Lentivirus की मध्यस्थता जेनेटिक और घ्राण संवेदी न्यूरॉन्स के हेरफेर विज़ुअलाइज़ेशन Vivo में Published: May 22, 2011 doi: 10.3791/2951

DOI

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Benjamin Sadrian¹, Huaiyang Chen¹, Qizhi Gong¹

¹Department of Cell Biology and Human Anatomy, School of Medicine, University of California, Davis

Summary

हम आनुवंशिक और एकल घ्राण संवेदी न्यूरॉन अक्षतंतु के हेरफेर के दृश्य के लिए एक lentiviral तकनीक और अपने टर्मिनल arborization मौजूद

Abstract

एक सटीक घ्राण सर्किट के विकास घ्राण संवेदी न्यूरॉन घ्राण बल्ब (ओ) में उनके synaptic लक्ष्य (OSN) axons के सटीक प्रक्षेपण पर निर्भर करता है. OSN अक्षतंतु विकास और लक्ष्यीकरण के आणविक तंत्र को अच्छी तरह से समझ नहीं रहे हैं. चालाकी से जीन अभिव्यक्ति और एकल OSN axons और उनके टर्मिनल कुंज आकारिकी की visualizing के बाद इस प्रकार अब तक चुनौतीपूर्ण किया गया है. एक निर्धारित समय सीमा के भीतर एकल कोशिका के स्तर पर जीन समारोह का अध्ययन करने के लिए, हम एक lentiviral आधारित vivo में OSNs में जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर तकनीक विकसित की है. Lentiviral कणों microinjection द्वारा घ्राण उपकला (ँ) में OSNs करने के लिए वितरित कर रहे हैं. अभिव्यक्ति कैसेट तो स्थायी रूप से कर रहे हैं transduced OSNs के जीनोम में एकीकृत है. ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति संक्रमित OSNs को पहचानती है और उनके अक्षतंतु टर्मिनल कुंज सहित पूरे आकारिकी, रूपरेखा. Microinjection और रिपोर्टर का पता लगाने के बीच कम प्रतिवर्तन समय के कारण, जीन समारोह के अध्ययन के विकास के एक बहुत ही संकीर्ण अवधि के भीतर ध्यान केंद्रित किया जा सकता है. इस विधि के साथ, हम के रूप में कुछ के रूप में तीन दिनों के भीतर GFP अभिव्यक्ति का पता चला है और के रूप में लंबे समय के रूप में तीन महीने के इंजेक्शन के बाद. हम दोनों अभिव्यक्ति और shRNA lentiviral microinjection नीचे दस्तक मध्यस्थता हासिल किया है. इस विधि vivo में एकल कक्ष के स्तर पर OSN सेल निकायों और axons की विस्तृत morphologies प्रदान करता है, और इस प्रकार उम्मीदवार घ्राण विकास के दौरान जीन समारोह के लक्षण वर्णन की अनुमति देता है है.

Protocol

1. तैयार

इस प्रक्रिया के लिए जैव सुरक्षा स्तर 2 है, इसलिए सभी निम्नलिखित तैयारी जहां microinjection प्रक्रिया का प्रदर्शन किया है एक biohazard हुड में बना रहे हैं.

1. तैयार है और पहले से गरम करना एक 37 डिग्री सेल्सियस waterbed: पानी के साथ एक प्लास्टिक का भंडारण बैग भरें और एक खाली हीटिंग ब्लॉक इनक्यूबेटर पर मुहर सेट. यह चूहों निम्नलिखित इंजेक्शन ठीक करने के लिए अनुमति देगा.
2. इस प्रक्रिया से सभी अपशिष्ट के विसर्जन के लिए एक उपयुक्त मात्रा 10% ब्लीच के साथ एक biohazard बर्बाद कंटेनर भरें.
3. 70% इथेनॉल के एक छोटे से खुला पकवान और निष्फल और ddH2O जैविक सुरक्षा कैबिनेट में जगह के साथ एक दूसरे पकवान तैयार करें.
4. एक 33 गेज सुई के साथ नीचे 70% इथेनॉल के साथ शरीर और सुई के छिड़काव के साथ सवार सभी तरह बाहर खींच लिया एक 5μL क्षमता हैमिल्टन सिरिंज जीवाणुरहित. बार बार पकवान से इथेनॉल aspirate और यह सभी तरह बाहर फैंकना बाहर कम से कम 5 बार.
5. Aspirating और बाहर खदेड़ना बाँझ पानी कम से कम 5 बार सिरिंज कारतूस कुल्ला. सिरिंज सुरक्षित रूप से अलग संस्कृति हुड में प्लेस और यह शुष्क करने की अनुमति देते हैं.
6. से -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर और बर्फ पर भंडारण जगह विगलन अनुमति देने के लिए वायरल शेयर निकालें. Microinjection 10 ⁹ संक्रामक इकाइयों / एमएल के एक titre पर माउस प्रति शेयर वायरस के 2μL की आवश्यकता है. Lentiviruses वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त किया जा सकता है है या उत्पादित प्रयोगशाला में स्थापित प्रोटोकॉल (लोइस एट अल., 2002) के अनुसार .
7. एक इंजेक्शन मंच है कि एक डाकू सतह से ऊपर उठाया क्षेत्र प्रदान करता है तैयार - एक 10cm संस्कृति Kimwipe के एक पत्रक के साथ कवर पकवान का उपयोग कर सकते हैं.
8. इंजेक्शन स्टेशन के पास शराब पोंछे व्यवस्थित.

