet.
Protocol
1. Mus ombord, muskel piedestal, kropp kil och superfusion lösning
- Mus ombord: En transparent rektangulär plexiglas board (6 "bred X 8" lång x 3 / 16 "tjock) är gjord för att passa på scenen i mikroskop." Musen ombord "är där bedövas musen är säkrad under kirurgiska beredning av den cremaster muskeln.
- Muscle piedestal: En transparent silastic gummi piedestal bereds av Sylgard 184, som blandas enligt tillverkarens ° S instruktioner. En bekväm mögel är en 15-mm tjock x 50 mm diameter diameter disponibla petriskål. Den Sylgard blocket skärs till önskad form med ett rakblad (se figur 1C.). Ett tunt lager av tydliga vattentät silikon lim används för att säkra Sylgard blocket till musen styrelsen. Tips: Efter hälla Sylgard i petriskål, avgasning i en vakuumkammare för en timme bort luftbubblor och ökar tydligheten. Efter avgasning, härdning tid för Sylgard förkortas genom att placera skålen i ett laboratorium ugn vid 50 ° C i flera timmar.
- Body kil och värme plattform: En kil (2 "x 4" x 15 °) placerad under musen och mot sockeln lutar kroppen framåt vilket underlättar utvidgning av cremaster muskeln över sockeln från dess ursprung. Införliva ett aluminium plattform på ytan ger ledande värme. Plattformen värms upp av resistorer anslutna till en DC strömförsörjning (Figur 1A). Kalibrera plattformen temperaturen till ~ 40 ° C håller esofagus temperaturen på ~ 37 ° C. Annars är strålningsvärme från en lykta som används.
- Pins. För att säkra cremaster muskeln på piedestal, är stift beretts av 0,15 mm insekt stift som har böjt till ett "L" form.
- Fysiologisk saltlösning (PSS). Förberedelser pågår superfused (bevattning) kontinuerligt med bikarbonatbuffert PSS upprättats i ultrarent (18,2 Mohm) H 2 O. Stamlösningar är beredda på 20X sista arbetar koncentration och steriliseras genom ett 0,2 ìm filter. Stamlösningar fortsatt god under flera veckor vid förvaring vid 4 ° C. Förbereda salter separat från bikarbonat och blanda dem med utspädning på dagen för experimentet förhindrar utfällning av kalcium bikarbonat. Beståndet saltlösning består av (i mmol / L): 2638 NaCl, 94 KCl, 40 MgS0 4, 23,4 CaCl 2. Beståndet bikarbonat är 360 NaHCO 3. På dagen för ett experiment, är respektive lösningar kommer till en slutlig volym (typiskt 2 L för ett givet experiment) i en mätkolv och placeras i ett vattenbad vid ~ 37 ° C. Utjämnande PSS med 5% CO 2 / 95% N 2 för ~ 15 minuter med gas disperser justerar pH till ~ 7,4 och förhindrar nederbörd. PSS är bubblade kontinuerligt med 5% CO 2 / 95% N 2 under experiment. Den slutliga arbetslösning sammansättning (i mmol / L): 132 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgS0 4, 2 CaCl 2, 18 NaHCO 3.
2. Anestesi och förberedelse för kirurgiskt ingrepp
- Efter godkännande från den institutionella Djurens skötsel och användning kommittén, hanmöss minst 12 veckor gamla användas. Musen är sövda med pentobarbital natrium (60 mg / kg) via intraperitoneal (ip) injektion. Ett besöksförbud röret är lämpligt för för att säkra musen under den första injektionen. Under kirurgiska ingrepp och experimentella protokoll, är anestesin underhålls av kosttillskott (10-20% av initiala injektionen ip) som behövs (varje 30-60 minuter, angiven med tillbakadragande svar på tå eller svans nypa). Tips: späda ut pentobarbital 10 mg / ml i steril koksaltlösning före injektion minskar risken för överdosering.
