Summary
조직 준비는 시각화와 생활 엑기스의 실험 조작에 대해 설명합니다. anesthetized 남성 생쥐에서 얇고 높은 vascularized cremaster 근육이 arterioles, 모세 혈관 및 venules 포함한 microvascular 네트워크를 공부 intravital 현미경을위한 준비가되어 있습니다. 이 준비는 즉시 쥐와 햄스터에 대한 적응이다.
Abstract
신체 전반에 걸쳐, 항상성의 유지는 부산물 신진 대사의 제거와 산소와 영양소 수반하는의 지속적인 공급을 필요로합니다. 이 균형은 모든 조직 및 장기에 걸쳐 혈관 공급의 작은 가지를 포함 엑기스를 통해 혈액의 움직임에 의해 이루어진다. 동맥에서 Arterioles 지점 속속들이 parenchymal 세포와 관련된 모세 혈관의 수많은로 흐르는 산소를 혈액의 분포와 크기를 제어 네트워크를 형성합니다. 모세 혈관은 조직 세포와 혈액 공급 사이 diffusional 교류의 큰 표면적을 제공합니다. Venules은 모세 유출을 수집하고 그들은 심장으로 혈액을 반환 deoxygenated으로 수렴. 실시간으로 이러한 프로세스를 준수하기 위해서는 시각과 생활 엑기스 조작에 대한 실험적인 접근이 필요합니다.
쥐의 cremaster 근육 먼저 조직학 및 전자 현미경 해부 1,2를 사용하여 염증을 연구에 대한 모델로 사용되었다. 노출 손상 쥐 cremaster 근육의 생체내 보고서에서 처음으로 빛의 3 반영 사용 vasoactive 마약 microvascular 반응을 조사 하였다. 그러나 집중 조명의 근육과 부족의 곡률이 준비의 유용성을 제한. 주요 돌파구는 근육을 여는 고환에서 분리하고 복합 현미경 4 미만 transillumination을위한 평면 시트로 반경을 확산 entailed. 쥐 5 햄스터 6 엑기스의 생리를 연구하기위한 귀중한 준비로 표시되지만, 마우스 7 cremaster 근육은 microvascular 기능 8-11과 세포의 실시간 영상을 조절에 관여 세포 경로를 해부 특히 유용 입증되었습니다 12 신호.
testes은 사타구니 운하 13을 통해 아래로 내려가면 cremaster 근육은 내부 경사와 가로 abdominus 근육에서 파생됩니다. 그리고 testes의 온도를 유지 : 그것은 지원 (cremaster = suspender 그리스어)를 제공합니다. 여기에 설명한 바와 같이, cremaster 근육이 뛰어난 광학 해상도 얇은 평면 시트로 준비가되어 있습니다. 마우스가 안정적인 체온과 마취의 비행기에서 관리를 통해 수술 준비는 생리 소금 솔루션으로 지속적으로 그것을 대는 동안, 주변 조직과 testes에서 근육을 자유롭게 silastic 고무 투명 받침대에 그것을 확산하고 곤충 핀으로 가장자리를 확보 관련 . 현재의 프로토콜은 arteriolar 내피 세포에서 GCaMP2을 표현하는 유전자 변형 마우스를 사용합니다. GCaMP2는 유전자 코드 형광등 칼슘 표시기 분자 12. 위드 필드 이미징 및 강화 전하 결합 장치 카메라 arteriolar 내피에서 칼슘 신호의 생체내 연구에 사용.
Protocol
1. 마우스 보드, 근육 페데 스탈, 신체 웨지와 superfusion 솔루션
- 마우스 보드 : 투명 사각형 플렉시 보드 (6 "(폭) x 8"길이 X 16분의 3 "두께) 현미경의 무대에 맞게 이루어집니다."anesthetized 마우스의 수술 준비하는 동안 보안이 어디에 마우스 보드가 "입니다 cremaster 근육.
- 근육 페데 스탈 : 투명 silastic 고무 받침대가 제조 업체 ° S 지침에 따라 혼합 Sylgard 184에서 준비가되어 있습니다. 편리한 금형은 15 mm 두께 X 50 mm 직경 직경 일회용 페트리 접시입니다. Sylgard 블록은 면도날 (그림 1C를 참조하십시오.)하여 원하는 형태로 절단됩니다. 맑은 방수 실리콘 접착제의 얇은 계층은 마우스 보드 Sylgard 블록을 확보하는 데 사용됩니다. 유용한 팁 : 한 시간 동안 진공 챔버에 degassing, 페트리 접시에 Sylgard를 따르고 후 기포를 제거하고 선명도를 향상시킵니다. Sylgard 시간은 50 ° C 몇 시간 동안 실험실 오븐에 접시를 배치하여 단축됩니다 경화, degassing에 따라.