2. Lentiviral कणों की घ्राण उपकला में Microinjection

इस पद्धति में सभी पशु प्रदर्शन प्रक्रियाओं IACUC अनुमोदित दिशा निर्देशों के अनुसार किया जाता है. मुसलमानों मस्कुलस तनाव C57BL/6J है यहाँ जानवर सभी प्रयोगों में इस्तेमाल किया मॉडल का प्रदर्शन किया.

1. हाइपोथर्मिया द्वारा पिंजरे के बाहर एक पिल्ला माउस (P0-P3) ले रही है और 5 मिनट के लिए बर्फ पर एक कट खुले दस्ताने पर डाल पिल्ला द्वारा माउस पिल्ले चतनाशून्य करना.
2. के लिए पिल्ला वायरल शेयर की पूरी तरह से anesthetized aspirate 2μL निष्फल हैमिल्टन सिरिंज में जबकि इंतज़ार कर रही है.
3. पिल्ला माउस इंजेक्शन चरण के शीर्ष पर रखें. धीरे त्वचा गर्दन के ऊपर की ओर कान सिर के ऊपर से दूर खींच. इस नाक गुहा के ऊपर एक सिखाया त्वचा की सतह प्रदान करने चाहिए और इंजेक्शन को कम करेगा.
4. त्वचा की सतह के नीचे 3mm के बारे में नाक गुहा के ऊपर के माध्यम से सुई सम्मिलित घ्राण उपकला तक पहुँचने के लिए. शॉट प्रति वायरस समाधान के 0.5μL Microinject, पक्ष के अनुसार दो साइटों, दोनों को छोड़ दिया और सही (चार कुल माउस प्रति इंजेक्शन = आवश्यक वायरस के 2μL) चुनने. इंजेक्शन साइटों को एक दूसरे से अलग हो कंपित चाहिए. उचित इंजेक्शन साइटों की लक्ष्यीकरण के लिए, घ्राण बल्ब की रूपरेखा के लिए खोज पृष्ठीय खोपड़ी की सतह. यह पंक्ति बमुश्किल अर्द्ध पारदर्शी त्वचा और खोपड़ी के माध्यम से जन्म के समय दिखाई है. पक्ष के अनुसार दो इंजेक्शन बनाने के लिए, एक बस एक औसत दर्जे का अक्ष पर एक बल्ब रूपरेखा व्याख्यान चबूतरे वाला इंजेक्शन का उद्देश्य. दूसरा बल्ब रूपरेखा पार्श्व प्रविष्टि करें, अभी तक इंजेक्शन कोण medially इतनी है कि आप घ्राण उपकला है कि बल्ब के नीचे ventrally रहता है तक पहुँच सकते हैं सुनिश्चित करें. घ्राण बल्ब मर्मज्ञ से बचें!
5. किसी भी अवशिष्ट वायरस समाधान या खून है कि इंजेक्शन साइट या नथुने उद्घाटन Kimwipe का उपयोग कर से बचने के सकता है सूखी ब्लाट. तुरंत पतला तरल ब्लीच biohazard कंटेनर में Kimwipes के निपटान.
6. Waterbed इनक्यूबेटर पर इंजेक्शन माउस रखें.
7. दोहराएँ 1-4 इंजेक्शन जा चूहों के लिए कदम, आप माउस प्रति शेयर वायरस के बारे में 2μL की आवश्यकता होगी याद है.
8. उन्हें उनके मूल घोंसले के शिकार पिंजरे के लिए लौटने से पहले चूहों waterbed इनक्यूबेटर पर 30 मिनट के लिए ठीक है.
9. लिक्विड ब्लीच biohazard निपटान में microinjection मंच, sanitizing पोंछे और किसी भी अतिरिक्त सफाई कागज उत्पादों के निपटान.
10. आकांक्षा और इथेनॉल के इंजेक्शन दोहराया और फिर पानी के रूप में तैयारी के चरणों में किया द्वारा हैमिल्टन सिरिंज साफ. सिरिंज शुष्क करने की अनुमति दें.
11. अधिकतम पारगमन दक्षता के लिए इस प्रक्रिया को फिर से दोहराने 4 घंटे में. संक्रमित OSNs तीन दिन के रूप में कुछ के रूप में सेल की लंबाई भर में visualized किया जा सकता है.

