Summary
Подготовки ткани описывается для визуализации и экспериментальной манипуляции жизни микроциркуляцию. В анестезии самцов мышей, тонкие, высоко васкуляризированной кремастер мышцы готовы к прижизненной микроскопии для исследования микрососудистых сетей, включая артериол, капилляров и венул. Этот препарат легко адаптировать для крыс и хомяков.
Protocol
1. Мышь борту, мышечные пьедестал, клин тела и superfusion решение
- Мышь борту: прозрачные прямоугольные оргстекла борту (6 "широкий X 8" длиной X 3 / 16 "толщиной) состоит, чтобы поместиться на столик микроскопа." Мышь доска ", где под наркозом мышь, достигнутые во время хирургической подготовки мышцы кремастер.
- Мышцы пьедестал: прозрачная силиконовая резина пьедестал резиновые готовят из Sylgard 184, который смешивается в соответствии с инструкциями производителя ° С. Удобные формы является 15-мм х 50-мм диаметром одноразовые чашки Петри. Блок Sylgard режется на желаемую форму с лезвием (рис. 1С.). Тонкий слой ясно водонепроницаемый силиконовый клей используется для обеспечения безопасности Sylgard блока мыши борту. Полезные советы: После заливки Sylgard в чашке Петри, дегазацию в вакуумной камере в течение часа удаляет пузырьки воздуха и улучшает ясность. После дегазации, время отверждения для Sylgard сокращается на размещение блюдо в лабораторию духовке при 50 ° С в течение нескольких часов.
- Клин Тело и отопления платформы: клин (2 "x 4" x 15 °), расположенных под мышкой и с пьедестала наклоняет туловище вперед, что облегчает расширение мышц кремастер на постаменте из его происхождения. Включение алюминиевые платформы на поверхность обеспечивает проводящий тепло. Платформа нагревается резисторы подключены к источнику постоянного тока (рис. 1А). Калибровка платформы температуры до ~ 40 ° C поддерживает пищевода температура ~ 37 ° C. В противном случае, лучистого тепла от лампы используется.
- Пен. Для защиты мышц кремастер на пьедестале, булавки изготовлены из 0,15 мм насекомых контакты, которые были согнуты в "L" форму.
- Физиологический раствор соли (PSS). Препараты superfused (орошаемые) непрерывно с бикарбонатом буферизацией PSS подготовлен в сверхчистых (18,2 МОм) H 2 O. Исходные растворы готовятся в 20-кратным окончательной рабочей концентрации и стерилизовать через фильтр 0,2 мкм. Исходные растворы остаются хорошими в течение нескольких недель при условии хранения при 4 ° C. Подготовка соли отдельно от бикарбоната и смешивая их с разбавлением в день эксперимента предотвращает выпадение бикарбонат кальция. Маточного раствора соли состоит из (в ммоль / л): 2638 NaCl, KCl 94, 40 MgS0 4, 23,4 CaCl 2. Акции бикарбонат 360 NaHCO 3. В день эксперимента, соответствующие решения были доведены до конечного объема (обычно 2 л для данного эксперимента) в мерную колбу и помещают в водяной бане при температуре ~ 37 ° C. Уравновешивающая PSS с 5% CO 2 / 95% N 2 в течение ~ 15 минут с использованием газа диспергатор регулирует рН ~ 7,4 и предотвращает осадков. PSS пропускают непрерывно с 5% CO 2 / 95% N 2 по всему экспериментов. Окончательный рабочий раствор состава (в ммоль / л): 132 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgS0 4, CaCl 2 2, 18 NaHCO 3.
2. Анестезия и подготовки к операции
- После утверждения из Институциональные уходу и использованию животных комитета, мышей-самцов не менее 12 недель использования. Мышь анестезией с фенобарбиталом натрия (60 мг / кг) через внутрибрюшинного (ф) инъекции. Сдерживающих трубка оказывается полезным для обеспечения мыши во время начальной инъекции. На протяжении хирургических процедур и экспериментальных протоколов, анестезия поддерживается за счет добавки (10-20% от первоначальной инъекции, ф) по мере необходимости (каждые 30-60 минут, указывает выход ответ на ноги или хвост щепотку). Совет: Разбавление фенобарбитала 10 мг / мл в стерильном физиологическом растворе перед инъекцией уменьшает возможность передозировки.
