Lentivirus-medierad genetisk manipulation och visualisering av Olfactory sensoriska neuroner In vivo Published: May 22, 2011 doi: 10.3791/2951

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Benjamin Sadrian¹, Huaiyang Chen¹, Qizhi Gong¹

¹Department of Cell Biology and Human Anatomy, School of Medicine, University of California, Davis

Summary

Vi presenterar en Lentiviral teknik för genetisk manipulation och visualisering av enstaka luktsinnet sensoriska neuron axon och sin terminal arborization

Abstract

Utveckling av en exakt lukt krets bygger på exakt prognos över luktsinnet sensoriska neuron (OSN) axoner till sina synaptiska mål i luktbulben (OB). De molekylära mekanismerna för OSN axon tillväxt och riktar förstås inte heller bra. Manipulera genuttryck och efterföljande visualisering av enstaka OSN axoner och deras terminal berså morfologi har hittills varit utmanande. För att studera geners funktion på cell nivå inom en angiven tidsram, utvecklade vi en Lentiviral baserad teknik för att manipulera genuttryck i OSN in vivo. Lentiviral Particles levereras till OSN genom mikroinjektion i luktepitel (OE). Expression kassetter sedan permanent integreras i genomet av transduced OSN. Grönt fluorescerande protein uttryck identifierar infekterade OSN och beskriver hela sin morfologi, inklusive axonet terminalen bersån. På grund av den korta handläggningstid mellan mikroinjektion och reporter upptäckt kan genfunktion studier fokuseras inom ett mycket smalt period av utveckling. Med denna metod har vi upptäckt GFP uttryck inom så lite som tre dagar och så länge som tre månader efter injektionen. Vi har uppnått både över-uttryck och shRNA medierade knock-down av Lentiviral mikroinjektion. Denna metod ger detaljerad morfologier av OSN cell organ och axoner på enskild cell nivån in vivo och därmed möjliggör karakterisering av kandidatgener geners funktion under olfactory utveckling.

Protocol

1. Förberedelser

Detta förfarande är biosäkerhetsnivå 2, därför att följande förberedelser är gjorda i ett biologiskt huva där mikroinjektion proceduren utförs.

1. Förbered och värm en 37 ° C vattensäng: Fyll en plast förvaringsväska med vatten - tätning och ligger på en tömd värmeblock inkubator. Detta gör att möss att återhämta sig efter injektion.
2. Fyll en biologiskt avfall behållare med 10% blekmedel till en lämplig volym för nedsänkning av allt avfall från detta förfarande.
3. Förbered en liten öppen fat med 70% etanol och en andra fat med steriliserad ddH2O och plats i den biologiska säkerhetsskåp.
4. Sterilisera en 5μL kapacitet Hamilton spruta med en 33-nål genom att spraya ner kroppen och nålen med 70% etanol med kolven dras ut hela vägen. Upprepade gånger aspirera etanol från skålen och mata ut det hela vägen ut minst 5 gånger.
5. Skölj sprutan patronen genom att aspirera och mata sterilt vatten minst 5 gånger. Sätt sprutan på ett säkert sätt åt sidan i kulturen huva och låt det torka.
6. Ta bort virus lager från -80 ° C frys förvaring och plats på isen för att tina. Mikroinjektion kräver 2μL virus lager per mus på en titer 10 ⁹ infektiösa enheter / ml. Lentiviruses kan erhållas från kommersiella källor eller produceras i laboratoriet enligt fastställt protokoll (Lois et al., 2002).
7. Förbered en injektion skede som ger ett område upp över huven ytan - kan använda en parabolantenn 10cm kultur täckt med ett ark med Kimwipe.
8. Ordna spritkompresser nära injektionen stationen.

2. Mikroinjektion av Lentiviral Particles i luktepitel

Alla animaliska ingrepp i denna metod görs enligt IACUC godkända riktlinjer. Mus musculus stammen C57BL/6J är den djurmodell som används i alla experiment visade här.

