Summary
Mutationer i kisspeptin receptorn (KISS1R) är associerade med reproduktionsstörningar hos patienter. Här beskriver vi hur man kan införa mutationer av intresse för GC-rika sekvens av KISS1R samt användning av KISS1R konstruktioner att karakterisera nedbrytningsvägen av receptorn genom immunoprecipitation och Western Blot
Abstract
Den kisspeptin receptor (KISS1R) är en G-proteinkopplade receptor erkänd som utlöser av puberteten och en regulator av reproduktiv kompetens i vuxen ålder 1,2,3. Inaktiverande mutationer i KISS1R identifierats hos patienter som har förknippats med iodiopathic hypogonadotropic hypogonadism (IHH) 1,2 och tidig pubertet 4. Funktionella studier av dessa mutanter är avgörande för vår förståelse av mekanismerna bakom regleringen av reproduktionen av denna receptor samt de forma sjukdomsföljder, till följd av onormala KISS1R signalering och funktion. Men gör den mycket GC-rika sekvensen av KISS1R genen det ganska svårt att införa mutationer eller förstärka kodar denna receptor med PCR.
Här beskriver vi en metod för att introducera mutationer av intresse i denna mycket GC-rika sekvens som har använts framgångsrikt för att generera mer än en mutanter dussin KISS1R i vårt laboratorium. Vi har optimerat PCR-förhållanden för att underlätta förstärkningen av en rad KISS1R mutanter som inkluderar ersätta, stryka eller införanden i KISS1R sekvens. Tillägget av en PCR-förstärkare lösning, samt en liten del av DMSO var speciellt användbart för att förbättra förstärkning. Detta optimerade proceduren kan vara användbar för andra GC-rika mallar också.
Uttrycket Vektorn kodar för KISS1R är använts för att karaktärisera signalering och funktion av denna receptor för att förstå hur mutationer kan ändra KISS1R funktion och leda till tillhörande reproduktiva fenotyper. Därför kan potentiella tillämpningar KISS1R mutanter som genereras av plats riktad mutagenes kan illustreras av många studier 1,4,5,6,7,8. Som ett exempel har gain-of-funktion mutation i KISS1R (Arg386Pro), som är förknippade med tidig pubertet, har visats förlänga lyhördhet av receptorn till ligand stimulering 4 samt ändra nedbrytningshastigheten hos KISS1R 9 . Intressant, våra studier visar att KISS1R bryts ned av proteasom, i motsats till den klassiska lysosomalt nedbrytning beskrivs för de flesta G-proteinkopplade receptorer 9. I exemplet som presenteras här är nedbrytning av KISS1R undersökts i humana embryonala njur celler (HEK-293) övergående uttrycker Myc-märkta KISS1R (MycKISS1R) och behandlas med proteasom eller lysosome hämmare. Cell lysates är immunoprecipitated med en agaros-konjugerat anti-Myc antikropp följt av Western Blot analys. Påvisande och kvantifiering av MycKISS1R på blots utförs med hjälp av LI-COR Odyssey IR System. Denna metod kan vara användbar i studiet av nedbrytning av andra proteiner av intresse också.
Protocol
1. Site-directed mutagenes av högt GC-rika KISS1R gensekvens
- Mall: fullständig cDNA sekvensen av människans KISS1R med Myc-tag smält till dess N-terminus. Denna sekvens är klonad i pCS2 + uttrycket vektor, som är kompatibel med däggdjur cellinjer därefter används för transfections. Detta uttryck vektorn är i kallad pCS2 + Myc KISS1R.
- Primer design: grundfärger avsedda för önskad mutationer, enligt anvisningarna i QuikChange Site-Directed Mutagenes kit (Stratagene). I sammanfattning:
- Både (framåt och bakåt) grundfärg måste innehålla önskad mutation och glödga till samma sekvens på motsatta delar av plasmiden (t.ex. framåt och bakåt primers kompletterar varandra)
- Primers ska 25 till 45 baser lång och slutar i en eller flera C eller baser G
- Infört mutation (er) ska vara i mitten av primer och flankeras av ~ 10-15 baser i rätt ordning på båda sidor
- Smälttemperatur (Tm) av primers bör vara lika med eller större än 78 ° C. Använd följande formler för att uppskatta Tm:
- Vid införande av mutationer: Tm = 81,5 + 0,41 (% GC) - 675 / N -% mismatch (N är det primer längd i baser)
- Vid införande av tillägg eller borttagningar av: Tm = 81,5 + 0,41 (% GC) - 675 / n (n inte innehåller de baser som håller på att infogas eller tas bort)
- Använd desalted primers (ingen ytterligare rening behövs).