- 바디 웨지와 가열 플랫폼 : 마우스 아래와 페데 스탈에 대한 위치 웨지 (2 "X 4"X 15 °)는 기원의 받침대 위에 cremaster 근육을 확장 용이 앞으로 몸을 젖힌. 표면에 알루미늄 플랫폼을 통합하는 것은 전도성 열을 제공합니다. 플랫폼은 DC 전원 공급 장치 (그림 1A)에 연결된 저항에 의해 가열됩니다. 플랫폼 온도를 보정 ~ 40 ° C ~ 37 식도 온도를 유지 ° C. 그렇지 않으면, 램프의 복사열이 사용됩니다.
- 빵. 페데 스탈에 cremaster 근육을 확보하기 위해 핀은 "L"모양으로 구부 러되었습니다 0.15 mm 곤충 핀에서 준비가되어 있습니다.
- 생리 소금 용액 (PSS). 준비가 ultrapure (MΩ 18.2) H 2 O.에서 준비 중탄산염 버퍼 PSS와 함께 지속적으로 (irrigated) superfused 아르 증권 솔루션은 20X 최종 작업 농도에서 준비 및 0.2 μm의 필터를 통해 살균합니다. 4 저장되는 주식 솔루션은 몇 주 동안 잘 남아 ° C. 중탄산염 별도로 소금을 준비하여 실험 당일 희석으로 그들을 혼합하는 것은 칼슘 중탄산염의 석출을 방지합니다. 재고 소금 솔루션 (mmol / L에서)으로 구성되어 있습니다 : 2,638 NaCl, 94 KCl, 40 MgS0 4, 23.4 CaCl 2. 재고 중탄산염 360 NaHCO 3. 실험 당일, 해당 솔루션은 용적 플라스크에 최종 볼륨 (일반적으로 주어진 실험 2 패)로 이동하고 ~ 37 ° C.에 물을 욕조에 배치 5%로 PSS를 Equilibrating하면 2 CO / 가스 disperser를 사용하여 ~ 15 분 95% N 2 ~ 7.4으로 산도를 조절하고 석출을 방지합니다. PSS 5 % CO 2 / 실험을 통해 95% N 2 계속적으로 부풀어 오른 모양이다. 최종 작업 솔루션 구성은 (mmol / L)입니다 : 132 NaCl, 4.7 KCl, 1.2 MgS0 4, 2 CaCl 2, 18 NaHCO 3.
2. 마취 및 수술 준비
- 기관 애니멀 케어 및 사용위원회의 승인에 따라, 적어도 12 주 된 수컷 생쥐를 사용합니다. 마우스 intraperitoneal (IP) 주입을 통해 pentobarbital 나트륨 (60 밀리그램 / kg)와 anesthetized 있습니다. 금지 튜브는 초기 주입하는 동안 마우스를 확보하는 데 유용 증명한다. 수술 절차 및 실험 프로토콜을 통해 마취는 필요에 따라 보조 (초기 주입의 10-20%, IP) (; 발가락이나 꼬리 공략 탈퇴 응답에 표시된 모든 30~60분)에 의해 유지됩니다. 팁 : Diluting pentobarbital 10 MG / 멸균 생리에 ML 주입은 과다 복용의 가능성을 감소하기 전에.
- 마우스가 바로 첫 번째 주사 후 따뜻한 보관해야하므로 마취는 온도 조절을 타협. 열판 위에 (통풍 알루미늄 바구니) 금속 캐리어에 마우스를 게재하면 (~ 37 조정 ° C) 잘 작동합니다. 또한, 가열 램프는 마우스에서 적절한 거리에서 그것을 위치를 돌봐 사용할 수 있습니다. 마취의 적절한 수준 (발가락이나 꼬리 공략 탈퇴 부족) 달성 때까지 마우스는 모든 50~10분를 모니터링해야합니다. 부가 선량은 15~20분 후 필요할 수 있습니다. 환자가 특히 비만이나 노인 동물, 과다 복용을 피하기 위해주의와 함께 진행하는 것이 좋습니다.
- 헤어는 신중하게 각 지역을 면도하여 낮은 복부, 허리, 음낭과 다리에서 제거됩니다. 특히주의가 달리 cremaster 근육을 다치게됩니다 음낭과 testes에 외상을 피하기 위해 이동해야합니다. 신선한 알코올 면봉을 느슨하게 머리를 제거합니다.
