Summary
Kisspeptin रिसेप्टर (KISS1R) में उत्परिवर्तनों रोगियों में प्रजनन विकारों के साथ जुड़े रहे हैं. यहाँ हम का वर्णन कैसे KISS1R के जीसी अमीर अनुक्रम में के रूप में अच्छी तरह से KISS1R constructs का उपयोग immunoprecipitation और पश्चिमी धब्बा द्वारा रिसेप्टर की गिरावट मार्ग विशेषताएँ के रूप में ब्याज की म्यूटेशनों शुरू करने के लिए.
Protocol
1. साइट - निर्देशित अत्यधिक जीसी - अमीर KISS1R जीन अनुक्रम के mutagenesis
- साँचा: एक एन टर्मिनस से इनकार Myc टैग के साथ मानव KISS1R का पूरा सीडीएनए अनुक्रम. इस अनुक्रम pCS2 + अभिव्यक्ति वेक्टर, जो बाद transfections के लिए इस्तेमाल किया स्तनधारी सेल लाइनों के साथ संगत है में क्लोन है. यह अभिव्यक्ति वेक्टर pCS2 + Myc KISS1R के रूप में इस के साथ साथ करने के लिए भेजा है.
- प्राइमर डिजाइन: प्राइमरों वांछित म्यूटेशनों ले लिए डिज़ाइन कर रहे हैं Quikchange साइट निर्देशित mutagenesis किट (Stratagene) के निर्देशों के अनुसार. सारांश में:
- दोनों प्राइमरों (आगे और रिवर्स) वांछित उत्परिवर्तन होते हैं और उसी क्रम प्लाज्मिड के विपरीत किस्में पर पानी रखना चाहिए (जैसे आगे और रिवर्स प्राइमरों एक दूसरे के पूरक हैं)
- प्राइमर्स एक या एक से अधिक सी या जी अड्डों में 25 से 45 ठिकानों लंबे और अंत होना चाहिए
- परिचय उत्परिवर्तन (ओं) प्राइमर के बीच में हो सकता है और दोनों पक्षों पर ~ 10-15 कुर्सियां सही अनुक्रम के द्वारा flanked चाहिए
- प्राइमरों के पिघलने के तापमान (टीएम) के बराबर है या 78 सी. सेंटीग्रेड से अधिक होना चाहिए निम्न सूत्रों का उपयोग Tm अनुमान:
- जब म्यूटेशनों शुरू: tm = 81.5 + (% जीसी) 0.41 - 675 N / -% बेमेल (एन अड्डों में प्राइमर लंबाई है)
- जब सम्मिलन या हटाना शुरू: tm = 81.5 + (% जीसी) 0.41 - 675 / N (एन कुर्सियां जो डाला जा रहा है कर रहे हैं या नष्ट कर दिया शामिल नहीं करता है)
- Desalted प्राइमरों (आवश्यक नहीं आगे purifications) का उपयोग करें.
- दोनों प्राइमरों (आगे और रिवर्स) वांछित उत्परिवर्तन होते हैं और उसी क्रम प्लाज्मिड के विपरीत किस्में पर पानी रखना चाहिए (जैसे आगे और रिवर्स प्राइमरों एक दूसरे के पूरक हैं)
- सबसे अच्छा प्रवर्धन शर्तें PCRx बढ़ाने (Invitrogen) समाधान और DMSO के अलावा शामिल हैं. DMSO के कम से कम 2 सांद्रता, 4% और 8% के रूप में परीक्षण किया जाना चाहिए. और pCS2 + MycKISS1R के एक प्रतिनिधि पीसीआर प्रवर्धन के परिणाम चित्रा 2 में दिखाया गया है, पीसीआर स्थितियों टेबल और मैं चित्रा 1 में दिखाए जाते हैं.
- DpnI के साथ डीएनए methylated के पाचन द्वारा 30min 1 के लिए 37 प्रवर्धन उत्पादों पर माता पिता के डीएनए हटा दें डिग्री सेल्सियस: पीसीआर उत्पाद के एक अपकेंद्रित्र ट्यूब 17.5μl में 10x NEBuffer के 4 2μl और DpnI के (10U, न्यू इंग्लैंड Biolabs) 0.5μl के साथ मिश्रण.