- Анестезия компромиссы регулирования температуры так мышь должна быть теплой сразу же после первой инъекции. Размещение мыши в металлический носитель (вентилируемые алюминиевая корзина) в верхней части нагревательного элемента (калиброванный до ~ 37 ° C) работает хорошо. Кроме того, тепло лампы могут быть использованы заботясь, чтобы положение его на соответствующем расстоянии от мыши. Мыши следует контролировать каждые 5-10 минут, пока соответствующий уровень анестезии достигается (отсутствие вывода на носок или хвост щепотку). Дополнительные дозы могут потребоваться через 15-20 минут. Лучше набраться терпения и действовать осторожно, чтобы избежать передозировки, особенно с ожирением или старых животных.
- Волос удаляется из нижней части живота, нижней части спины, мошонки и ног, тщательно бриться соответствующих регионах. Особое внимание должно быть принято, чтобы избежать травмы мошонки и яичек, которые в противном случае не травмировать мышцы кремастер. Удалить распущенные волосы со свежим тампоном алкоголя.
- Если мочевой пузырь переполнен он будет чувствовать себя, как маленький винограда через брюшную стенку. Пустой мочевой пузырь использованием мягкое давление, чтобы предотвратить мышь от мочеиспускания по подготовке кремастер в процессе экспериментов. Kimwipe является эффект губки для сборат мочи.
- Поместите мышь на спине, лежа на клине с ногами трансграничных пьедестала. Шелковых шва (4-0 или 5-0) привязаны к каждой ноге обеспечивает троса для обеспечения мышь с ее промежность от пьедестала. Кусок ленты размещены свободно поперек груди и закреплены клином поддерживает общее положение тела. Хирургические процедуры выполняются при просмотре через стереомикроскопа использованием микродиссекции ножницы и пинцет угловой.
3. Хирургическая подготовка открытые мышцы кремастер
- Контактный помещается через вершину мошонки мешок (левой или правой стороне) и закреплены в постамент на место напряженности на коже. Superfusion с PSS (34-35 ° С) инициировал более операционного поля и сохраняется в течение вскрытия держать подвергаются ткани теплым и влажным. Фитиль (из Kimwipe) расположены с одной стороны рядом с мошонки мешок и другие рядом с вакуумной линии удаляет стоков PSS. Шарик силиконовый герметик придерживался борту оргстекла и полностью окружения клина и постамент служит "Ров" собирать любую PSS, который не атмосферный, выступающей в качестве эффективной меры предосторожности, чтобы предотвратить утечку PSS на микроскоп.
- Надрез вдоль брюшной поверхности мошонки мешок. Если яичко был втянут в мышцах кремастер в брюшную полость, мягкое давление на нижнюю часть живота направляет яичка в мешке. Поверхности мышц кремастер вышележащих яичка должны быть определены в это время. Соединительная ткань между кожи мошонки и мышцы кремастер тщательно удалены, чтобы освободить мышцы кремастер от окружающих тканей.
- Кожи мошонки аккуратно убирается за проксимальный край пьедестала и закреплены на каждой стороне с булавкой. Внешней поверхности поверхности мышц кремастер затем очищается от соединительной ткани. Непрерывная superfusion во время вскрытия гидратов соединительной ткани, способствуя прозрачности и удаления.
- Штифт через вершину мышц кремастер используется, чтобы поместить его в продольном растяжении. Продольный разрез производится через брюшной поверхности мышц с большой осторожностью, направленных на минимизацию нарушения кровоснабжения. Кровоток динамики вблизи периферии препарата изменены этом 14 повреждения тканей. Поэтому, чтобы минимизировать эти влияет на сбор данных, кровеносные сосуды вблизи центра подготовки используются для работы с изображениями и физиологических исследований.