1. Bedöva mus ungar av hypotermi genom att ta en mus valp (P0-P3) ur buren och lägger valpen på en cut-öppen handske på is i 5 minuter.
2. I väntan på valpen att vara helt sövd, aspirera 2μL av virus lager i steriliserade Hamilton sprutan.
3. Placera musen valpen på toppen av injektionen scenen. Dra försiktigt ut huden bort från toppen av huvudet vid örat uppåt halsen. Detta bör ge en lärde hudyta över näshålan och kommer att underlätta injektionen.
4. Sätt in nålen genom toppen av näshålan om 3 mm under hudytan för att nå luktepitel. Microinject 0.5μL av virus lösning per skott, välja två platser per sida, både vänster och höger (fyra injektioner totalt per mus = 2μL som behövs virus). Injektionsstället bör fördelas från varandra. För inriktning av ordentlig injektionsställen, sök ryggens skallen yta för kontur luktbulben. Denna linje är knappt synlig vid födseln genom semi-genomskinliga hud och skalle. Att göra två injektioner per sida, sikta en injektion precis rostralt till en glödlampa skissera på en medial axel. Gör inmatningspunkt sidled till glödlampan beskriva, men se till att vinkla injektion medialt så att du kan nå luktepitel som finns ventralt under lampan. Undvik att tränga in i luktbulben!
5. Torka alla rester av virus lösning eller blod som kan fly från injektionsstället eller öppningar näsborren med hjälp av en Kimwipe. Omedelbart avyttra Kimwipes i de utspädda flytande blekmedel biologiskt behållare.
6. Placera den injicerade musen på vattensäng inkubatorn.
7. Upprepa steg 1-4 för alla möss som injiceras, minns du behöver om 2μL virus lagret per mus.
8. Låt möss återhämta sig på vattensängen inkubator för 30 minuter innan tillbaka dem till deras ursprungliga häckande bur.
9. Kassera mikroinjektion scenen, desinficerande våtservetter och några extra rengöringsprodukter papper i flytande blekmedel biologiskt avfall.
10. Rengör Hamilton sprutan genom upprepad aspiration och utmatning av etanol och vatten som gjorts i beredningen steg. Låt sprutan torka.
11. För maximal transduktion effektivitet upprepa proceduren igen i 4 timmar. Infekterade OSN kan visualiseras genom längden på cellen på så lite som tre dagar.