- 45μl XL10 - गोल्ड Ultracompetent ई. के साथ DpnI इलाज डीएनए के मिश्रण 2μl: रूपांतरण पीसीआर उत्पाद DpnI का इलाज पूर्व ठंडा 15 मिलीलीटर सेल संस्कृति ट्यूब में कोली (Stratagene). Β-mercaptoethanol के 2μl जोड़ें और Stratagene निर्देशों का पालन करें. लेग बाइ अगर 37 पर 100μg/ml एम्पीसिलीन और सेते युक्त प्लेटों में तब्दील जीवाणुओं की 100 400μl प्लेट डिग्री सेल्सियस
- Miniprep 2 से 4 व्यक्ति कालोनियों प्लास्मिड डीएनए को अलग करने के लिए. अनुक्रमण और पृथक डीएनए के विश्लेषण के द्वारा वांछित परिवर्तन के सफल शुरूआत की पुष्टि.
2. HEK-293 कोशिकाओं में MycKISS1R के क्षणिक अभिकर्मक
- निम्नलिखित प्रयोगों मानव भ्रूण गुर्दे की कोशिकाओं (HEK-293) 37 पर सीओ 2 इनक्यूबेटर (5% सीओ 2) में सभ्य में प्रदर्शन कर रहे हैं ° सी DMEM में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक है.
- बीज - HEK 2.5x10 5 कोशिकाओं / एमएल 293 6 अच्छी तरह प्लेटें में कोशिकाओं और उन्हें 37 पर रातोंरात बढ़ने ° सी अभिकर्मक पहले. नोट: (i) प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत के लिए तीन प्रतियों कुओं का उपयोग, (ii) अभिकर्मक के समय पर आदर्श सेल संगम 30% -50% है.
- Transfect HEK 293 GenePorter अभिकर्मक अभिकर्मक (Genlantis) का उपयोग कोशिकाओं निर्माता के निर्देशों के अनुसार: मिक्स सीरम मुक्त DMEM के साथ आधा 0.5μg pCS2 + MycKISS1R प्लस 0.5μg नियंत्रण (खाली) सदिश डीएनए / अच्छी तरह से 1μg एकत्रित करना. ट्रांसफ़ेक्ट डीएनए के μg प्रति 10μl अभिकर्मक अभिकर्मक के साथ दूसरे आधे से मिक्स कर लें. नोट: आदर्श प्लाज्मिड डीएनए एकाग्रता भिन्न हो सकते हैं.
3. सेल उपचार और lysis
- अभिकर्मक के बाद 24 घंटों, 1ml DMEM 2.5% FBS (सेल चयापचय में कमी) युक्त के साथ सेल मध्यम जगह. नोट: सीरम में इस कमी की सुविधा और / या हो सकता है परिणामों का पता लगाने के बढ़ाना.
- एक पूरी थाली 6 अच्छी तरह के प्रत्येक अच्छी तरह से में सीधे lysosome अवरोध करनेवाला (100μg / Leupeptin की अच्छी तरह से) जोड़ें. डिग्री सेल्सियस 6 या 16 घंटे के लिए (या अन्य वांछित बार) 37 सेते
- दो पूरे 6 अच्छी तरह से प्लेटों के सभी कुओं में सीधे हौसले से तैयार एंटीबॉडी अवरोध करनेवाला (10μM / अच्छी तरह MG132) जोड़ें. ° 2, 4, 6, या 16h (या वांछित बार) के लिए सी 37 पर सेते हैं. चौथे 6-अच्छी तरह से थाली (0 समय बिंदु) के सभी कुओं में वाहन जोड़ें और 37 पर सेते ° सी 16h के लिए
- जब ऊष्मायन खत्म हो गया है, बर्फ प्लेटें चाल और प्रोटीन गिरावट को रोकने के लिए बर्फ पर इस पूरे lysis प्रक्रिया प्रदर्शन:
- प्रोटीन उपज में वृद्धि करने के लिए, एक एकल centr में 6 अच्छी तरह प्लेटें पर triplicates गठबंधनifuge ट्यूब
- मध्यम और धोने की कोशिकाओं 1ml बर्फ ठंड फॉस्फेट के साथ एक बार Aspirate खारा (पीबीएस) buffered