- Både (framåt och bakåt) grundfärg måste innehålla önskad mutation och glödga till samma sekvens på motsatta delar av plasmiden (t.ex. framåt och bakåt primers kompletterar varandra)
- Den bästa förstärkningen Villkoren omfattar tillägg av PCRx Enhancer lösning (Invitrogen) och DMSO. Minst två koncentrationer av DMSO, t.ex. 4% och 8%, bör testas. PCR-förhållanden visas i Tabell I och Figur 1, och resultatet av en representant PCR-amplifiering av pCS2 + MycKISS1R visas i figur 2.
- Eliminera föräldrarnas DNA på förstärkning produkter från rötning av metylerade DNA med DpnI för 1h 30min vid 37 ° C: Blanda i ett centrifugrör 17.5μl av PCR-produkten med 2μl av 10x NEBuffer 4 och 0.5μl av DpnI (10U, New England Biolabs).
- Förvandla DpnI behandlade PCR-produkt: blanda 2μl av DpnI-behandlade DNA med 45μl av XL10-Guld Ultracompetent E. coli (Stratagene) i pre-kylda 15 ml cellodling rör. Lägg 2μl av β-merkaptoetanol och följ Stratagene instruktioner. Plate 100-400μl transformerade bakterier i LB-agarplattor innehållande 100μg/ml ampicillin och inkubera vid 37 ° C.
- Miniprep 2 till 4 individuella kolonierna för att isolera plasmid-DNA. Bekräfta det framgångsrika införandet av önskade mutationer av sekvensering och analys av isolerade DNA.
2. Övergående transfektion av MycKISS1R i HEK-293 celler
- Följande experiment utförs i humana embryonala njur celler (HEK-293) odlas i en CO 2-inkubator (5% CO 2) vid 37 ° C i DMEM kompletterad med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin / streptomycin.
- Seed HEK-293 celler vid 2.5x10 5 celler / ml i 6-brunnars plattor och låta dem växa över natten vid 37 ° C före transfektion. OBS: (i) använda tre exemplar brunnar för varje experimentell tillstånd, (ii) idealiska cell sammanflödet vid tidpunkten för transfektion är 30% -50%.
- Transfektera HEK-293 celler med Reagent GenePorter Transfektion (Genlantis) enligt tillverkarens anvisningar: Blanda hälften av serumfritt DMEM med 0.5μg pCS2 + MycKISS1R plus 0.5μg kontroll (tom) vektorn till totalize 1μg av DNA / brunn. Blanda den andra halvan med 10μl transfektion reagens per mikrogram transfekterade av DNA. OBS: Perfekt plasmid-DNA-koncentrationen kan variera.
3. Cell behandling och lys
- 24h efter transfektion, byt cell medium med 1ml DMEM som innehåller 2,5% FBS (för att minska cellernas ämnesomsättning). OBS: Denna minskning av serum kan underlätta och / eller förstärka detektion av resultaten.
- Lägg lysosome hämmare (100μg / brunn av Leupeptin) direkt i varje brunn på en hel 6-brunnar. Inkubera vid 37 ° C i 6 eller 16 h (eller annan önskad gånger)
- Lägg nyberedd proteasomhämmaren (10μM / brunn av MG132) direkt till alla brunnar i två hela 6-brunnars plattor. Inkubera vid 37 ° C under 2, 4, 6 eller 16 timmar (eller önskad gånger). Lägg fordon till alla brunnar i den fjärde 6-brunnar (0 tid-punkten) och inkubera vid 37 ° C i 16 timmar
- När inkubationen är över, flytta tallrikar till is och utföra hela denna lys proceduren på is för att förhindra proteinnedbrytning:
- För att öka proteinavkastning, kombinera tre exemplar på 6-brunnars plattor i en enda CENTRifuge tub
- Aspirera medelstora och tvätta cellerna en gång med 1 ml iskall fosfatbuffrad saltlösning (PBS)
- Tillsätt 100μl iskallt lyseringsbuffert (20mm HEPES, pH 7,4, 1% NP-40, 150mm NaCl, 1mm EDTA, 0,25% natriumdeoxikolat) innehållande proteashämmare (1x cocktail som innehåller 100mm AEBSF-HCl, 80μM aprotinin, 5mm bestatin, 1,5 E-64, 0,5 EDTA, 2mm leupeptin och 1mm pepstatin A, plus 2 mm PMSF) i varje brunn
- Ta bort celler med en cell skrapa och överföra celler lysates till centrifugrör
- Pass celler ~ 10 gånger genom en 20-nål. OBS: Använd inte Sonikera Prover för Western Blot detektion av membranproteiner. Sonication leder till aggregering av membranproteiner, som inte kommer att migrera korrekt under elektrofores
- Inkubera cell lysates för 1h vid 4 ° C på en gungande plattform
- Centrifugera cell lysates vid 4 ° C i 10 min vid 10000 x rpm och supernatanter övergång till nya rör. OBS: Stör ej pellets under detta steg
- Bestäm protein koncentration i 10μl av supernatanterna med BCA-metoden (Pierce)
- Späd lysates att 1mg/ml med lyseringsbuffert innehåller proteashämmare.