- 방광이 가득하면 이것은 복벽을 통해 작은 포도처럼 느낄 것이다. 실험하는 동안 cremaster 준비에 소변에서 마우스를 방지하기 위해 부드러운 압력을 이용하여 방광을 비웁니다. Kimwipe은 collec에 효과 스폰지입니다t 소변.
- 그 다리는 받침대 위에 다리를 벌리고 서있는 쐐기에 누워, 그 뒷면에 마우스를 위치. 각각의 발을 묶어 실크 봉합사는 (4-0 또는 5-0) 받침대 상대로 조개와 마우스를 보안을위한 밧줄을 제공합니다. 가슴팍이 느슨하게 배치와 쐐기로 보안 테이프의 조각이 전체 몸의 위치를 유지합니다. microdissection 가위와 직각 집게를 사용하여 stereomicroscope를 통해 보는 동안 수술 절차가 수행됩니다.
3. 열린 cremaster 근육의 외과 준비
- PIN은 scrotal 색의 꼭대기 (왼쪽이나 오른쪽)를 통해 위치와 피부에 긴장감을 배치하기 위해 받침대로 안전합니다. PSS (34-35 ° C)와 Superfusion은 수술 부위를 통해 시작하고 노출된 조직은 따뜻하고 촉촉한 유지 절개를 통해 유지됩니다. scrotal 색 및 진공 라인에 다른 옆에 옆에 한쪽 끝을 함께 배치 윅 (Kimwipe로 만든) 유출물 PSS를 제거합니다. 플렉시 보드 준수하고 완전히 쐐기를 encircling와 받침대는 현미경에 PSS 누출을 방지하기 위해 효과적인 예방책으로 제공, aspirated되지 않은 PSS를 수집하는 "해자"역할을 실리콘 밀봉제의 구슬.
- 절개는 scrotal 색의 복부 표면에 따라 이루어집니다. 고환이 복강에 cremaster 근육에 의해 철회되어있다면, 아래 복부에 부드러운 압력 색으로 고환을 지휘하고 있습니다. 고환을 overlying cremaster 근육의 표면이 시간에 파악해야합니다. scrotal 피부와 근육 사이에 cremaster 결합 조직은 신중하게 조직을 둘러싼에서 cremaster 근육을 무료로 제거됩니다.
- scrotal 피부는 부드럽게 받침대의 근위 가장자리 뒤에 철회와 핀 각 측면에 안전합니다. cremaster 근육 표면의 외부 표면은 다음 결합 조직의 지워집니다. 해부의 hydrates 결합 조직 중에 연속 superfusion, 가시성 및 제거를 용이하게.
- cremaster 근육의 꼭대기를 통해 PIN은 종방향 긴장 밑에 배치하는 데 사용됩니다. 세로 절개는 혈관 공급의 중단을 최소화하기 위해 찍은 매우 세심하게 근육의 복부 표면을 통해 이루어집니다. 준비의 주변 근처에 혈류 역학이 조직 손상 14 변경됩니다. 따라서, 최소화하기 위해 이들은 이미징 및 생리학 연구에 사용되는 데이터 수집, 준비의 중심 부근 혈관에 영향을줍니다.
- cremaster 근육은 고환 아래 epididymis에 얇은 인대에 의해 연결되어 있습니다. 한쪽 고환을 반영하는 것은 신중하게 epididymis에서 분리된이 인대를 제공합니다. cremaster 근육의 꼭대기 근처에있는 epididymis에 연결 작은 동맥과 정맥입니다. 포셉 사이의 이러한 혈관을 Occluding하고 간격을 끄는 것은 출혈 최소화합니다. 고환, epididymis, 고환 동맥과 정맥은 (4-0 또는 5-0 실크 봉합사) proximally 출혈도 잡았 관련된 사타구니 지방 패드와 함께 절단 및 (orchiectomy) 삭제합니다. 또는 고환은 부드럽게 복강에 다시 밀고 또 면바지나 Kimwipe의 일부로 유지하실 수 있습니다. orchiectomy는 복강에 다시 testes 밀어 때 조직하는 것이 가능 손상을 피하려면 역할을합니다. 우리는 절차 7,15 중 하나를 사용하여 cremaster의 엑기스 준비의 품질에 눈에 띄는 차이를 (제 3.8 참조) 찾을 수 없습니다.
- cremaster 근육의 외부 표면은 남아있는 결합 조직의 삭제 후 받침대의 표면에 반경 전염됩니다. 가장자리는 그대로 엑기스와 평형으로 뻗은 줄이있는 근육의 평면 시트를 만들려면 5-6 장소에 핀 (제 1.4 참조)과 함께 보안 있습니다.