- Anestesi kompromisser temperaturreglering så att musen måste hållas varm direkt efter den första injektionen. Placera musen i en metall bärare (ventilerade aluminium korg) på toppen av en värmeplatta (kalibrerad till ~ 37 ° C) fungerar bra. Alternativt kan en värmelampa användas för att ta hand för att placera den på lämpligt avstånd från musen. Musen ska kontrolleras varje 5-10 minuter tills en lämplig nivå av anestesi uppnås (brist på tillbakadragande till tå eller svans nypa). En kompletterande dos kan krävas efter 15-20 minuter. Det är bäst att ha tålamod och fortsätt med försiktighet för att undvika överdosering, speciellt med feta eller äldre djur.
- Hår tas bort från nedre delen av buken, nedre delen av ryggen, pungen och benen genom att försiktigt raka respektive regioner. Särskild uppmärksamhet bör vidtas för att undvika trauma mot pungen och testiklarna, som annars kommer att skada cremaster muskeln. Ta bort lösa hår med en ny alkoholservett.
- Om blåsan är full kommer det att kännas som en liten druva genom bukväggen. Tömma blåsan med hjälp av ett lätt tryck för att hindra musen från urinera på cremaster förberedelser under experiment. En Kimwipe är en effekt svamp för att kollektivtT urinen.
- Placera musen på rygg, liggande på kilen med sina ben grensle på piedestal. En siden sutur (4-0 eller 5-0) knutet till varje fot ger ett tjuder för att säkra musen med skrevet mot piedestal. En bit tejp placeras löst över bröstet och säkras kilen håller hela kroppens position. Kirurgiska ingrepp utförs medan du tittar genom ett stereomikroskop med microdissection sax och vinklade pincett.
3. Kirurgisk beredningen av den öppna cremaster muskeln
- En nål placeras genom spetsen av pungsäck (antingen vänster eller höger sida) och säkrade i sockeln för att placera spänning på huden. Superfusion med PSS (34-35 ° C) inleds under det kirurgiska fältet och bibehålls under hela dissektion för att hålla den utsatta vävnaden varm och fuktig. En veke (tillverkad av Kimwipe) placeras med ena änden bredvid pungen och den andra intill ett vakuum linje bort utflödet PSS. En sträng silikon följt de plexiglas styrelsen och helt omger kilen och piedestal fungerar som "vallgrav" för att samla in PSS som inte är aspirerat, tjänstgör som en effektiv säkerhetsåtgärd för att förhindra PSS läckage på mikroskopet.
- Ett snitt läggs längs den ventrala yta pungen. Om testikeln har indragen av cremaster muskeln i bukhålan, leder lätt tryck på den nedre delen av buken testikeln i SAC. Ytan på cremaster muskeln överliggande testikeln bör identifieras vid denna tidpunkt. Bindväv mellan testikelcancer huden och cremaster muskeln försiktigt bort att befria cremaster muskler från omgivande vävnad.
- Den testikelcancer hud är försiktigt tillbaka bakom den proximala kanten av sockeln och säkrade på varje sida med en nål. Utsidan av cremaster muskeln ytan är då rensas av bindväv. Kontinuerlig superfusion under dissektionen återfuktar bindväv, vilket underlättar sikten och borttagning.
- En nål genom spetsen av cremaster muskeln används för att placera den under längsgående spänning. En longitudinell snitt görs genom ventrala yta muskeln med stor omsorg för att minimera avbrott i det vaskulära utbudet. Blod flödesdynamik nära periferin av preparatet ändras genom detta vävnadsskada 14. Därför att minimera dessa effekter på datainsamling, blodkärl nära centrum av preparatet används för avbildning och fysiologiska studier.