- बहुत ठंडा lysis बफर का 100μl (20mm HEPES, 7.4 पीएच, 1% एनपी 40, 150mm NaCl, 1mm EDTA, 0.25% सोडियम deoxycholate) protease inhibitors (1x AEBSF 100mm - एचसीएल, 80μM aprotinin, 5mm bestatin युक्त कॉकटेल युक्त जोड़ें, 1.5mm E-64, 0.5m EDTA, 2mm leupeptin और 1mm pepstatin एक, प्लस 2mm PMSF एक अच्छी तरह से)
- एक सेल खुरचनी और हस्तांतरण सेल कोशिकाओं के साथ निकालें ट्यूबों अपकेंद्रित्र lysates
- कोशिकाओं को एक 20 गेज सुई के माध्यम से दर्रा ~ 10 बार. नोट: नमूने sonicate झिल्ली प्रोटीन के पश्चिमी धब्बा पता लगाने के लिए इरादा नहीं है. Sonication झिल्ली प्रोटीन का एकत्रीकरण, जो ठीक से वैद्युतकणसंचलन के दौरान विस्थापित नहीं होगा करने के लिए सुराग
- 1 के लिए सेल lysates एक कमाल मंच पर 4 ° C पर सेते
- 4 में अपकेंद्रित्र सेल lysates ° सी 10,000 एक्स rpm और नए ट्यूबों के लिए स्थानांतरण supernatants से कम 10 मिनट के लिए. नोट: छर्रों इस कदम के दौरान परेशान नहीं
- बीसीए विधि का उपयोग supernatants के 10μl में प्रोटीन एकाग्रता (पियर्स) निर्धारित
- Lysates lysis बफर युक्त protease inhibitors के साथ 1mg/ml पतला.
4. Immunoprecipitation और पश्चिमी MycKISS1R के दाग का पता लगाने
- बर्फ पर निम्नलिखित immunoprecipitation कदम (या 4 डिग्री सेल्सियस) का प्रदर्शन:
- Agarose संयुग्मित विरोधी myc एंटीबॉडी (2.5μg नमूना /) की उचित मात्रा में ठंडा पीबीएस के साथ दो बार धो lysate प्रोटीन की 400μg को जोड़ने के लिए.
- Lysates पर MycKISS1R Immunoprecipitate 4 में रातोंरात ° सी कोमल आंदोलन के साथ एक कमाल मंच में.
- नीचे 4 agarose मोती स्पिन पल्स centrifugation द्वारा डिग्री सेल्सियस (अप करने के लिए 10,000 rpm x)
- Aspirate और supernatants (छर्रों परेशान बिना) त्यागें
- बहुत ठंडा lysis बफर के साथ और दो बार ठंडा पीबीएस के साथ मोती एक बार धो. कताई पहले ट्यूबों धीरे उलटें
- Ressuspend 2x नमूना लोड हो रहा है जिसमें 10% β-mercaptoethanol बफर में एंटीबॉडी बाध्य MycKISS1R युक्त मोती.
- MycKISS1R immunocomplexes के पश्चिमी धब्बा:
- 37 पर 30 मिनट ° सी. नोट के लिए हीट नमूने: झिल्ली प्रोटीन के पश्चिमी धब्बा पता लगाने के लिए इरादा नमूने नहीं फोड़ा करो . Sonication की तरह, उबलते भी इन प्रोटीनों के एकत्रीकरण के लिए होता है
- ट्यूब तुरंत 5 मिनट के लिए बर्फ में ले जाएँ
- एक 4-15% ढाल जेल में एसडीएस PAGE द्वारा अलग प्रोटीन.
- 25V पर स्थानांतरण बफर में 30 मिनट (48mm Tris आधार, 39mm ग्लाइसिन, 1.2mm एसडीएस, 20% मेथनॉल, 9.2 पीएच) जैव रेड - अर्ध सूखी स्थानांतरण का उपयोग के लिए Immobilon FL PVDF झिल्ली (इन्फ़रा लाल का पता लगाने के लिए) के लिए स्थानांतरण उपकरण
- कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए झिल्ली के साथ धो Tris-buffered खारा (टीबीएस) और 1 के लिए कमरे के तापमान पर Licor ओडिसी के साथ एक कमाल मंच (वैकल्पिक रूप से, टीबीएस में 5% दूध गैर विशिष्ट बंधन ब्लॉक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है) पर अवरुद्ध ब्लॉक.