4. Immunoprecipitation och Western blot upptäckt av MycKISS1R
- Utför följande immunoprecipitation steg på is (eller vid 4 ° C):
- Tvätta lämplig mängd agaros-konjugerat anti-Myc antikropp (2.5μg / prov) två gånger med iskallt PBS och lägga detta till 400μg av lysat protein.
- Immunoprecipitate den MycKISS1R på lysates över natten vid 4 ° C i en gungande plattform under försiktig omrörning.
- Spinn ner agarosen pärlor av puls centrifugering vid 4 ° C (upp till 10.000 x rpm)
- Aspirera och kassera supernatanter (utan att störa pellets)
- Tvätta pärlor gång med iskall lyseringsbuffert och två gånger med iskall PBS. Invertera rör försiktigt innan spinningen
- Ressuspend kulor med antikroppar bundna MycKISS1R i 2x prov buffert som innehåller 10% β-merkaptoetanol.
- Western blot för MycKISS1R immunocomplexes:
- Värm prover i 30 min vid 37 ° C. OBS! Koka inte Proven för Western Blot detektion av membranproteiner. Liksom ultraljudsbehandling, leder kokande också sammanläggning av dessa proteiner
- Flytta rören omedelbart till is i 5 minuter
- Separata proteiner med SDS-PAGE i en 4-15% lutning gel.
- Transfer till Immobilon-FL PVDF membran (för infraröd detektion) vid 25V i 30 min i Transfer buffert (48mm Tris bas, 39mm glycin, 1,2 mm SDS, 20% metanol, pH 9,2) med hjälp av Bio-Rad halvtorr Transfer Apparater
- Tvätta membran för 5 minuter vid rumstemperatur med Tris-saltlösning (TBS) och block för 1h vid rumstemperatur med licor Odyssey blockering på en gungande plattform (alternativt kan 5% mjölk i TBS användas för att blockera icke-specifik bindning).
- Inkubera membran över natten vid 4 ° C med kanin anti-Myc antikropp (1:500) i blockerande lösning innehållande 0,1% Tween-20
- Ta bort primära antikroppen och tvättas tre gånger i 5 minuter vardera med TBS som innehåller 0,1% Tween-20 (TBST)
- Inkubera membran för 1h vid rumstemperatur med get Infra-RedDye ® 800CW-märkta anti-kanin IgG (1:10,000) i blockerande buffert som innehåller 0,1% Tween-20 och 0,01% SDS
- Ta bort sekundär antikropp, tvättas tre gånger av fem minuter vardera med TBST och en sista gång med TBS bara (för att avlägsna kvarvarande Tween-20)
- Avbildning och kvantifiering av MycKISS1R med LI-COR Odyssey infraröd Imager:
- Den MycKISS1R på membranen kommer att avbildas med LI-COR Odyssey infraröd Imager. Till att börja placera membranet på nedre vänstra hörnet av Odyssey skanner, rikta in den mot nätet. Täck med gummimatta, jämna ut bubblor med rulle och stäng locket
- Skapa ett nytt projekt fil på datorn. Namnge filen, klicka på "Klar" och skriv sedan in skannern logga in på "scan". Storlek skannern konsolen rutan för att passa din membran och välj sedan 169μm upplösning och medelhög bildkvalitet
- Välj intensitet inställningar för 700 (röd) och 800 (grön) kanaler i förhållande till förväntade styrka varje signal. Detta är för ändamål signal visualisering bara och kommer inte att påverka kvantifiering. Klicka på "Start scan"
- Namn och spara skanningen, klicka på "OK" för att öppna den på ett nytt fönster för kvantifiering. MycKISS1R monomerer skall vara synliga vid ungefär 43kD
- Med "box"-verktyget (den vänstra sidofältet), rita en ruta runt den första bandet. Dra en ruta runt för att se alla band passa in, sedan "kopiera" och "klistra" lådan över alla band