- 완료 준비는 intravital 현미경의 무대로 전송 (3-5 ML / 분, 34 ° C) 지속 superfused 30 분 equilibrated입니다.
- cremaster 준비의 무결성 몇 가지 기준에 따라 평가됩니다. 최소한의 수술 외상과 자연 vasomotor 톤은 arterioles과 venules에서 자기편 leukocytes의 부족에서 활발한 흐름으로 표시됩니다. 응답 준비의 가장 민감한 지수 5-10 분 동안 superfusion 솔루션 산소 함량을 높이는하는 arterioles의 수축됩니다. 이것은 21% O 2를 equilibrating에 의해 이루어집니다 (대 5% O 2, 섹션 1.5를 참조하십시오, 모든 5% CO 2, 균형 N 2). arterioles에 leukocytes의 존재는, 모세 혈관을 통해 흐르는 적혈구의 부재는, 및 / 또는 venules의 축적과 조직을 둘러싼 leukocytes은 조직 손상과 염증의 흔적입니다.
4. cremaster의 근육 엑기스의 Intravital 이미징
- Intravital 이미징은 올림푸스 MVX10 스테레오 줌 플랫폼을 기반으로 사용자 정의 현미경에서 수행됩니다. MVX10 현미경 본체스탠드는 브라이트 (쾰러) 이미징을위한 transillumination (할로겐 램프)과 형광 이미징을위한 에피 조명 (수은 램프)을 갖춘 MVX10 하이브리드에 탑재됩니다. 에피 조명 사용 GCaMP2는 35분의 520 NM에서 수집된 방출과 30분의 472 nm의에 흥분됩니다. 개인 컴퓨터에 파이퍼 제어 소프트웨어 (SPI)를 통해, XR/Mega-10 강화 디지털 카메라 (SPI 스탠포드 Photonics 주식 회사)를 사용하여, 이미지 MV PLAPO 2XC 렌즈 (올림푸스 수치 조리개 = 0.50)를 통해 찾았습니다. 이 시스템으로 뷰 (FOV)의 관찰 필드가 X 442 μm의 22mm X 18mm를 553 μm의에서 다양한 수 있습니다.
- intravital 이미징 실험이 완료되면, anesthetized 마우스 자궁 전위 다음 pentobarbital의 과용과 euthanized있다.
5. 대표 결과
마우스 cremaster 준비의 intravital 이미징을위한 그림 1. 마우스 보드. A) 알루미늄 바디 플랫폼 웨지은 (노란 비닐 절연) 바닥에서 볼. 플랫폼의 아래쪽에 보안 난방 장치 저항은 진행 열을 제공합니다. B) 가열 플랫폼은 플라스틱 쐐기에 달려있다. C) 본문 웨지는 수술과 intravital 현미경의 무대에 후속 전송을 위해 플렉시 보드에 배치됩니다. Sylgard의 페데 스탈은 빨간색 화살표로 표시됩니다. 방수 실리콘의 구슬 현미경에 흘리지에서 예방, intravital 절차를 수행하는 동안 누설 수있는 솔루션을 포함하는 전체 준비를 둘러싸고 있습니다.
위드 필드 이미징을위한 그림 2. 사용자 정의 MacroZoom 현미경. A) XR/Mega-10 ICCD 카메라로 MVX10 현미경 본체 (올림푸스) (스탠포드 Photonics)는 trinocular 포트 장착. 현미경 본문의 B) 가까이 볼 수 있습니다. (A) 줌 컨트롤 (0.63에 6.3X), (B) 필터 휠, (C) 이미지 doubler (25X 광학 배율과 NA가 = 0.50). 브라이트 (쾰러) 조명 (콘덴서 NA = 0.55, 작동 거리 = 27mm)에 대한 C) Substage 응축기.
그림 3. 마우스 cremaster 준비 완료. 따뜻한 플라스틱 코팅 알루미늄 플랫폼 (노란색)에 위로 향한 위치에 Anesthetized 마우스. 바디 위치는 테이프로 안전합니다. cremaster 근육은 투명 silastic 고무 받침대에 반경 확산과 가장자리에 고정된 것입니다. Superfusion 솔루션은 플라스틱 dripper (흰색 화살표)를 통해 근위 끝에 도입입니다. 진공 라인 (흰색 화살촉)는 Kimwipe 윅을 통해 솔루션을 제거합니다. 두 micropipettes은 조직에서 팁을 위치 표시됩니다. 참조 전극 (실버 와이어)은 cremaster 근육의 아래쪽 가장자리에 안전합니다.