3. Immunohistokemi av flytande luktloben sektioner

1. Offra den injicerade musen på önskad tidpunkt och perfusion fixera vävnaden med 4% paraformaldehyd. Dissekera ut OB. Inkubera i paraformaldehyd över natten och sedan 30% sackaros i PBS natten. Bädda in i oktober bädda medium på torris.
2. Koronalt OB delar erhålls vid en 60μm tjocklek med hjälp av en kryostat. Sopa glödlampa sektioner i en 10cm kultur skålen med 5 ml 1x PBS (pH 7,4). Avsnitten bör hållas flytande i PBS för att möjliggöra oktober till dissolve. Överför flytande sektioner och PBS i en 50mL konisk flaska.
3. Låt avsnitt för att lösa till botten av flaskan. Vakuum av PBS utan suger upp alla avsnitt. Skölj vävnadssnitt med 20ml PBS. Upprepa bosätta sig och dammsuga steg. Resuspendera vävnad med 10mL PBS och överför flytande avsnitt för att en 15 ml konisk flaska för immunfärgning. När vävnadssnitt har bosatt, vakuum av PBS vätskefasen utan att störa vävnad. Resuspendera sektioner med 0,3% Triton X-100 i 1x PBS, pH 7,4 (PBS-TX) gör rengöringsmedel för att perforera cellmembran. Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur. Dammsug bort supernatanten och upprepa inkubering med PBS-Tx två gånger.
4. Inkubera vävnadssnitt i 10 mL blockerande lösningen (5% hästserum i PBS-TX) i två timmar i rumstemperatur.
5. Skölj blockerande lösningen minst två gånger med PBS-Tx i 15 minuter varje i rumstemperatur.
6. Förbered 2 ml av en primär antikropp lösning i PBS-Tx. Se Reagenser och utrustning avsnitt för antikroppar som används i detta experiment.
7. Byt second PBS-Tx blockerar tvätta med primär antikropp lösning. Inkubera på en långsamt gungande plattform (~ 30rpm) vid 4 ° C i 24-48 timmar för att säkerställa fullständig inträngning i 60μm flytande avsnitt.
8. Efter inkubation, kan den primära antikroppen lösningen hämtas försiktigt med en pipett och förvaras vid 4 ° C för återanvändning upp till två gånger inom två veckor utan någon betydande förlust av färgningsintensitet.
9. Tvätta avsnitt tre gånger i PBS-Tx i 20 minuter vid rumstemperatur med varsam rotering (~ 30rpm).
10. Förbered 2ml av sekundär antikropp utspädning i PBS-TX. Dammsug bort den sista tvättningen och lägga sekundär antikropp lösning på vävnadssnitt. Linda utsidan av färgning flaskan i aluminiumfolie för att blockera ljus, vilket kan orsaka fluoroforen fotoblekning. Placera insvept flaskan på en långsamt gungande plattform och inkubera vid 4 ° C över natten.
11. Kasta sekundär antikropp lösning genom att dammsuga bort. Tvätta sektioner gång med PBS-Tx i 20 minuter i rumstemperatur. Skölj ytterligare två gånger med PBS (pH 7,4) under 20 minuter vardera vid rumstemperatur. Montera det färgade vävnadssnitten på glaset bilder med hjälp Fluoromount G.
12. Skärmen genom färgade sektioner för positivt smittade OSN axoner och Termini axon med ett fluorescerande mikroskop.
13. Att konstruera en tredimensionell bild av en märkt OSN axon och terminal berså, göra en serie av optiska delar genom den 60μm djup målet OB vävnaden slice (längs z-axeln) med hjälp av konfokalmikroskopi.
14. Denna stack av Z-sektionen bilder kan sedan projiceras tillsammans för att rekonstruera en 360 ° roterande perspektiv av en märkt enda OSN axonet, inklusive terminal berså detalj i sin helhet. Någon enskild vridningsvinkel kan fångas och exporteras som en bildfil (t.ex. JPG, TIFF) för 2D-format presentation.

4. Representativa resultat

Med de metoder som beskrivs här, kan vi transduce lukt sensoriska neuroner genom lentivirus in vivo. Vi har hittills visualiserat infekterade OSN med GFP och mCherry fluorescerande reportrar, samt med en Myc-märkta fusionsprotein via immuncytokemi. Denna teknik ger ett överflöd av infekterad OSN. Ändå inträffar transduktion sporadiskt nog att ge individuellt märkt OSN, vilket möjliggör analys av enstaka cellmorfologin. Axoner och terminaler axonet är avbildade i OB vävnadssnitt mitt modersmål miljö genom konfokalmikroskopi (Figur 1). Hela OSN axonet terminalen berså kan normalt fängslad inom en 40-50μm optiska avsnitt. Hög förstoring av infekterade OSN axon terminaler låter detaljerad analys av axonal berså morfologi vid glomerulära lager.