- Den cremaster muskel är ansluten med en tunn ligament vid bitestikeln under testikeln. Reflekterande testikeln åt sidan utsätter detta ligament, som är noggrant skilda från bitestiklarna. Nära spetsen av cremaster muskeln är liten artär och ven som ansluter den till bitestikeln. Blockerade dessa fartyg mellan pincett och dra isär dem minimerar blödning. Testikeln, epididymis, testikel artär och ven är knyts ihop proximalt (4-0 eller 5-0 silke suturer), avhuggna och kastas (orkidektomi) tillsammans med tillhörande inguinal fett pad. Alternativt kan testikeln försiktigt tryckas tillbaka in i bukhålan och behållit med en bit bomull eller Kimwipe. Den orkidektomi tjänar till att undvika eventuella trauma i vävnaden när man trycker på testiklarna tillbaka in i bukhålan. Vi har inte hittat märkbara skillnader i kvaliteten på cremaster mikrocirkulationen beredningen (se avsnitt 3.8) med hjälp av antingen förfarande 7,15.
- Den yttre ytan av cremaster muskeln är rensas från kvarvarande bindväv och sedan sprids radiellt på ytan av piedestalen. Kanterna är säkrade med stift (se avsnitt 1.4) på 5-6 ställen för att skapa en platt ark tvärstrimmig muskulatur med intakt mikrocirkulation.
- Den färdiga beredningen överförs till stadiet av en intravital mikroskop, superfused kontinuerligt (3-5 ml / min, 34 ° C) och jämvikt i 30 minuter.
- Integritet cremaster preparatet utvärderas enligt flera kriterier. Spontan vasomotoriska tonen med minimala kirurgiska ingrepp anges med raska flöde i arterioler och brist på anhängare leukocyter hos venoler. Den mest känsliga index för en lyhörd preparat är sammandragning av arterioler att höja superfusion innehåll lösningen syre i 5-10 minuter. Detta görs genom utjämnande det med 21% O 2 (jämfört med 5% O 2, se avsnitt 1.5, alla med 5% CO 2, balans N 2). Förekomsten av leukocyter i arterioler, avsaknad av röda blodkroppar som flyter genom kapillärerna, och / eller leukocyter samlas i venoler och omgivande vävnad är tecken på vävnadsskada och inflammation.
4. Intravital avbildning av cremaster muskeln mikrocirkulationen
- Intravital bildbehandling utförs på en anpassad mikroskop baserad på en Olympus MVX10 Stereo Zoom plattform. Det MVX10 mikroskop kroppenmonteras på en MVX10 hybrid monter utrustad med genomlysning (halogenlampa) för brightfield (Köhler) imaging och med epi-belysning (kvicksilver lampa) för fluorescens avbildning. Använda epi-belysning är GCaMP2 upphetsad vid 472/30 nm med utsläppsrätter som samlats vid 520/35 nm. Bilderna förvärvats genom en MV PLAPO 2XC lins (numerisk apertur = 0,50; Olympus) med hjälp av en XR/Mega-10 intensifierat digitalkamera (Stanford Photonics, Inc., SPI) via Piper Control Software (SPI) på en persondator. Med detta system kan den observerade synfältet (FOV) kan varieras från 553 ìm X 442 ìm till 22 mm x 18 mm.
- Efter avslutad intravital imaging experiment är sövda musen euthanized med överdos av pentobarbital följt av halsdislokation.
5. Representativa resultat
Figur 1. Mouse styrelsen för intravital avbildning av musen cremaster beredning. A) Body kil med aluminium plattform (isolerad med gul plast) sett från botten. Värmemotstånd säkrade på undersidan av plattformen ger bedrivs värme. B) uppvärmning plattformen vilar på en plast kil. C) Organet kil placeras på ett plexiglas ombord för kirurgi och efterföljande överföring till skede av intravital mikroskop. Sylgard piedestal visas med röd pil. En sträng av vattentät silikon omger hela preparatet innehåller varje lösning som kan läcka under intravital förfarande, vilket hindrar den från att droppa på mikroskopet.
Figur 2. Custom MacroZoom mikroskop för widefield avbildning. A) MVX10 mikroskop kroppen (Olympus) med XR/Mega-10 ICCD kamera (Stanford fotonik) monterad på Trinokulärt port. B) Närbild av mikroskop kroppen. (A) zoomkontroll (0,63 till 6.3X), (b) filterhjul, (c) bild Doubler (NA = 0,50 med 25x optisk förstoring). C) underifrån kondensor för brightfield (Köhler) belysning (Kondensor NA = 0,55, arbetsavstånd = 27 mm).