- 4 में रातोंरात सेते झिल्ली ° सी खरगोश अवरुद्ध 0.1% बीच 20 युक्त समाधान में विरोधी myc एंटीबॉडी (1:500) के साथ
- प्राथमिक एंटीबॉडी निकालें और झिल्ली 5 मिनट 3 बार धोने टीबीएस के साथ प्रत्येक के 0.1% बीच 20 (TBST) युक्त
- बकरी इंफ्रा RedDye ® 800CW - लेबल विरोधी खरगोश 0.1 बीच 20% और 0.01% एसडीएस युक्त बफर अवरुद्ध में आईजीजी (1:10,000) के साथ कमरे के तापमान पर 1 के लिए झिल्ली सेते
- निकालें माध्यमिक एंटीबॉडी, झिल्ली 5 मिनट 3 बार धोने प्रत्येक TBST और एक आखिरी बार के साथ ही साथ टीबीएस (बीच - 20 शेष हटायें)
- इमेजिंग और ओडिसी लाइट - भ्रष्टाचार इंफ्रा रेड Imager का उपयोग MycKISS1R की मात्रा का ठहराव:
- झिल्ली पर MycKISS1R ओडिसी लाइट - भ्रष्टाचार इंफ्रा रेड Imager का उपयोग imaged किया जाएगा. शुरू करने के लिए, ओडिसी स्कैनर के निचले बाएँ कोने पर झिल्ली जगह है, यह ग्रिड के साथ aligning. रबर की चटाई के साथ कवर, रोलर के साथ बुलबुले बाहर चिकनी और ढक्कन बंद
- कंप्यूटर पर एक नई परियोजना फ़ाइल बनाएँ. फ़ाइल नाम क्लिक करें, और "किया" तब "स्कैन" पर स्कैनर लॉगिन दर्ज करें. आकार स्कैनर सांत्वना अपने झिल्ली फिट बॉक्स, और फिर 169μm संकल्प और मध्यम छवि गुणवत्ता का चयन
- 700 (लाल) और 800 (हरा) प्रत्येक संकेत की उम्मीद की संख्या के अनुसार चैनल के लिए तीव्रता सेटिंग्स चुनें. यह संकेत दृश्य प्रयोजनों के लिए ही है और मात्रा का ठहराव को प्रभावित नहीं करेगा. पर क्लिक करें "स्कैन शुरू"
- नाम और स्कैन सहेजें, और फिर क्लिक करें "ठीक है" यह मात्रा का ठहराव के लिए एक नई खिड़की पर खुला. MycKISS1R monomers 43kD लगभग पर दिखाई जानी चाहिए
- "बॉक्स" उपकरण (बाएँ हाथ साइडबार पर) का उपयोग करना पहली बैंड के चारों ओर एक बॉक्स आकर्षित. बॉक्स चारों ओर खींचें करने के लिए सुनिश्चित करें कि सभी बैंड में फिट करना है, तो सभी बैंड पर और "पेस्ट" बॉक्स "नकल"
- "Ctrl + ए" सभी का उपयोग कर बक्से का चयन करें, और तब मंझला पृष्ठभूमि घटाना करने के लिए विकल्प का चयन करें. शीर्ष मेनू पर "रिपोर्ट" और मात्रा का ठहराव के मूल्यों के साथ एक स्प्रेडशीट दिखाई देगा पर क्लिक करें. प्रतिनिधि यहाँ दिखाया परिणाम represe हैंnted के रूप में अनुपचारित कोशिकाओं पर गुना वृद्धि (शून्य समय)
5. प्रतिनिधि परिणाम:
- साइट - निर्देशित अत्यधिक जीसी - अमीर KISS1R जीन अनुक्रम के mutagenesis:
तालिका 1. अभिकर्मकों के संयोजन KISS1R प्रवर्धन की दक्षता में सुधार से पता चलता है. इस संयोजन को सफलतापूर्वक किया गया है कई KISS1R सीडीएनए अनुक्रम के विशिष्ट क्षेत्रों के खिलाफ निर्देशित उत्परिवर्तन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से इस अत्यधिक GC-युक्त जीन प्रवर्धन के लिए परिचय के लिए इस्तेमाल किया. चित्रा 1 KISS1R के mutagenesis के लिए साइकिल और प्रवर्धन की स्थिति से पता चलता है. QuikChange साइट निर्देशित mutagenesis किट (Stratagene) से इन शर्तों को संशोधित किया गया है.