3. अस्थायी घ्राण बल्ब वर्गों के immunohistochemistry

1. वांछित समय बिंदु पर माउस इंजेक्शन बलिदान और छिड़काव 4% paraformaldehyde के साथ ऊतकों को ठीक. ओबी काटना. Paraformaldehyde में रात भर और फिर सेते रातोंरात पीबीएस में 30% sucrose. अक्टूबर सूखी बर्फ पर एम्बेडिंग मध्यम में एम्बेड.
2. कोरोनल ओ वर्गों मोटाई में एक 60μm एक cryostat का उपयोग पर प्राप्त कर रहे हैं. 5ml 1x पीबीएस (7.4 पीएच) के साथ एक 10cm संस्कृति डिश में बल्ब वर्गों को स्वीप. धारा पीबीएस में तैर घ अक्टूबर की अनुमति रखा जाना चाहिएissolve. अस्थायी वर्गों और पीबीएस एक 50ml शंक्वाकार शीशी में स्थानांतरण.
3. वर्गों को शीशी के नीचे के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति दें. किसी भी वर्गों चूसने बिना पीबीएस बंद वैक्यूम. 20ml पीबीएस ऊतक वर्गों के साथ कुल्ला. बसने और vacuuming के चरणों को दोहराएँ. 10ml पीबीएस और हस्तांतरण immunostaining के लिए एक 15ml शंक्वाकार शीशी अस्थायी वर्गों के साथ Resuspend ऊतक. एक बार ऊतक वर्गों बसे है, ऊतक परेशान बिना पीबीएस सतह पर तैरनेवाला बंद वैक्यूम. Resuspend वर्गों के साथ 0.3% ट्राइटन 1x Pbs, 7.4 पीएच (PBS-TX) डिटर्जेंट सेल झिल्ली छेदना के लिए अनुमति में X-100. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं. सतह पर तैरनेवाला और PBS-TX के साथ दोहराने ऊष्मायन बंद दो बार वैक्यूम.
4. अवरुद्ध समाधान के 10ml (5% PBS-TX में घोड़े सीरम) में कमरे के तापमान पर दो घंटे के लिए ऊतक वर्गों सेते हैं.
5. अवरुद्ध समाधान PBS-TX के साथ कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए कम से कम दो बार कुल्ला.
6. PBS-TX में एक प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 2ml तैयार. अभिकर्मकों और इस प्रयोग में इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के लिए उपकरण अनुभाग देखें.
7. दूसरा PBS-TX प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ अवरुद्ध धोने बदलें. 4 में एक धीरे कमाल (~ 30rpm) मंच 60μm अस्थायी वर्गों में डिग्री सेल्सियस 24-48 घंटे के लिए पूरी तरह से प्रवेश सुनिश्चित करने के लिए सेते हैं.
8. ऊष्मायन के बाद, प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान ध्यान से एक विंदुक का उपयोग पुनः प्राप्त किया जा सकता है और 4 में संग्रहीत ° सी धुंधला तीव्रता के किसी भी महत्वपूर्ण नुकसान बिना दो बार के लिए दो सप्ताह के भीतर पुन: उपयोग के लिए.
9. वर्गों कोमल रोटेशन (~ 30rpm) के साथ कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए PBS-TX में तीन बार धोएं.
10. PBS-TX में माध्यमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के 2ml तैयार. पिछले धोने वैक्यूम और ऊतक वर्गों के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ने. लपेटें एल्यूमीनियम पन्नी में धुंधला शीशी के लिए प्रकाश है, जो fluorophore photobleaching पैदा कर सकता है ब्लॉक के बाहर. एक धीरे से कमाल और 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात मंच सेते प्लेस पर शीशी लपेटा.
11. दूर vacuuming के द्वारा माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान त्यागें. वर्गों PBS-TX के साथ कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए एक बार धोएं. पीबीएस के साथ दो अतिरिक्त समय (7.4 पीएच) कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए कुल्ला. कांच Fluoromount जी का उपयोग कर स्लाइड्स पर दाग ऊतक वर्गों पर्वत
12. सकारात्मक संक्रमित OSN और axons एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के साथ अक्षतंतु Termini के लिए दाग वर्गों के माध्यम से स्क्रीन.
13. एक लेबल OSN अक्षतंतु और टर्मिनल कुंज के एक तीन आयामी दृष्टिकोण का निर्माण करने के लिए, लक्ष्य ओ ऊतक (z अक्ष के साथ) टुकड़ा confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग 60μm गहराई के माध्यम से ऑप्टिकल वर्गों की एक श्रृंखला बनाते हैं.
14. Z - खंड छवियों के इस ढेर के बाद एक साथ अनुमानित किया जा सकता है एक 360 ° एक एकल लेबल OSN अक्षतंतु के घूर्णन परिप्रेक्ष्य टर्मिनल अपनी संपूर्णता में कुंज विस्तार सहित, के पुनर्निर्माण है. कोई एक ही रोटेशन कोण और कब्जा किया जा सकता है 2 डी स्वरूप प्रस्तुति के लिए एक छवि फ़ाइल (यानी JPG, झगड़ा) के रूप में निर्यात.