Figur 3. Avslutade musen cremaster beredning. Sövda mus i liggande ställning på varma plastbelagd aluminium plattform (gul). Kroppsställning är säkrad med tejp. Den cremaster muskel sprids radiellt på det genomskinliga silastic gummi piedestal och fästs i kanterna. Superfusion lösning introduceras på den proximala änden genom en plast dripper (vit pil). Ett vakuum linje (vit pil) tar bort lösningen via en Kimwipe veken. Två mikropipetter visas placerade med sina tips i vävnaden. En referenselektrod (silvertråd) är säkrad i nedre kanten av cremaster muskeln.
Figur 4. Illustrera förstoringsintervallet för att visualisera arteriolär nätverk uttrycka GCaMP2 i endotelet. A) Lysrör och B) brightfield bild tagen på en optisk förstoring på 3,2 x för en total förstoring = 42X på bildskärm. [Synfält (FOV) = 4375 x 3470 ìm]. Skala bar = 500 ìm. Att arbeta på detta förstoring underlättar placering av mikropipetter på önskade platser. C) Lysrör och D) brightfield bild tagen vid optisk förstoring på 6.4X för total förstoring = 83x (FOV = 2200 x 1759 mikrometer). Skala bar = 200 ìm. E) Lysrör och F) brightfield bild tagen vid optisk förstoring på 12.6X för total förstoring = 165X (FOV = 1100 x 885 mikrometer). Skala bar = 100 ìm. G) med bild doubler, optiska förstoringen = 25.2X. Skala bar = 50 ìm.
Discussion
Här beskriver vi de öppna cremaster muskeln beredning i musen för att observera mikrocirkulation in vivo. Detta förfarande är modellerad efter den "öppna" cremaster förberedelse första beskrivs i råtta 4. Med lite övning hela kirurgiska ingreppet kan utföras på mindre än 1 timme. Mångsidigheten i denna beredning tillåter en mängd olika experimentella manipulationer och lätt anpassas till hamstrar och råttor, vilket möjliggör en mängd olika experimentella modeller studeras på liknande sätt. Beredningen är begränsad till handjur och mätningar bör göras mot mitten av vävnaden, för att undvika skadade områden nära kanterna av muskeln 14. Det bör också erkännas att även om tryck och flöde fördelningar förändras när sammankoppling fartyg av cremaster muskeln skärs 16, mikrokärl förbli flexibelt och passar för reproducerbara datainsamling. Den främsta begränsningen att visualisera mikrocirkulationen i cremaster muskel är uppbyggd av bindväv som djur mogen och öka i storlek, särskilt i råttor men även i hamstrar. Dessutom, som djuren bli fet, blir det svårare att kontrollera bedövning eftersom pentobarbital är lipofilt och kan absorberas i fettväv. Det bästa sättet att gå vidare är genom att vara tålmodig och samtidigt säkerställa att djuret ° S kroppstemperaturen hålls på ~ 37 ° C medan exponerad vävnad är bevattnas kontinuerligt med PSS.
Disclosures
Alla procedurer och protokoll som handlar om djur godkändes av Djurens skötsel och användning kommitté vid universitetet i Missouri och som utförs i enlighet med National Institutes of Health Guide för skötsel och användning av försöksdjur.
Produktionen av denna video-artikel har sponsrats av Stanford Photonics.