चित्रा 2 एक प्रतिनिधि इस अनुकूलित प्रोटोकॉल का उपयोग कर परिणाम से पता चलता है. 4% या 8% PCRx बढ़ाने के साथ संयुक्त DMSO के अलावा काफी जीसी अमीर KISS1R सीडीएनए युक्त प्लाज्मिड के प्रवर्धन की उपज में सुधार . इस प्रतिनिधि के प्रयोग में, 4% DMSO के 8% DMSO की तुलना में थोड़ा बेहतर प्रवर्धन शर्तों प्रदान की. DpnI इलाज प्रवर्धन उत्पादों की ultracompetent ई. के साथ परिवर्तन कोलाई आमतौर पर 1,000 से अधिक कालोनियों के लिए 100 पैदावार, और वांछित परिवर्तन के सफल परिचय की दर 80-90% के रूप में डीएनए अनुक्रमण द्वारा निर्धारित है. - MycKISS1R constructs का उपयोग करने के लिए रिसेप्टर शरीर क्रिया विज्ञान का अध्ययन:
इस प्रतिनिधि के प्रयोग में, जंगली प्रकार pCS2 + MycKISS1R अनुकूलित प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित के लिए vivo KISS1 एक प्रासंगिक सेल लाइन में रिसेप्टर गिरावट (HEK 293) transiently MycKISS1R व्यक्त में अध्ययन किया है के अनुसार प्रवर्धित. (Leupeptin) lysosome या एंटीबॉडी तरीकों में वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार (MG132) inhibitors के साथ ट्रांसफ़ेक्ट HEK 293 - कोशिकाओं का इलाज करने के बाद, कोशिकाओं और lysed पश्चिमी धब्बा के लिए संसाधित कर रहे हैं. चित्रा 3 के शीर्ष पैनल MycKISS1R monomers के स्कैन से पता चलता है जबकि वह नीचे के पैनल शीर्ष पैनल पर दिखाया बैंड की मात्रा का ठहराव से पता चलता है है. बैंड की मात्रा का ठहराव इंगित करता है कि न तो 6 न ही leupeptin उपचार के 16h MycKISS1R प्रोटीन का स्तर प्रभावित. इसके विपरीत, MG132 के साथ इलाज इन कोशिकाओं में एक समय पर निर्भर MycKISS1R प्रोटीन में वृद्धि, जो MG132 के साथ एक 45 गुना ऊष्मायन 16h के बाद रिसेप्टर के संचय के साथ खत्म हुई. इन टिप्पणियों से संकेत मिलता है कि ज्यादातर जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स के विपरीत, KISS1R एंटीबॉडी (बजाय lysosome की तुलना में) पदावनत है है.
| DMSO | |||
| अभिकर्मकों | 0 | 4% | 8% |
| पानी | 35 | 33 | 31 |
| 10x Pfu अल्ट्रा Taq बफर | 5 | 5 | 5 |
| dNTP मिश्रण (10mm) | 1 | 1 | 1 |
| प्राइमर भावना (25pmol/μl) | 1 | 1 | 1 |
| प्राइमर antisense (25pmol/μl) | 1 | 1 | 1 |
| 10x PCRx बढ़ाने समाधान | 5 | 5 | 5 |
| DMSO | 0 | 2 | 4 |
| Pfu अल्ट्रा Taq पोलीमरेज़ (2.5U/μl) | 1 | 1 | 1 |
| प्लास्मिड डीएनए (20ng/μl) | 1 | 1 | 1 |
तालिका 1 सफलतापूर्वक करने के लिए बदलना और जीसी - अमीर KISS1R बढ़ाना अभिकर्मकों का संयोजन.
चित्रा 1. सफल और जीसी - अमीर KISS1R के mutagenesis के प्रवर्धन की साइकल चलाना स्थितियों: एक 2min गर्म शुरू 95 पर 30 सेकंड के पिघलने के 18 चक्र द्वारा पीछा किया गया था डिग्री सेल्सियस, 1 मिनट 55 68 डिग्री सेल्सियस और 6 मिनट के विस्तार पर annealing डिग्री सेल्सियस 68 एक अतिरिक्त 10 मिनट विस्तार ° सी पिछले चक्र के अंत में जोड़ा गया है. ये सेटिंग्स QuikChange द्वितीय एक्स्ट्रा लार्ज - साइट निर्देशित mutagenesis किट (Stratagene) के मूल mutagenesis प्रोटोकॉल से समायोजित किया गया.
