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Neuroscience

강한 감각 뉴런의 Lentivirus - 중재 유전자 조작 및 시각화 생체내에 Published: May 22, 2011 doi: 10.3791/2951
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1, 1, 1
1Department of Cell Biology and Human Anatomy, School of Medicine, University of California, Davis

Summary

우리는 lentiviral 하나의 후각 감각 신경 세포의 축삭의 유전자 조작과 시각화를위한 기술 및 터미널 arborization을 제시

Abstract

정확한 후각 회로의 개발은 후각 망울 (OB)에서 시냅스 대상으로 후각 감각 뉴런 (OSN) axons의 정확한 예측에 의존하고 있습니다. OSN 축삭의 성장과 대상의 분자 메커니즘이 잘 이해되지 않습니다. 조작 유전자 발현 및 단일 OSN의 axons과 터미널 아버 형태의 시각 이후는 지금까지 도전했습니다. 지정된 시간 프레임 내에 단일 세포 수준에서 유전자 기능을 연구하기 위해, 우리는 생체내에 OSNs의 유전자 발현을 조작하는 lentiviral 기반 기술을 개발했습니다. Lentiviral 입자가 후각 상피 (OE)에 microinjection하여 OSNs로 전달됩니다. 표현 카세트는 다음 영구적으로 transduced OSNs의 게놈에 통합됩니다. 그린 형광 단백질 표현이 감염된 OSNs를 식별하고 축삭 터미널 아버 포함한 전체 형태를 설명합니다. microinjection 및 기자 탐지 사이의 짧은 처리 시간으로 인해, 유전자 기능 연구 개발의 아주 좁은 기간 내에 초점을 맞추고 있습니다. 이 방법을 통해, 우리는 몇 셋처럼 일 이내에 GFP 발현을 감지하고 한 셋처럼 개월 주사를 다음과. 우리는 노크를 다운 lentiviral microinjection하여 중재를 통해 표현과 shRNA를 모두 달성했습니다. 이 방법은 생체내에있는 단일 세포 수준에서 OSN 세포 기관과 axons 자세한 morphologies을 제공하므로 후각 개발하는 동안 후보 유전자 기능의 특성을 허용합니다.

Protocol

1. 준비

이 절차는 biosafety 레벨 2 따라서 다음과 같은 모든 준비는 microinjection 절차가 수행되는 생물 학적 후드에 만들어집니다.

  1. 준비하고 앞서 열을 가하다 37 ° C 물침 : 물로 플라스틱 저장 가방에 담아 - 비운 가열 블록 인큐베이터에 도장 및 설정합니다. 이 생쥐는 다음과 같은 주사를 복구할 수 있습니다.
  2. 이 절차에서 모든 폐기물의 침수에 적합한 볼륨 10 % 표백제와 생물 학적 폐기물 컨테이너를 채웁니다.
  3. 70 % 에탄올의 작은 열 접시와 생물 학적 안전 캐비닛에 소독 ddH2O 장소와 두 번째 접시를 준비합니다.
  4. 플런저 모든 방법을 꺼내와 70 %의 에탄올과 함께 신체와 바늘을 아래로 분사하여 33 게이지 바늘로 5μL 용량 해밀턴 주사기를 소독. 반복적으로 요리에서 에탄올을 대기음 최소한 5 번 그 모든 방법을 꺼냅니다.
  5. aspirating 및 꺼내기 멸균 물을 적어도 5 배 주사기 카트리지를 씻어. 문화 후드에 안전하게 따로 주사기를 삽입하고 건조 수 있습니다.
  6. 얼음 ° C의 냉동고 저장 및 장소 융해 수 있도록 -80에서 바이러스 주식을 제거합니다. Microinjection은 10 9 전염성 단위 / ML의 titre에서 마우스마다 바이러스 주식 2μL 필요합니다. Lentiviruses는 기존 프로토콜 (로이스 외., 2002)에 따르면 실험실에서 상용 소스에서 얻은 또는 생산 수 있습니다.
  7. 후드의 표면 위에서 제기된 영역을 제공하는 사출 단계를 준비​​ - Kimwipe의 시트로 덮여 10cm 문화 요리를 사용할 수 있습니다.
  8. 사출 역 근처 알코올 잎사귀 마련.

2. 후각 상피에 lentiviral 입자의 Microinjection

이 방법에서 수행한 모든 동물 절차 IACUC 승인 지침에 따라 수행됩니다. 뮤스 musculus 긴장 C57BL/6J 모든 실험에 사용되는 동물 모델이 여기에 증명합니다.