Acknowledgments
Forskning i författarnas laboratoriet stöds av National Institutes of Health bidrag R37-HL041026, R01-HL086483 och R01-HL056786 (SSS) och F32-HL097463 och T32-AR048523 (PB) från USA Public Health Service.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S642-212 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233 | |
| Nembutal Sodium Solution | Lundbeck Inc | NDC 67386-501-55 | Also referred to as sodium pentobarbital |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | Alternate: adjustable 12V DC power supply |
| Series 20 platform heater kit RH-2 | Warner Instruments | 64-0274 | Requires custom-built aluminum plate |
| Mega-10 Camera | Stanford Photonics Inc | XR/Mega-10 | |
| MVX10 | Olympus Corporation | ||
| MV PLAPO 2XC lens | Olympus Corporation | ||
| MVX10 hybrid stand | Leeds | LBX-Hybrid | |
| Piper Control Software | Stanford Photonics Inc | Program for Mega-10 camera | |
| Stereo Microscope | Nikon Instruments | SMZ645 | |
| Waterproof Silicone Sealant (Clear) | GE Healthcare | 47970-72643-LW5000 | Other clear silicone sealants also work |
| 60 x 15mm Petri Dish | Fisher Scientific | 08-757-13A | |
| Sylgard | Dow Corning | 184 | |
| Microdissection Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Dumont Forceps | Fine Science Tools | #5/45 | |
| GP Millipore Express PLUS Membrane | EMD Millipore | SCGPT05RE | |
| Minutiens Insect Pins | Austerlitz | M size 0.15 mm | |
| Compact Pet Trimmer | Wahl Clipper Corp. | Model 9966 | Clean after each use |
References
- Majno, G., Palade, G. E. Studies on inflammation. 1. The effect of histamine and serotonin on vascular permeability: an electron microscopic study. J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 571-605 (1961).
- Majno, G., Palade, G. E., Schoefl, G. I. Studies on inflammation. II. The site of action of histamine and serotonin along the vascular tree: a topographic study. J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 607-626 (1961).
- Grant, R. T. Direct Observation of Skeletal Muscle Blood Vessels (Rat Cremaster). J. Physiol. 172, 123-137 (1964).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).
- Bohlen, H. G., Gore, R. W., Hutchins, P. M. Comparison of microvascular pressures in normal and spontaneously hypertensive rats. Microvasc. Res. 13, 125-130 (1977).
- Klitzman, B., Duling, B. R. Microvascular hematocrit and red cell flow in resting and contracting striated muscle. Am. J. Physiol. 237, 481-490 (1979).
- Hungerford, J. E., Sessa, W. C., &, S. egal, S, S. Vasomotor control in arterioles of the mouse cremaster muscle. FASEB J. 14, 197-207 (2000).
- Figueroa, X. F., Paul, D. L., Simon, A. M., Goodenough, D. A., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. Central role of connexin40 in the propagation of electrically activated vasodilation in mouse cremasteric arterioles in vivo. Circ. Res. 92, 793-800 (2003).
- Wolfle, S. E., Schmidt, V. J., Hoepfl, B., Gebert, A., Alcolea, S., Gros, D., de Wit, C. Connexin45 cannot replace the function of connexin40 in conducting endothelium-dependent dilations along arterioles. Circ. Res. 101, 292-1299 (2007).
- Milkau, M., Kohler, R., de Wit, C. Crucial importance of the endothelial K+ channel SK3 and connexin40 in arteriolar dilations during skeletal muscle contraction. FASEB J. 24, 3572-3579 (2010).
- Bagher, P., Duan, D., Segal, S. S. Evidence for impaired neurovascular transmission in a murine model of Duchenne Muscular Dystrophy. J. Appl. Physiol. 110, 601-610 (2011).
- Tallini, Y. N., Brekke, J. F., Shui, B., Doran, R., Hwang, S. M., Nakai, J., Salama, G., Segal, S. S., Kotlikoff, M. I. Propagated endothelial Ca2+ waves and arteriolar dilation in vivo: measurements in Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice. Circ. Res. 101, 1300-1309 (2007).
- Grant, R. T. The effects of denervation on skeletal muscle blood vessels (rat cremaster). J. Anat. 100, 305-316 (1966).
- Proctor, K. G., Busija, D. W. Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle. Am. J. Physiol. 249, H34-H41 (1985).
- Bagher, P., Segal, S. S. Regulation of blood flow in the microcirculation: Role of conducted vasodilation. Acta Physiol. , (2011).
- Hill, M. A., Simpson, B. E., Meininger, G. A. Altered cremaster muscle hemodynamics due to disruption of the deferential feed vessels. Microvasc. Res. 39, 349-363 (1990).