- Markera alla rutor med hjälp av "Ctrl + A" och sedan välja alternativet att subtrahera median bakgrund. Klicka på "rapport" på den övre menyn och ett kalkylblad med kvantifiering värdena visas. Representativa resultat som visas här är represented som vik-ökning jämfört med obehandlade celler (tid noll)
5. Representativa resultat:
- Site-directed mutagenes av högt GC-rika KISS1R gensekvens:
Tabell 1. Visar kombinationen av reagenser för att förbättra effektiviteten i KISS1R förstärkning. Denna kombination är framgångsrikt använts för att introducera flera mutationer riktade mot olika regioner av KISS1R cDNA sekvensen, samt för förstärkning av denna mycket GC-rika genen. Figur 1 visar cykling och förstärkning villkor för mutagenes av KISS1R. Dessa villkor har ändrats från QuikChange Site-Directed Mutagenes kit (Stratagene).
Figur 2. Visar ett representativt resultat med denna optimerat protokoll. Tillsatsen av 4% eller 8% DMSO kombination med PCRx Enhancer förbättrar avsevärt avkastning av förstärkning av GC-rika KISS1R cDNA-innehållande plasmiden. I detta representativa experiment, under förutsättning att 4% DMSO något bättre förstärkning villkor jämfört med 8% DMSO. Omvandling av DpnI-behandlade förstärkning produkter med ultracompetent E. coli ger vanligtvis 100 till över 1.000 kolonier, och andelen framgångsrika införandet av önskad mutationer är 80-90% som bestäms av DNA-sekvensering. - Användning av MycKISS1R konstruktioner för att studera receptor fysiologi:
I detta representativa experiment, den vilda typen pCS2 + MycKISS1R förstärks enligt den optimerat protokoll som beskrivs här används för att studera in vivo KISS1 receptor nedbrytning i en relevant cellinje (HEK-293) tillfälligt uttrycka MycKISS1R. Efter att behandla transfekterade HEK-293 celler med lysosome (leupeptin) eller proteasom (MG132) hämmare Enligt protokollet som beskrivs i metoder, de celler lyseras och bearbetas för Western blot. Den övre panelen i Figur 3 visar genomsökning av MycKISS1R monomerer medan den nedre panelen visar kvantifiering av banden som visas på övre panelen. Kvantifiering av banden visar att varken 6h eller 16h i leupeptin behandling påverkas MycKISS1R protein nivåer. Omvänt resulterade behandling med MG132 på en tidsberoende ökning MycKISS1R protein i dessa celler, som kulminerar med en 45-faldig ackumulering av receptorn efter 16h inkubering med MG132. Dessa observationer tyder på att, till skillnad från de flesta G-proteinkopplade receptorer, är KISS1R ned av proteasom (snarare än lysosome).
| DMSO | |||
| Reagenser | 0 | 4% | 8% |
| Vatten | 35 | 33 | 31 |
| 10x Pfu Ultra Taq buffert | 5 | 5 | 5 |
| dNTP mix (10mm) | 1 | 1 | 1 |
| Primer mening (25pmol/μl) | 1 | 1 | 1 |
| Primer antisens (25pmol/μl) | 1 | 1 | 1 |
| 10x PCRx Enhancer Solution | 5 | 5 | 5 |
| DMSO | 0 | 2 | 4 |
| PFU Ultra Taq-polymeras (2.5U/μl) | 1 | 1 | 1 |
| plasmid-DNA (20ng/μl) | 1 | 1 | 1 |
Tabell 1. Kombination av reagenser framgångsrikt använts för att mutera och förstärka GC-rika KISS1R
Figur 1. Cykling villkor för framgångsrik mutagenes och förstärkning av GC-rika KISS1R: En 2min hot start följdes av 18 cykler på 30 sek smälter vid 95 ° C, 1 min anlöpning vid 55 ° C och 6 min förlängning vid 68 ° C. En ytterligare 10 min förlängning vid 68 ° var C läggas till i slutet av förra cykeln. Dessa inställningar justerades från den ursprungliga mutagenes protokollet av QuikChange II XL-Site-Directed Mutagenes kit (Stratagene).