그림 4. 내피에 GCaMP2을 표현 arteriolar 네트워크를 시각화에 대한 배율 범위를 설명. A)) 형광등 및 B 브라이트 이미지는 비디오 모니터에 총 배율 = 42X에 대한 3.2X의 광학 배율에서 찍은. [모두보기 분야 (FOV) = 4,375 X 3,470 μm의]. 스케일 바 = 500 μm의. 이 배율에서 근무하면 원하는 위치에 micropipettes의 배치를 용이하게합니다. 총 확대를위한 6.4X의 광학 배율에서 찍은 C) 형광등 및 D) 브라이트 이미지 = 83X (FOV = 2,200 X 1,759 μm의). 스케일 바 = 200 μm의. E) 형광등과 F) 브라이트 이미지 전체 확대를위한 12.6X의 광학 배율에서 찍은 = 165X (FOV = 1100 X 885 μm의). 스케일 바 = 100 μm의. G) 이미지 doubler으로, 광학 배율 = 25.2X합니다. 스케일 바 = 50 μm의.
Discussion
여기 생체내의 엑기스를 관찰을위한 마우스에서 열린 cremaster 근육 준비에 대해 설명합니다. 이 절차는 먼저 쥐를 4 설명되어있는 "열기"cremaster 준비를 모방한 것입니다. 연습 전체 수술은 미만 1 시간에 완료할 수 있습니다. 이 준비의 융통성은 실험 조작의 다양한 가능하며 쉽게 유사한 방식으로 공부하는 실험 모델의 다양한 사용, 햄스터뿐만 아니라 쥐에 적응합니다. 준비는 수컷 동물에 한정되며 측정은 근육 14 가장자리 근처에 손상된 지역을 피하 조직의 중심으로하여야한다. 또한 압력과 유량 분배가 cremaster 근육의 연결된 혈관이 16자를 때 변경하는 동안, microvessels 반응 및 재현성 데이터 수집에 적합한 남아, 그 인식해야합니다. cremaster 근육의 엑기스를 시각화하는 기본 제한은 특히 쥐가에서뿐만 아니라 햄스터에 성숙 동물 및 크기의 증가와 같은 결합 조직의 상승입니다. 또한, 동물 지방 받으면, 그것은 pentobarbital은 lipophilic하고 지방 조직에 흡수 수 있기 때문에 마취를 제어하는 더 어려워집니다. 진행하는 가장 좋은 방법은 동물 ° S 체온이 ~ 37 유지되는 동안 환자 확보되는 것입니다 ° C 노출된 조직 PSS와 함께 지속적으로 irrigated있는 동안.
Disclosures
동물과 관련된 모든 절차와 프로토콜은 미주리 대학의 동물 케어 및 사용위원회의 승인과 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 국립 연구소 건강의 가이드와 함께 조화롭게 수행했다.
이 비디오 문서의 생산은 스탠포드 Photonics 주최되었습니다.
Acknowledgments
저자 '실험실에서 연구가 건강 보조금 R37 - HL041026, R01 - HL086483 및 R01 - HL056786 (SSS)과 미국 공공 보건 서비스에서 F32 - HL097463 및 T32 - AR048523 (PB)에 의해 국립 연구소에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S642-212 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233 | |
| Nembutal Sodium Solution | Lundbeck Inc | NDC 67386-501-55 | Also referred to as sodium pentobarbital |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | Alternate: adjustable 12V DC power supply |
| Series 20 platform heater kit RH-2 | Warner Instruments | 64-0274 | Requires custom-built aluminum plate |
| Mega-10 Camera | Stanford Photonics Inc | XR/Mega-10 | |
| MVX10 | Olympus Corporation | ||
| MV PLAPO 2XC lens | Olympus Corporation | ||
| MVX10 hybrid stand | Leeds | LBX-Hybrid | |
| Piper Control Software | Stanford Photonics Inc | Program for Mega-10 camera | |
| Stereo Microscope | Nikon Instruments | SMZ645 | |
| Waterproof Silicone Sealant (Clear) | GE Healthcare | 47970-72643-LW5000 | Other clear silicone sealants also work |
| 60 x 15mm Petri Dish | Fisher Scientific | 08-757-13A | |
| Sylgard | Dow Corning | 184 | |
| Microdissection Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Dumont Forceps | Fine Science Tools | #5/45 | |
| GP Millipore Express PLUS Membrane | EMD Millipore | SCGPT05RE | |
| Minutiens Insect Pins | Austerlitz | M size 0.15 mm | |
| Compact Pet Trimmer | Wahl Clipper Corp. | Model 9966 | Clean after each use |
References
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