चित्रा 2. जीसी - अमीर pCS2 + Myc KISS1R उपस्थिति या DMSO के अभाव में परिलक्षित के विज़ुअलाइज़ेशन: pCS2 के पांच μl aliquots + Myc 0 की उपस्थिति में परिलक्षित KISS1R, 4 या 8% DMSO के इस प्रतिनिधि 1% agarose जेल में भरी हुई थी ethidium साथ दाग ब्रोमाइड और यूवी प्रकाश का उपयोग कल्पना. 6Kb के प्लाज्मिड बैंड दोनों पीसीआर 4% की उपस्थिति में परिलक्षित उत्पादों और 8% DMSO के साथ भरी हुई गलियों पर दिखाई दे रहे हैं, लेकिन पहली लेन पर नहीं है, जो एक पीसीआर के साथ भरी हुई थीउत्पाद DMSO के अभाव में परिलक्षित.
चित्रा 3. Leupeptin या MG132 के Myc KISS1R प्रोटीन की HEK 293 कोशिकाओं में स्तर पर प्रभाव: HEK 293 Myc KISS1R व्यक्त कोशिकाओं 100μg/ml leupeptin या 10μM MG132 के साथ 37 पर इलाज किया गया ° सी निर्दिष्ट समय के लिए . Myc KISS1R पर 400μg सेल lysate की agarose संयुग्मित विरोधी myc एंटीबॉडी के 2.5μg साथ immunoprecipitated किया गया था और पश्चिमी धब्बा द्वारा विश्लेषण. (बी) Myc KISS1R बैंड की मात्रा में दिखाया गया है (ए) का उपयोग कर, (ए) लाइट - भ्रष्टाचार Myc KISS1R immunoblots के ऊष्मायन के बाद ओडिसी खरगोश प्रतिरक्षी विरोधी Myc टैग के साथ IRDye 800CW लेबल विरोधी खरगोश ऊष्मायन द्वारा पीछा का पता लगाने लाइट भ्रष्टाचार ओडिसी मात्रा का ठहराव सॉफ्टवेयर. परिणाम के रूप में अनुपचारित कोशिकाओं (0 बार) से अधिक गुना वृद्धि का प्रतिनिधित्व कर रहे हैं.
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Discussion
साइट - निर्देशित mutagenesis पर तीन दशकों के लिए nucleotide परिवर्तन लक्षित जीन की कोडन अनुक्रम में शुरू करने से प्रोटीन समारोह का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. मूल तकनीक 1978 में ब्रिटिश कनाडा रसायनज्ञ और नोबेल पुरस्कार विजेता माइकल स्मिथ 10 के द्वारा वर्णित किया गया था. माइकल स्मिथ Kary Mullis, अमेरिकी बायोकेमिस्ट जो पोलीमरेज़ चेन (पीसीआर) रिएक्शन 11 का आविष्कार के साथ 1993 में रसायन विज्ञान में नोबेल पुरस्कार साझा की है. मूल माइकल स्मिथ द्वारा वर्णित विधि पिछले कुछ वर्षों में सुधार किया गया है. वांछित जीन अनुक्रम में एक एकल पीसीआर प्रतिक्रिया में परिवर्तन, सम्मिलन, या हटाना परिचय करने की क्षमता उच्च सटीकता और इस प्रक्रिया की सफलता दर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से समय की एक अपेक्षाकृत छोटी अवधि में म्यूटेंट के उत्पादन के लिए योगदान दिया है.
सभी तकनीकी सुधार म्यूटेशनों और अत्यधिक जीसी अमीर KISS1R जैसे जीन दृश्यों के प्रवर्धन के बावजूद विशेष रूप से परेशानी हैं. उच्च जीसी सामग्री दृश्यों के mutagenesis के लिए डिज़ाइन किया प्राइमरों के आकार जीसी सामग्री को समायोजित इतना है कि पिघलने के तापमान की सिफारिश की सीमा के भीतर है समायोजित किया जाना चाहिए. तदनुसार, प्राइमरों KISS1R में उत्परिवर्तन परिचय 78 -86 ° डिग्री सेल्सियस के बीच एक पिघल बिंदु है आकार KISS1R जीन क्षेत्रों के कुछ 85% से अधिक की एक जीसी सामग्री है. इन क्षेत्रों में परिवर्तन परिचय डिजाइन प्राइमरों के आकार गलनांक उपर्युक्त रेंज को पूरा करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए. प्राइमर्स कि सीमा से ऊपर पिघलने अंकों के साथ 95 डिग्री सेल्सियस, आई. प्रवर्धन अलग नहीं हो सकता है. दूसरी ओर, एक Tm साथ प्राइमरों 78 से कम डिग्री सेल्सियस अधिक और गैर विशिष्ट दृश्यों बढ़ाना करने के लिए बाध्य होने की संभावना हैं.