- Мышцы кремастер связано с тем, тонкие связки придатка яичка под яичко. Отражая яичка с одной стороны подвергает эту связку, которая тщательно отделена от яичка. Рядом с вершиной мышц кремастер мала артерии и вены, которые соединяют его придатка. Окклюзии этих судов между щипцами и тянуть их друг от друга сводит к минимуму кровотечение. Яичка, придатка, яичка артерии и вены перевязаны проксимально (4-0 или 5-0 шелковых шва), разорвали и отклонены (орхиэктомии) вместе с соответствующим паховых площадку жира. Кроме того, яичко может быть слегка толкнул обратно в брюшную полость и сохраняется с кусочком ваты или Kimwipe. Орхиэктомии служит, чтобы избежать возможных травм тканей при нажатии яички обратно в брюшную полость. Мы не обнаружили заметные различия в качестве подготовки микроциркуляцию кремастер (см. раздел 3.8), используя процедуру 7,15.
- Внешняя поверхность мышцы кремастер очищается от оставшихся соединительной ткани, а затем распространилась радиально на поверхности пьедестала. Края обеспечены штифты (см. раздел 1.4) в 5-6 местах, чтобы создать плоский лист поперечно-полосатых мышц с неповрежденными микроциркуляцию.
- Завершена подготовка переходит к этапу прижизненной микроскопии, superfused непрерывно (3-5 мл / мин, 34 ° С) и уравновешенной в течение 30 минут.
- Целостность подготовки кремастер оценивается по нескольким критериям. Спонтанное вазомоторный тон с минимальной хирургической травмы указывается оживленных потока в артериол и отсутствие приверженцем лейкоцитов в венулы. Наиболее чувствительных индекс реагировать препарата сужение артериол повышению кислорода superfusion решение содержание в течение 5-10 минут. Это достигается путем уравновешивания его с 21% O 2 (против 5% O 2, см. раздел 1.5, все с 5% CO 2, баланс N 2). Наличие лейкоцитов в артериолы, отсутствие эритроцитов крови, текущей по капиллярам, и / или лейкоцитов накапливается в венулы и окружающие ткани признаки повреждения тканей и воспаления.
4. Прижизненные изображения микроциркуляции мышц кремастер
- Прижизненные изображения осуществляется на пользовательские микроскопа основан на платформе Стерео Olympus Увеличить MVX10. MVX10 микроскопом телакрепится к MVX10 гибридный стенд оснащен просвечивание (галогенные лампы) для светлого (Келер) изображений и с эпи-подсветкой (ртутная лампа) для флуоресценции. Использование эпи-освещение, GCaMP2 возбуждается на 472/30 нм с излучением, собранные на 520/35 нм. Изображения, полученных в результате М. В. PLAPO 2хс объектива (числовая апертура = 0,50; Олимп), используя XR/Mega-10 активизировались цифровой камерой (Стэнфордский Photonics, Inc; SPI) через Пайпер управление компьютерами (SPI) на персональном компьютере. С помощью этой системы, наблюдаемое поле зрения (FOV) может варьироваться от 553 мкм х 442 мкм до 22 мм Х 18 мм.
- После завершения экспериментов прижизненного изображения, под наркозом мышь эвтаназии с передозировкой пентобарбитал следуют шейный дислокации.
5. Представитель Результаты
Рисунок 1. Мышь доска для прижизненной визуализации подготовки мыши кремастер. ) Тело клин с алюминиевой платформой (изолированные с желтыми пластиковыми) осмотре снизу. Отопление резисторы крепится к нижней части платформы обеспечивают проводили тепло. Б) отопления платформы опирается на пластиковые клина. С) тела клина находится на борту оргстекла для хирургии и последующей передачи в стадии прижизненной микроскопом. Sylgard пьедестал обозначен красной стрелкой. Бусинка из водонепроницаемого силиконовые окружает вся подготовка содержать каких-либо решение, которое может протекать в течение прижизненной процедуре, не давая ей капать на микроскоп.
Рисунок 2. Custom MacroZoom микроскоп для широкопольных изображений. ) MVX10 микроскопом тела (Olympus) с XR/Mega-10 камеры ICCD (Stanford Photonics), установленных на тринокулярный порт. Б) крупным планом зрения микроскопа тела. () Увеличить контроль (от 0,63 до 6.3X), (б) фильтр колеса; (с) изображение удвоитель (NA = 0,50 с 25x оптическим увеличением). С) подъярус конденсатор для светлого (Келер) освещения (конденсатора NA = 0,55, рабочее расстояние = 27 мм).