4. प्रतिनिधि परिणाम

साथ तरीकों यहाँ वर्णित है, हम vivo में lentivirus द्वारा घ्राण संवेदी न्यूरॉन्स transduce कर सकते हैं. हम GFP और mCherry फ्लोरोसेंट संवाददाताओं के साथ इस प्रकार दूर कल्पना संक्रमित OSNs, के रूप में के साथ अच्छी तरह से एक myc-टैग immunocytochemistry संलयन प्रोटीन के माध्यम से है. इस तकनीक में संक्रमित OSNs के एक बहुतायत प्रदान करता है. फिर भी, पारगमन कई मायनों व्यक्तिगत लेबल OSNs प्रदान करने के लिए पर्याप्त होता है, इस प्रकार एकल सेल आकारिकी के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है. Axons और अक्षतंतु टर्मिनलों ओबी ऊतक वर्गों के भीतर उनके confocal माइक्रोस्कोपी (चित्रा 1) द्वारा देशी वातावरण के बीच imaged हैं. पूरे OSN अक्षतंतु टर्मिनल कुंज आम तौर पर 40 50μm ऑप्टिकल अनुभाग के भीतर मोहित किया जा सकता है. संक्रमित OSN अक्षतंतु टर्मिनलों के उच्च बढ़ाई glomerular परत पर axonal कुंज आकारिकी का विस्तृत विश्लेषण की अनुमति देता है.

चित्रा 1. एकल घ्राण संवेदी न्यूरॉन अक्षतंतु और अपने टर्मिनल कुंज के एक प्रक्षेपवक्र.) P7 घ्राण तंत्रिका परत (ONL) दिखा माउस के घ्राण बल्ब के कोरोनल अनुभाग OMP (लाल) के लिए immunostained और glomerular परत (जीएल) के साथ दोनों OMP immunostained और Vglut2 (ग्रे). एक एकल घ्राण संवेदी न्यूरॉन अक्षतंतु व्यक्त GFP (हरी) ONL के भीतर यात्रा और glomerular संरचना में प्रवेश. बी) glomerulus भीतर अक्षतंतु टर्मिनल कुंज आकारिकी GFP अभिव्यक्ति के द्वारा स्पष्ट रूप से प्रकाश डाला. Vglut2 ग्रे में सह - धुंधला कुल glomular क्षेत्र के भीतर जो GFP-सकारात्मक अक्षतंतु एक टर्मिनल abor बताते illuminates. सी) lentiviral संक्रमित OSNs ँ GFP (हरा) में व्यक्त. घ्राण उपकला के cytostructure DAPI धुंधला (नीला) के साथ दिखाया गया है. GFP अभिव्यक्ति OSN सेल ँ में शरीर और अपने सेलुलर प्रक्रियाओं के दृश्य की अनुमति देता है. डी) OSN और Rap1GAP2 अभिव्यक्ति के साथ अपने टर्मिनल आकारिकी अक्षतंतु नीचे दस्तक shRNA द्वारा. Rap1GAP2 shRNA के साथ माउस U6 और एक के तहत प्रमोटर GFP के तहत एक दोहरी अभिव्यक्ति कैसेट ले जाने Lentivirusesसीएमवी प्रमोटर ँ के लिए लागू किया गया. संक्रमित घ्राण अक्षतंतु टर्मिनलों एक अधिक सरल टर्मिनल कुंज प्रदर्शन जब GFP केवल नियंत्रण के की तुलना में. बार = 20μm.