  1. 밖으로 새장의 새끼 마우스 (P0 - P3)을 복용하고 5 분 얼음에 절단 - 열린 장갑에 강아지를 넣어 저체온증으로 마우스 새끼를 마취시키다.
  2. 강아지가 살균 해밀턴 주사기로 바이러스 재고 완전히 anesthetized, 기음 2μL 수 기다리는 동안.
  3. 사출 무대 위에 새끼 마우스를 놓습니다. 부드럽게 목의 상단쪽으로 귀의 머리 위로 떨어져 피부를 당기십시오. 이것은 비강을 통해 가르쳐 피부 표면을 제공해야하고 주사를 쉽게합니다.
  4. 후각 상피를 도달하는 피부 표면 아래 3mm에 대한 비강의 정상을 통해 바늘을 삽입합니다. 왼쪽과 오른쪽 양쪽마다 두 사이트 (마우스마다 총 네 주사 필요한 바이러스 = 2μL)을 선택, 촬영마다 바이러스 솔루션의 0.5μL Microinject. 사출 사이트는 서로 떨어져 비틀 거렸다해야합니다. 적절한 사출 사이트 타겟팅은 후각 망울의 개요에 대한 지느러미 두개골 표면을 검색합니다. 이 줄은 반 투명한 피부와 두개골을 통해 출생시 거의 표시됩니다. 측면마다이 주사를하려면 중간 축에 하나의 전구 개요 단 주동이의 한 주사를 목표로하고 있습니다. 전구 개요에 가로 두 번째 삽입을 만들고, 아직 medially 있도​​록 전구 아래 ventrally있는 후각 상피에 도달할 수있는 주사 각도 있는지 확인하십시오. 후각 망울을 관통하지 마십시오!
  5. 잔여 바이러스 솔루션이나 Kimwipe를 사용하여 주사 사이트 또는 코에 구멍에서 탈출 수도 혈액을 건조 얼룩. 즉시 희석 액체 표백제 생물 학적 컨테이너에 Kimwipes 처분.
  6. 물침 인큐베이터에 주입 마우스를 놓습니다.
  7. 반복은 마우스마다 바이러스 주식 2μL에 대해 필요합니다 기억, 주입하는 모든 마우스에 대해 1-4 단계를 반복합니다.
  8. 원래 둥지 케이지에게 돌아가기 전에 쥐가 30 분 물침 인큐베이터에서 복구하자.
  9. 액체 표백제 생물 학적 처리에 microinjection 무대, 살균 잎사귀와 별도의 청소 종이 제품의 폐기.
  10. 으로 준비 단계에서 수행 반복 열망과 에탄올의 배출 후 물로 해밀턴 주사기를 청소합니다. 주사기가 건조 수 있습니다.
  11. 최대 전달 효율을위한 4 시간 만에 다시이 절차를 반복합니다. 감염 OSNs 사흘 같은 몇 가지로 세포의 길이에 걸쳐 시각 수 있습니다.