Рисунок 3. Завершено мыши кремастер подготовки. Наркозом мыши в лежачем положении на теплых пластиковым покрытием алюминиевой платформе (желтый). Положение тела обеспечивается с лентой. Мышцы кремастер распространяется радиально на прозрачной силиконовой резины и пьедестал возлагали на краях. Superfusion решение вводится в проксимальный конец через капельницы пластиковые (белые стрелки). Вакуумной линии (белые стрелки) удаляет решение с помощью Kimwipe фитиль. Два микропипетки показаны позиционируется со своими советами в ткани. Электрод (серебряной проволоки) закрепляется на нижнем краю мышцы кремастер.
Рисунок 4. Иллюстрируя Диапазон увеличения для визуализации артериол сетей выражения GCaMP2 в эндотелий. ) Флуоресцентные и В) светлого изображения, принятые на оптические увеличение 3.2x на общее увеличение = 42X на видеомонитор. [Поле зрения (FOV) = 4375 х 3470 мкм]. Шкала бар = 500 мкм. Работа в этом увеличении облегчает размещение микропипетки в нужное место. С) Флуоресцентные и D) светлое изображение, снятое в оптическом увеличении 6.4X на общее увеличение = 83X (FOV = 2200 х 1759 мкм). Шкала бар = 200 мкм. Е) Флуоресцентные и F), светлое изображение, снятое в оптическом увеличении 12.6X на общее увеличение = 165X (FOV = 1100 х 885 мкм). Шкала бар = 100 мкм. Г) с изображение дублер, оптическим увеличением = 25.2X. Шкала бар = 50 мкм.
Discussion
Здесь мы описываем открытые мышцы кремастер препарата в мышь для наблюдения микроциркуляцию в естественных условиях. Эта процедура по образцу "открытым" кремастер подготовке впервые описана в крысу 4. С практикой все хирургические процедуры могут быть завершены менее чем за 1 час. Универсальность этого препарата позволяет применять самые разнообразные экспериментальные манипуляции и легко адаптировать к хомякам, а также крыс, давая различные экспериментальные модели для изучения аналогичным образом. Подготовка ограничивается самцов и измерения должны быть сделаны по направлению к центру ткани, избегая повреждения областей вблизи краев мышцы 14. Следует также признать, что, в то время как давление и расход распределения изменяются при соединении сосудов мышц кремастер разрезаются 16, микрососудов оставаться гибкой и подходящей для воспроизводимых сбора данных. Основное ограничение для визуализации микроциркуляции в мышцах кремастер является наращивание соединительной ткани животных, как зрелый и увеличиваются в размерах, в частности, у крыс, но и у хомяков. Кроме того, как животные толстеют, она становится труднее контролировать анестезии, потому пентобарбитал является липофильных и может всасываться в жировой ткани. Лучший способ продолжить это, будучи больной, обеспечивая при этом температура тела животного ° С поддерживается на уровне ~ 37 ° C в то время как ткань подвергается орошаемых непрерывно с PSS.
Disclosures
Все процедуры и протоколы с участием животных были утверждены уходу и использованию животных комитета Университета Миссури и осуществляется в соответствии с Национальными Институтами Здоровья Руководство по уходу и использованию лабораторных животных.
Производство этого видео-статья была эгидой Стэнфордского Photonics.