इसी तरह, प्रवर्धन शर्तों और अभिकर्मकों KISS1R के उच्च जीसी सामग्री अनुक्रम के लिए अनुकूलित कर रहे हैं. 4% और Invitrogen (1 टेबल और चित्रा 2) से एक पीसीआर बढ़ाने समाधान DMSO का एक संयोजन KISS1R के प्रवर्धन दक्षता बढ़ाने के लिए दिखाया गया है. वैकल्पिक रूप से, betaine जैसे अन्य अभिकर्मकों को सफलतापूर्वक किया गया है अन्य जीसी अमीर 12,13 दृश्यों का प्रवर्धन में सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया. हालांकि, वहाँ KISS1R प्रवर्धन पर कोई नजर सकारात्मक betaine हमारे हाथ में प्रभाव था. इसके अलावा, अन्य आपूर्तिकर्ताओं से पीसीआर बढ़ाने समाधान उपलब्ध जीसी अमीर दृश्यों का प्रवर्धन में सुधार के समान रूप से सक्षम हो सकता है.
यहाँ वर्णित अनुकूलित सेटिंग्स का उपयोग, हम सफलतापूर्वक सीडीएनए KISS1R, जो एक ही बार में 6 nucleotide परिवर्तन (वही प्राइमरों द्वारा किया जाता) और 27 nucleotides हटाए जाने के लिए ऊपर शामिल के विशिष्ट क्षेत्रों में कई परिवर्तन शुरू . इन म्यूटेंट के परिवर्तन सही उत्परिवर्ती डीएनए अनुक्रमण द्वारा पुष्टि की अनुक्रम युक्त कालोनियों के एक उच्च दर (80-90%) के साथ कालोनियों के हजारों सैकड़ों उत्पन्न.
साइट - निर्देशित mutagenesis भी प्रतिजनी Myc या प्रोटीन के अमीनो या carboxyl टर्मिनस ध्वज के रूप में इस तरह के टैग को जोड़ने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ये टैग चयनात्मक immunoprecipitation और / या प्रोटीन का पता लगाने के के लिए अनुमति देते हैं, और विशेष रूप से उपयोगी है जब ब्याज की प्रोटीन के खिलाफ विश्वसनीय एंटीबॉडी KISS1R के लिए उपलब्ध है, के रूप में नहीं कर रहे हैं कर रहे हैं. यहाँ प्रस्तुत उदाहरण में, जो एक ग्यारह एमिनो एसिड एमिनो टर्मिनस (मेरा cKISS1R) Myc टैग से जुड़े हुए है KISS1R, के लिए अभिव्यक्ति वेक्टर एन्कोडिंग HEK 293 कोशिकाओं में KISS1R की गिरावट मार्ग का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. HEK 293 मेरा cKISS1R यहाँ वर्णित विधि का उपयोग के साथ कोशिकाओं के अभिकर्मक की क्षमता 25-30% है . इस प्रकार, immunoprecipitation सेल lysates इस प्रकार का पता लगाने और रिसेप्टर के दृश्य में सुधार से मेरा cKISS1R ध्यान केंद्रित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. यह दृष्टिकोण अक्सर को सुविधाजनक बनाने के लिए प्रोटीन के दृश्य में कम के रूप में अच्छी तरह से 14 के स्तर पर endogenously व्यक्त किया है.