3. 부동 후각 망울 섹션의 Immunohistochemistry

  1. 원하는 시점에 주입 마우스를 희생과 재관류는 4 % paraformaldehyde로 조직을 수정. OB를 해부하다. 하룻밤 숙박 후 paraformaldehyde의 PBS에서 30 % 자당을 품어. 드라이 아이스에서 OCT의 포함 매체에 삽입할 수 있습니다.
  2. 코로나 OB 섹션은 그라 이오 스탯을 사용하여 두께 60μm에서 얻을 수 있습니다. 5mL 1X PBS (산도 7.4)와 10cm 문화 요리에 전구 섹션을 지나간다. 제는 D에 OCT를 허용하도록 PBS에 떠 보관해야합니다issolve. 50mL 원뿔 유리병에 떠있는 섹션과 PBS를 전송합니다.
  3. 섹션 유리병의 바닥에 정착하도록 허용합니다. 어떤 부분을 빨아하지 않고 PBS에서 진공. 20mL PBS로 조직 섹션 린스. 정착하고 진공 청소기로 청소하는 단계를 반복합니다. 10mL PBS과 immunostaining을위한 15mL 원뿔 유리병로 전송 부동 섹션 Resuspend 조직. 일단 조직 섹션 조직을 방해하지 않고, PBS 뜨는에서 진공을 해결했습니다. 와 Resuspend 섹션 0.3 % 트리톤 1X PBS, 세제는 세포 세포막을 구멍 수 있도록 산도 7.4 (PBS - TX)에 X - 100. 실온에서 10 분 알을 품다. 두 번 PBS - TX로 뜨는 반복 보육에서 진공.
  4. 상온에서 두 시간 동안 차단 솔루션의 10mL (PBS - TX의 5 % 목마 ​​혈청)에 조직 섹션을 품어.
  5. 십오분 상온에서 각각 PBS - TX로 적어도 두 번 차단 솔루션을 씻어.
  6. PBS - TX에 프라이 머리 항체 솔루션의 2mL를 준비합니다. 시약이 실험에 사용된 항체에 대한 장비 섹션을 참조하십시오.
  7. 기본 항체 솔루션 초 PBS - TX 차단 세차를 교체하십시오. ° C 24-48시간에 대한 60μm 부동 섹션으로 철저한 침투력을 보장하기 위해 4 천천히 락을 플랫폼 (~ 30rpm)에 품어.
  8. 부화 후, 기본 항체 솔루션은 4 조심스럽게 피펫을 사용하여 검색하고 저장할 수 있습니다 ° 얼룩 강도의 큰 손실없이 2 주 이내에 두 번 더 최대 재사용을위한 C.
  9. 이십분 부드러운 회전 (~ 30rpm)로 실온에서 각 섹션에게 PBS - TX에 세 번 씻으십시오.
  10. PBS - TX에서 이차 항체 희석의 2mL를 준비합니다. 마지막 세척을 진공 및 조직 섹션 차 항체 솔루션을 추가합니다. 형광단의 photobleaching가 발생할 수 있습니다 빛을 차단하기 위해 알루미늄 호일에있는 얼룩의 약병의 바깥쪽을 바꿈. 장소는 4 ° C 하룻밤에 천천히 락을 플랫폼과 부화에 병을 감쌌다.
  11. 거리 청소에 의해 이차 항체 솔루션을 폐기하십시오. 이십분 상온에서 각각 PBS - TX로 한 섹션을 씻으십시오. 이십분 상온에서 각각 PBS와 함께 두 개의 추가 회 (산도 7.4)을 씻어. Fluoromount G.를 사용하여 유리 슬라이드에 스테인드 조직 섹션 마운트
  12. 형광 현미경으로 적극적으로 감염된 OSN의 axons 및 축삭의 테르 미니에 대한 스테인드 섹션을 통해 화면.
  13. 표시 OSN 축삭 터미널 아버의 3 차원보기를 구성하려면 공촛점 현미경을 사용하여 대상 OB 조직 슬라이스 (Z 축 따라)의 60μm 깊이를 통해 광학 섹션 일련의합니다.
  14. Z - 섹션 영상이 스택은 이후 전체 터미널 아버 세부 사항을 포함하여 단일 레이블 OSN 축삭의 360 ° 회전 관점을 재구성 함께 예상하실 수 있습니다. 어떤 하나의 회전 각도를 캡처 및 2D 형식으로 프레 젠 테이션을위한 이미지 파일 (예 : JPG, TIFF)로 내보낼 수 있습니다.

4. 대표 결과

방법이 여기에 설명된로, 우리는 생체내에 lentivirus의 후각 감각 뉴런을 transduce 수 있습니다. 우리는 따라서 GFP와 mCherry 형광 기자까지 시각 감염 OSNs뿐만과 immunocytochemistry를 통해 myc - 태그 융합 단백질 있습니다. 이 기술은 감염 OSNs의 풍부를 제공합니다. 그래도, 형질 도입 따라서 단일 세포 형태의 분석을 위해 수 있도록 개별적으로 표시된 OSNs를 제공하기 위해 산발적으로 충분히 발생합니다. Axons 및 축삭 터미널은 공촛점 현미경 (그림 1)에 의해 자신의 기본 환경 가운데 OB 조직 섹션 내에 몇 군데 있습니다. 전체 OSN 축삭 터미널 아버은 일반적으로 40 - 50μm 광 섹션 매료 수 있습니다. 감염 OSN의 축삭 터미널 높은 배율은 사구체 계층에서 axonal 아버 형태의 상세 분석을 수 있습니다.