Acknowledgments
Исследования в лаборатории авторов при поддержке Национального института здравоохранения грантов R37-HL041026, R01-R01 и HL086483-HL056786 (SSS) и F32-HL097463 и T32-AR048523 (РВ) из Общественного США службы здравоохранения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S642-212 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233 | |
| Nembutal Sodium Solution | Lundbeck Inc | NDC 67386-501-55 | Also referred to as sodium pentobarbital |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | Alternate: adjustable 12V DC power supply |
| Series 20 platform heater kit RH-2 | Warner Instruments | 64-0274 | Requires custom-built aluminum plate |
| Mega-10 Camera | Stanford Photonics Inc | XR/Mega-10 | |
| MVX10 | Olympus Corporation | ||
| MV PLAPO 2XC lens | Olympus Corporation | ||
| MVX10 hybrid stand | Leeds | LBX-Hybrid | |
| Piper Control Software | Stanford Photonics Inc | Program for Mega-10 camera | |
| Stereo Microscope | Nikon Instruments | SMZ645 | |
| Waterproof Silicone Sealant (Clear) | GE Healthcare | 47970-72643-LW5000 | Other clear silicone sealants also work |
| 60 x 15mm Petri Dish | Fisher Scientific | 08-757-13A | |
| Sylgard | Dow Corning | 184 | |
| Microdissection Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Dumont Forceps | Fine Science Tools | #5/45 | |
| GP Millipore Express PLUS Membrane | EMD Millipore | SCGPT05RE | |
| Minutiens Insect Pins | Austerlitz | M size 0.15 mm | |
| Compact Pet Trimmer | Wahl Clipper Corp. | Model 9966 | Clean after each use |
References
- Majno, G., Palade, G. E. Studies on inflammation. 1. The effect of histamine and serotonin on vascular permeability: an electron microscopic study. J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 571-605 (1961).
- Majno, G., Palade, G. E., Schoefl, G. I. Studies on inflammation. II. The site of action of histamine and serotonin along the vascular tree: a topographic study. J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 607-626 (1961).
- Grant, R. T. Direct Observation of Skeletal Muscle Blood Vessels (Rat Cremaster). J. Physiol. 172, 123-137 (1964).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).
- Bohlen, H. G., Gore, R. W., Hutchins, P. M. Comparison of microvascular pressures in normal and spontaneously hypertensive rats. Microvasc. Res. 13, 125-130 (1977).
- Klitzman, B., Duling, B. R. Microvascular hematocrit and red cell flow in resting and contracting striated muscle. Am. J. Physiol. 237, 481-490 (1979).
- Hungerford, J. E., Sessa, W. C., &, S. egal, S, S. Vasomotor control in arterioles of the mouse cremaster muscle. FASEB J. 14, 197-207 (2000).
- Figueroa, X. F., Paul, D. L., Simon, A. M., Goodenough, D. A., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. Central role of connexin40 in the propagation of electrically activated vasodilation in mouse cremasteric arterioles in vivo. Circ. Res. 92, 793-800 (2003).
- Wolfle, S. E., Schmidt, V. J., Hoepfl, B., Gebert, A., Alcolea, S., Gros, D., de Wit, C. Connexin45 cannot replace the function of connexin40 in conducting endothelium-dependent dilations along arterioles. Circ. Res. 101, 292-1299 (2007).
- Milkau, M., Kohler, R., de Wit, C. Crucial importance of the endothelial K+ channel SK3 and connexin40 in arteriolar dilations during skeletal muscle contraction. FASEB J. 24, 3572-3579 (2010).
- Bagher, P., Duan, D., Segal, S. S. Evidence for impaired neurovascular transmission in a murine model of Duchenne Muscular Dystrophy. J. Appl. Physiol. 110, 601-610 (2011).
- Tallini, Y. N., Brekke, J. F., Shui, B., Doran, R., Hwang, S. M., Nakai, J., Salama, G., Segal, S. S., Kotlikoff, M. I. Propagated endothelial Ca2+ waves and arteriolar dilation in vivo: measurements in Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice. Circ. Res. 101, 1300-1309 (2007).
- Grant, R. T. The effects of denervation on skeletal muscle blood vessels (rat cremaster). J. Anat. 100, 305-316 (1966).
- Proctor, K. G., Busija, D. W. Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle. Am. J. Physiol. 249, H34-H41 (1985).
- Bagher, P., Segal, S. S. Regulation of blood flow in the microcirculation: Role of conducted vasodilation. Acta Physiol. , (2011).
- Hill, M. A., Simpson, B. E., Meininger, G. A. Altered cremaster muscle hemodynamics due to disruption of the deferential feed vessels. Microvasc. Res. 39, 349-363 (1990).