Discussion

OSN जीनोमिक डीएनए में जीन constructs की स्थायी हस्तांतरण में lentivirus परिणाम के Microinjection. यह दृष्टिकोण हमें उम्मीदवार जीनों की overexpression या shRNA मध्यस्थता दस्तक नीचे के माध्यम से अल्पकालिक या दीर्घकालिक जोड़तोड़ प्रदर्शन करने के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, हम एक मौजूदा ट्रांसजेनिक माउस odorant रिसेप्टर आबादी के सह स्थानीयकरण का निरीक्षण लाइन में fluorescently एकल OSNs लेबल कर सकते हैं. Microinjection OSNs के lentiviral पारगमन के लिए आवश्यक है. हम किसी भी सफलता के बिना OSNs transduce नाक गुहा में lentivirus निलंबन निस्तब्धता का प्रयास किया है. इसलिए हम पृष्ठीय नाक की सतह के माध्यम से microinjections प्रदर्शन के क्रम में ँ जहां OSN सेल शरीर झूठ की भीतरी परतों को वायरस देने.

वहाँ स्थापित adenoviral हेरफेर से अधिक lentivirus का उपयोग करने के लिए कई फायदे हैं. Lentivral पारगमन दीर्घकालिक अध्ययन की अनुमति जीनोम में एकीकृत है, जबकि adenovirus जीन में गड़बड़ी की एक सीमित timecourse (Doi एट अल., 2005) के साथ केवल क्षणिक अभिकर्मक देता है. हमने पाया है lentivirally microinjection के बाद तीन महीने के रूप में लंबे समय के रूप में OSNs transduced. वयस्क rodents में OSNs की जीवन अवधि आमतौर पर 1-3 महीने के बीच है. Lentiviral संक्रमित OSNs इस प्रकार अपने जीवनकाल के बहुमत के माध्यम से देखे जा सकते हैं, OSN अक्षतंतु विकास, synaptic गठन और रखरखाव, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से odorant उत्तेजित प्रतिक्रियाओं और कारोबार की प्रक्रिया की जांच की अनुमति. इसके अलावा, lentiviruses पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह से संक्रमित कर सकते हैं और समय की लंबी अवधि के लिए OSNs के दृश्य की अनुमति. Adenovirus आसानी OSNs transduces जब नाक गुहा (झाओ एट अल., 1996) में संचार. हालांकि, adenoviral संक्रमण अक्सर जोखिम के बिंदु से बड़े पैमाने पर करता है और lentivirus रूप में मज़बूती से उपज नहीं पृथक एकल कक्ष transductions. Lentiviral की मध्यस्थता OSNs में आनुवंशिक हेरफेर इसलिए vivo में एकल OSNs में जीन समारोह के लक्षण वर्णन के लिए एक शक्तिशाली और कुशल तकनीक है.

Materials

Microinjection: Newborn mice were microinjected using a 5μL Hamilton syringe (Hamilton #7647-01) fitted with a 33 gauge needle (Hamilton #7762-06). Immunocytochemistry Reagents: Primary antibodies: rabbit polyclonal antibody GFP (Molecular Probes# A-6455), chicken polyclonal antibody against OMP (custom) (Chen et al., 2005), guinea pig polyclonal antibody against VGlut2 (Millipore# AB2251). Secondary antibodies: Cy2-conjugated donkey anti-rabbit (Jackson Immunolab# 711-225-152), Cy3-conjugated donkey-anti-chicken (Jackson Immunolab# 703-165-155) and Cy5-conjugated goat anti-guinea pig (Jackson Immunolab# 106-175-008). Sections were mounted on glass slides with Fluoromount G (Southern Biotech# 0010-01) with 50ng/mL DAPI chromatin stain solution. Confocal Imaging: Z-stack images were taken using an Olympus Flouview FV1000 confocal microscope and images collected and processed into 3D projections using Olympus FV10-ASW 2.01 confocal acquisition and analysis software.