महत्वपूर्ण बात है, जी KISS1R रूप में प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अन्य झिल्ली प्रोटीन, sonication द्वारा नहीं किया जा homogenized या जेल लोड हो रहा से पहले उबला हुआ. हालांकि इन प्रक्रियाओं आमतौर पर immunoprecipitation या पश्चिमी धब्बा, sonication और झिल्ली प्रोटीन के एकत्रीकरण के लिए उबलते नेतृत्व के लिए नमूने प्रक्रिया, 15 वैद्युतकणसंचलन के दौरान उनके उचित प्रवास आई. उपयोग किया जाता है. वास्तव में, जैसे सुई बीतने मामूली homogenization, और कम नमूना हीटिंग, जैसे कि 37 के साथ इन प्रक्रियाओं के प्रतिस्थापन ° 30 मिनट (बजाय उबलते) के लिए सी KISS1R monomers का पता लगाने के लिए आवश्यक है.
Immunoprecipitated मेरा cKISS1R अवरक्त डाई संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ blots के ऊष्मायन के बाद ओडिसी Imager (Biosystems लाइट - भ्रष्टाचार) का उपयोग कर पता लगाया है. इस प्रणाली का लाभ बनाए रखने के लिए मजबूत संकेत है कि महीने के लिए उच्च सटीकता के साथ पता लगाया जा सकता है, अल्पकालिक chemiluminescence द्वारा उत्सर्जित संकेत करने के लिए विरोध के रूप में शामिल हैं. इसके अलावा, ओडिसी Imager के परिमाणन सॉफ्टवेयर अधिक से अधिक प्रदान करता हैजब स्कैन एक्स - रे फिल्मों chemiluminescence निम्नलिखित के पारंपरिक मात्रा का ठहराव की तुलना में और संवेदनशीलता का पता लगाने के linearity. हालांकि, हॉर्सरैडिश peroxidase (एचआरपी) संयुग्मित chemiluminescence द्वारा एंटीबॉडी का पता लगाने के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है.
शास्त्रीय lysosomal गिरावट और KISS1R के proteasomal गिरावट का पता लगाने के के अभाव HEK 293 कोशिकाओं में यहाँ वर्णित में भी देखा गया है COS-7 कोशिकाओं वही MycKISS1R अभिव्यक्ति वेक्टर 9 के साथ ट्रांसफ़ेक्ट. हालांकि असामान्य, जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स की गिरावट proteasomal पहले 16,17 साहित्य में रिपोर्ट किया गया है.
संक्षेप में, इस पांडुलिपि दर्शाता है कि कैसे KISS1R जीन है, जो एक अनुक्रम है अत्यधिक जीसी - अमीर में आनुवंशिक परिवर्तन के प्रभाव की जांच करने के लिए, क्रम में समझने के लिए कैसे इस रिसेप्टर में परिवर्तन hypogonadotropic hypogonadism या असामयिक यौवन जैसे प्रजनन विकार phenotypes करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं .
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
चार्ल्स एच. हूड फाउंडेशन युवा अन्वेषक बाल स्वास्थ्य अनुसंधान पुरस्कार (बोस्टन, MA) - इस काम आंशिक रूप से नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ बाल स्वास्थ्य और मानव विकास (HD059015 R21 NICHD) के प्रजनन शाखा द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PCRx Enhancer Solution | Invitrogen | 52391 | |
| PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase Alternative Detergent | Stratagene, Agilent Technologies | 600385 | |
| Dpn-I | New England Biolabs | R0176 | |
| XL10-Gold Ultracompetent E. coli cells | Stratagene, Agilent Technologies | 200314 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Geneporter Transfection Reagent | Genlantis | T201007 | |
| Leupeptin | Calbiochem | 108975 | |
| MG132 | Calbiochem | 47491 | |
| 10xPBS | Ambion | AM9625 | |
| Protease inhibitor cocktail and PMSF | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-24948 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 23225 | |
| anti-Myc tag (clone 4A6) agarose conjugate | EMD Millipore | 16-219 | |
| 2x loading buffer | Bio-Rad | 161-0737 | |
| Criterion Tris-HCl precast gel, 4-15% gradient | Bio-Rad | 345-0028 | |
| Immobilon-FL PVDF membrane | EMD Millipore | IPFL00010 | |
| Odyssey Blocking Buffer | LI-COR Biosciences | 927-40000 | |
| 10xTBS | Bio-Rad | 170-6435 | |
| Rabbit anti-myc antibody | Cell Signaling Technology | 2272 | |
| Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR Biosciences | 926-32211 | |
| Odyssey Imaging Infrared System | LI-COR Biosciences | ||
| Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 78430 |
References
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