Figur 1. Bana enda luktsinnet sensoriska neuron axon och sin terminal Arbor. A) En coronal avsnitt i luktbulben en P7 mus visar luktnerven lagret (ENDA) immunostained för OMP (röd) och glomerulär lagret (GL) immunostained med både OMP och Vglut2 (grå). En enda lukt sensoriska neuron axonet uttrycka GFP (grönt) reser inom ENDA och tränger in i den glomerulära strukturen. B) axonet terminalen berså morfologi inom glomerulus markeras tydligt av GFP uttryck. Vglut2 co-färgning i grått lyser upp den totala glomular område där GFP-positiva axon utarbetar en terminal abort. C) Lentiviral infekterade OSN uttrycka GFP (grönt) i OE. Den cytostructure av luktepitel visas med DAPI färgning (blå). GFP uttryck tillåter visualisering av OSN cellens organ och deras cellulära processer i OE. D) En OSN axon och sin terminal morfologi med Rap1GAP2 uttryck knock-down av shRNA. Lentiviruses bär en dubbel uttryck kassett med Rap1GAP2 shRNA under musen U6 promotor och GFP under enCMV promotor tillämpades på OE. Infekterade lukt axon terminaler uppvisade en enklare terminal berså jämfört med den i GFP enda kontroll. Bar = 20 mikroM.

Discussion

Mikroinjektion av lentivirus resulterar i permanent överföring av genen konstruktioner i OSN arvsmassans DNA. Detta tillvägagångssätt tillåter oss att göra kortsiktiga eller långsiktiga manipulationer av gener via överuttryck eller shRNA medierad knock-down. Dessutom kan vi etiketten fluorescerande enda OSN i en befintlig transgen mus linje att följa co-lokalisering av befolkningen luktreceptor. Mikroinjektion krävs för Lentiviral transduktion av OSN. Vi har försökt spola lentivirus fjädring i näshålan för att transduce OSN utan framgång. Vi utför därför microinjections genom ryggens näsan ytan för att leverera virus till inre skikten av OE där OSN cell organ lögn.

Det finns många fördelar med att använda lentivirus över den etablerade adenovirala manipulation. Lentivral transduktion integreras i genomet så långtidsstudier, medan adenovirus ger endast övergående transfektion med ett begränsat tidsförloppet för genmanipulation (Doi et al., 2005). Vi har upptäckt lentivirally transduced OSN så länge som tre månader efter mikroinjektion. Livslängden för OSN hos vuxna gnagare är vanligtvis mellan 1-3 månader. Lentiviral infekterade OSN kan alltså visualiseras genom huvuddelen av sin livstid, så att undersökning av OSN Axon tillväxt, synaptiska uppbyggnad och underhåll samt luktämnen-stimulerad svar och omsättningen processen. Dessutom kan lentiviruses infektera progenitorceller samt och tillåta visualisering av OSN för längre perioder. Adenovirus transduces lätt OSN Vid infusion i näshålan (Zhao et al., 1996). Dock är adenovirala infektionen ofta utbredd ur exponering, och inte ger isolerad cell transductions så tillförlitligt som lentivirus. Lentiviral-medierad genetisk manipulation i OSN är därför en kraftfull och effektiv teknik för karakterisering av geners funktion i enskilda OSN in vivo.

Materials

Microinjection: Newborn mice were microinjected using a 5μL Hamilton syringe (Hamilton #7647-01) fitted with a 33 gauge needle (Hamilton #7762-06). Immunocytochemistry Reagents: Primary antibodies: rabbit polyclonal antibody GFP (Molecular Probes# A-6455), chicken polyclonal antibody against OMP (custom) (Chen et al., 2005), guinea pig polyclonal antibody against VGlut2 (Millipore# AB2251). Secondary antibodies: Cy2-conjugated donkey anti-rabbit (Jackson Immunolab# 711-225-152), Cy3-conjugated donkey-anti-chicken (Jackson Immunolab# 703-165-155) and Cy5-conjugated goat anti-guinea pig (Jackson Immunolab# 106-175-008). Sections were mounted on glass slides with Fluoromount G (Southern Biotech# 0010-01) with 50ng/mL DAPI chromatin stain solution. Confocal Imaging: Z-stack images were taken using an Olympus Flouview FV1000 confocal microscope and images collected and processed into 3D projections using Olympus FV10-ASW 2.01 confocal acquisition and analysis software.