Figur 2. Visualisering av GC-rika pCS2 + Myc KISS1R förstärks i närvaro eller frånvaro av DMSO: Fem l alikvoter av pCS2 + Myc KISS1R förstärks i närvaro av 0, 4 eller 8% DMSO lästes in i denna representativa 1% agarosgel färgas med Ethidium bromid och visualiseras med hjälp av UV-ljus. Den plasmid band 6kB är synliga på båda banor laddade med PCR-produkter förstärks i närvaro av 4% och 8% DMSO, men inte på den första banan, som var lastat med en PCR-produkten förstärks i avsaknad av DMSO.
Figur 3. Effekt av leupeptin eller MG132 på nivåer av Myc KISS1R protein i HEK-293 celler: HEK-293 celler som uttrycker Myc KISS1R behandlades med 100μg/ml leupeptin eller 10μM MG132 vid 37 ° C för den utsedda tider. Myc KISS1R på 400μg av cell lysat var immunoprecipitated med 2.5μg av agaros-konjugerat anti-Myc antikropp och analyseras av Western Blot. (A) LI-COR Odyssey detektering av Myc KISS1R efter inkubation av immunoblots med kanin anti-Myc-taggen antikroppar följt av inkubering med IRDye 800CW-märkta anti-kanin, (B) Kvantifiering av Myc KISS1R band visas i (A) med LI-COR Odyssey kvantifiering programvara. Resultaten representeras som vika-ökning jämfört med obehandlade celler (tid 0).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Site-directed mutagenes har använts för att studera proteiners funktion genom att införa nukleotid förändringar i kodande sekvens av riktade gener i över tre decennier. Den ursprungliga tekniken beskrevs 1978 av den brittisk-kanadensiska kemist och nobelpristagaren Michael Smith 10. Michael Smith delade 1993 Nobelpriset i kemi med Kary Mullis, den amerikanska Biokemisten som uppfann polymeraskedjereaktion (PCR) 11. Den ursprungliga metod som beskrivs av Michael Smith har förbättrats under åren. Möjligheten att introducera mutationer, infogningar eller strykningar till önskad gensekvens i en enda PCR-reaktionen har bidragit till den höga noggrannhet och träffsäkerhet i detta förfarande, liksom för produktionen av mutanter på relativt kort tid.
Trots alla tekniska förbättringar, mutationer och amplifiering av mycket GC-rika gensekvenser som KISS1R är särskilt besvärande. Storleken på grundfärg avsedd för mutagenes av hög GC innehåll sekvenser måste anpassas för att rymma GC innehåll så att smälttemperaturen är inom det rekommenderade intervallet. Därför primers att införa mutationer i KISS1R är dimensionerade för att ha en smältpunkt på mellan 78 ° -86 ° C. Några av de KISS1R genen regionerna har en GC-halt på över 85%. Storleken på primers syftar till att införa mutationer i dessa områden måste anpassas för att möta olika smältpunkt som nämns ovan. Grundfärger med smältpunkter över denna gräns får inte dela vid 95 ° C, försämrar förstärkning. Å andra sidan, primers med Tm lägre än 78 ° C är mer benägna att binda till och förstärker icke-specifika sekvenser.
Likaså är förstärkning villkor och reagenser optimerad för höga GC innehåll sekvens av KISS1R. En kombination av 4% DMSO och en PCR-Enhancer Solution från Invitrogen (Tabell 1 och Figur 2) visas att öka förstärkningen effektivitet KISS1R. Alternativt har andra reagenser som betain använts framgångsrikt för att förbättra förstärkningen av andra GC-rika sekvenser 12,13. Det fanns dock ingen märkbar positiv effekt av betain på KISS1R förstärkning i våra händer. Dessutom kan PCR-förstärkare lösningar som finns från andra leverantörer vara lika kunna förbättra förstärkning av GC-rika sekvenser.
Använda optimerade inställningar som beskrivs här har vi med framgång infört flera mutationer i olika regioner i KISS1R cDNA, som omfattade upp till 6 nukleotid ändringar på en gång (som bärs av samma primers) och strykningen av upp till 27 nukleotider. Omvandling av dessa mutanter genererade hundratals till tusentals kolonier med en hög (80-90%) bland kolonier som innehåller rätt muterade sekvensen bekräftas genom DNA-sekvensering.
Site-directed mutagenes kan också användas för att lägga antigen taggar t.ex. Myc eller flagga till aminosyror eller terminala karboxylgrupp proteiner. Dessa taggar tillåter selektiv immunoprecipitation och / eller upptäckt av proteiner och är särskilt användbara när tillförlitlig antikroppar mot proteinet av intresse inte finns tillgängliga, som för KISS1R. I exemplet som presenteras här, är uttrycket vektor kodning för KISS1R, som är smält till ett elva aminosyra Myc-tag på sin amino-terminus (Mina cKISS1R), som används för att studera nedbrytningsvägen för KISS1R i HEK-293 celler. Effektiviteten i transfektion av HEK-293 celler med min cKISS1R enligt den metod som beskrivs här är 25-30%. Således är immunoprecipitation används för att koncentrera mina cKISS1R från cell lysates därmed förbättra detektion och visualisering av receptorn. Denna metod används ofta för att underlätta visualisering av proteiner uttryckt endogent på låga nivåer och 14.
Viktigt bör G-proteinkopplade receptorer som KISS1R, liksom andra proteiner membran, inte homogeniseras genom ultraljudsbehandling eller kokas innan gel lastning. Även om dessa förfaranden vanligtvis används för att bearbeta prover för immunoprecipitation eller Western Blot, ultraljudsbehandling och kokande leda till aggregering av membranproteiner, försämrar deras rätta migration under elektrofores 15. Faktum är att byte av dessa förfaranden med mildare homogenisering, såsom nål-passage, och lägre prov uppvärmning, såsom 37 ° C i 30 min (i stället för kokning) krävs för detektion av KISS1R monomerer.
Immunoprecipitated Min cKISS1R detekteras med hjälp av Odyssey Imager (LI-COR Biosystems) efter inkubation av blots med infraröd färg-konjugerade sekundära antikroppar. Fördelarna med detta system inkluderar ett uthålligt stark signal som kan detekteras med hög noggrannhet i månader, i motsats till den kortlivade signal som skickas av kemiluminiscens. Dessutom erbjuder kvantifiering programvara Odyssey Imager störrekänslighet och linjäritet för upptäckt jämfört med traditionella kvantifiering av skannade x-ray-filmer efter kemiluminiscens. Kan dock upptäckt av pepparrot (HRP)-konjugerade antikroppar kemiluminiscens användas också.
Frånvaron av klassisk lysosomala förnedring och upptäckt av proteasomal nedbrytning av KISS1R som beskrivs här i HEK-293 celler har också observerats i COS-7 celler transfekterade med samma MycKISS1R uttryck vektor 9. Även ovanliga, proteasomal nedbrytningen av G-proteinkopplade receptorer har tidigare rapporterats i litteraturen 16,17.
Sammanfattningsvis visar detta manuskript hur man undersöka effekten av genetiska mutationer i KISS1R genen, som är en mycket GC-rika sekvensen, för att förstå hur mutationer i denna receptor kan leda till reproduktiva sjukdom fenotyper som hypogonadotropic hypogonadism eller tidig pubertet .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har delvis finansierats av reproduktiv förgrena sig av det nationella institutet för barns hälsa och mänsklig utveckling (NICHD - K21 HD059015) och av Charles H. Hood Foundation Young Investigator Child Health Research Award (Boston, MA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PCRx Enhancer Solution | Invitrogen | 52391 | |
| PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase Alternative Detergent | Stratagene, Agilent Technologies | 600385 | |
| Dpn-I | New England Biolabs | R0176 | |
| XL10-Gold Ultracompetent E. coli cells | Stratagene, Agilent Technologies | 200314 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Geneporter Transfection Reagent | Genlantis | T201007 | |
| Leupeptin | Calbiochem | 108975 | |
| MG132 | Calbiochem | 47491 | |
| 10xPBS | Ambion | AM9625 | |
| Protease inhibitor cocktail and PMSF | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-24948 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 23225 | |
| anti-Myc tag (clone 4A6) agarose conjugate | EMD Millipore | 16-219 | |
| 2x loading buffer | Bio-Rad | 161-0737 | |
| Criterion Tris-HCl precast gel, 4-15% gradient | Bio-Rad | 345-0028 | |
| Immobilon-FL PVDF membrane | EMD Millipore | IPFL00010 | |
| Odyssey Blocking Buffer | LI-COR Biosciences | 927-40000 | |
| 10xTBS | Bio-Rad | 170-6435 | |
| Rabbit anti-myc antibody | Cell Signaling Technology | 2272 | |
| Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR Biosciences | 926-32211 | |
| Odyssey Imaging Infrared System | LI-COR Biosciences | ||
| Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 78430 |
References
- Seminara, S. B., Messager, S., Chatzidaki, E. E. The GPR54 Gene as a Regulator of Puberty. N Engl J Med. 349, 1614-1627 (2003).
- de Roux, N., Genin, E., Carel, J. C. Hypogonadotropic Hypogonadism Due to Loss of Function of the KiSS1-Derived Peptide Receptor GPR54. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 10972-10976 (2003).
- Messager, S., Chatzidaki, E. E., Ma, D. Kisspeptin Directly Stimulates Gonadotropin-Releasing Hormone Release via G Protein-Coupled Receptor 54. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1761-1766 (2005).
- Teles, M. G., Bianco, S. D., Brito, V. N. A GPR54-Activating Mutation in a Patient with Central Precocious Puberty. N Engl J Med. 358, 709-715 (2008).
- Tenenbaum-Rakover, Y., Commenges-Ducos, M., Iovane, A. Neuroendocrine Phenotype Analysis in Five Patients with Isolated Hypogonadotropic Hypogonadism due to a L102P Inactivating Mutation of GPR54. J Clin Endocrinol Metab. 92, 1137-1144 (2007).
- Semple, R. K., Achermann, J. C., Ellery, J. Two Novel Missense Mutations in G Protein-Coupled Receptor 54 in a Patient with Hypogonadotropic Hypogonadism. J Clin Endocrinol Metab. 90, 1849-1855 (2005).
- Wacker, J. L., Feller, D. B., Tang, X. B. Disease-Causing Mutation in GPR54 Reveals the Importance of the Second Intracellular Loop for Class A G-Protein-Coupled Receptor Function. J Biol Chem. 283, 31068-31078 (2008).
- Szereszewski, J. M., Pampillo, M., Ahow, M. R. GPR54 regulates ERK1/2 activity and hypothalamic gene expression in a Galpha(q/11) and beta-arrestin-dependent manner. PLoS One. 5, e12964-e12964 (2010).
- Bianco, S. D. C., Vandepas, L., Correa-Medina, M., Gereben, B., Mukherjee, A., Kuohung, W., Carroll, R., Teles, M. G., Latronico, A. C., Kaiser, U. B. KISS1R Intracellular Trafficking and Degradation: Effect of the Arg386Pro Disease-Associated Mutation. Endocrinology. , Forthcoming (2011).
- Hutchison, C. A., Phillips, S., Edgell, M. H. Mutagenesis at a Specific Position in a DNA Sequence. J Biol Chem. 253, 6551-6560 (1978).
- Mullis, K. B. The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction. Sci Am. 262, 56-61 (1990).
- Henke, W., Herdel, K., Jung, K., Schnorr, D., Loening, S. A. Betaine improves the PCR amplification of GC-rich DNA sequences. Nucleic Acids Res. 25, 3957-3958 (1997).
- Sahdev, S., Saini, S., Tiwari, P., Saxena, S., Singh Saini, K. Amplification of GC-rich genes by following a combination strategy of primer design, enhancers and modified PCR cycle conditions. Mol Cell Probes. 21, 303-307 (2007).
- Kong, K. C. Chapter 10. MSTA. in G Protein-Coupled Receptors: Essential Methods. Poyner, D. R., Wheatly, M. , Wiley-Blackwell. 197-204 (2010).
- Hall, R. A. Chapter 9. G protein-Coupled Receptor-Protein Interactions. George, S. R., O'Dowd, B. F. , John Wiley & Sons, Inc. 170-171 (2005).
- Chaturvedi, K., Bandari, P., Chinen, N., Howells, R. D. Proteasome Involvement in Agonist-Induced Down-Regulation of Mu and Delta Opioid Receptors. J Biol Chem. 276, 12345-12355 (2001).
- Shenoy, S. K., McDonald, P. H., Kohout, T. A., Lefkowitz, R. J. Regulation of Receptor Fate by Ubiquitination of Activated Beta 2-Adrenergic Receptor and Beta-Arrestin. Science. 294, 1307-1313 (2001).