그림 1. 하나의 후각 감각 뉴런 축삭과 터미널 아버의 탄도.) 후각 신경 층 (ONL)를 보여주는 P7 마우스의 후각 망울의 코로나 섹션 OMP (적색)에 대한 immunostained과 사구체 층 (GL)는 OMP 모두 immunostained 그리고 Vglut2 (회색). GFP (녹색)를 표현하는 하나의 후각 감각 신경 세포의 축삭은 ONL 내의 여행과 사구체 구조로 침투. B) glomerulus 내에 축삭 터미널 아버 형태 명확하게 GFP 표현으로 강조했다. 회색 Vglut2 공동 얼룩은 GFP 양성 축삭은 터미널 에이버을 elaborates하는 시간 전체 glomular 지역을 조명. C) Lentiviral 감염 OSNs는 OE에서 GFP (녹색)를 표현. 후각 상피의 cytostructure는 DAPI의 얼룩 (파란색)과 함께 표시됩니다. GFP 표현은 OE에서 OSN 세포 기관과 세포 프로세스의 시각화 수 있습니다. D) Rap1GAP2 표정으로 OSN의 축삭과 터미널 형태 노크 다운 shRNA로. 아래 마우스 U6업자와 GFP 이하 Rap1GAP2 shRNA와 듀얼 표현 카세트를 들고 LentivirusesCMV 프로 모터는 OE에 적용되었습니다. GFP 전용 제어의 비교 감염 후각 축삭 터미널보다 단순 터미널 아버을 전시. 바 = 20μm.

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Discussion

OSN의 게놈의 DNA에 유전자 구조의 영구 양도에 lentivirus 결과의 Microinjection. 이러한 접근 방식은 우리가 overexpression 또는 shRNA의 중재 노크 다운을 통해 후보 유전자의 단기 또는 장기 조작을 수행할 수 있습니다. 또한, 우리는 찬란 odorant 수용체 집단의 공동 현지화을 관찰하기 위해 기존의 유전자 변형 마우스 라인에서 단일 OSNs 레이블을하실 수 있습니다. Microinjection은 OSNs의 lentiviral 도입이 필요합니다. 우리는 어떤 성공도없이 OSNs을 transduce하는 비강에 lentivirus 서스펜션 플러싱 시도했습니다. 따라서 OSN 세포 기관 거짓말 OE의 내부 레이어에 바이러스를 전달하기 위해 지느러미 코의 표면을 통해 microinjections을 수행합니다.

adenoviral 기존의 조작을 통해 lentivirus을 사용하는 많은 장점이 있습니다. 아데노 바이러스는 유전자 조작의 제한 timecourse (도이 외., 2005)에서만 과도 transfection을 제공하면서 Lentivral 도입은 장기적인 연구를 허용 게놈에 통합되어 있습니다. 우리는 lentivirally 삼개월 후 microinjection만큼 OSNs을 transduced 감지했습니다. 성인 설치류의 OSNs의 수명은 1~3개월 사이에 일반적으로있다. Lentiviral 감염 OSNs 따라서 OSN 축삭의 성장, 시​​냅스 형성 및 유지 보수뿐만 아니라, odorant - 자극 반응과 매출 프로세스의 조사를 허용, 그들의 일생의 대부분을 통해 시각 수 있습니다. 또한, lentiviruses는 물론 전구 세포를 감염하고 시간 이상 기간 동안 OSNs의 시각화를 허용할 수 있습니다. 비강의 캐비티 (조 외., 1996)에 들어갈 때 아데노 바이러스가 쉽게 OSNs을 transduces. 그러나, adenoviral 감염은 종종 노출의 관점에서 광범위한 있으며, 같은 안정 lentivirus로 분리된 단일 세포 transductions를 얻을하지 않습니다. OSNs에 Lentiviral - 중재 유전자 조작 따라서 생체내 단일 OSNs의 유전자 기능의 특성화를위한 강력하고 효율적인 기술입니다.

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Disclosures

이 프로토콜은 생물 안전 수준이 호환됩니다. 모든 적절한 작업 공간, 개인 보호 및 바이러스성 폐기물 억제 대책이 따라 설립되었습니다. 모든 동물의 절차 IACUC 지침에 따라 수행되었다.

Acknowledgments

이 연구는 NIH DC052256 DC006015하고, 그리고 QG 및 BS에 T32 - DC008072에 NSF 0,324,769에 의해 지원됩니다.

Materials

Microinjection: Newborn mice were microinjected using a 5μL Hamilton syringe (Hamilton #7647-01) fitted with a 33 gauge needle (Hamilton #7762-06).

Immunocytochemistry Reagents: Primary antibodies: rabbit polyclonal antibody GFP (Molecular Probes# A-6455), chicken polyclonal antibody against OMP (custom) (Chen et al., 2005), guinea pig polyclonal antibody against VGlut2 (Millipore# AB2251). Secondary antibodies: Cy2-conjugated donkey anti-rabbit (Jackson Immunolab# 711-225-152), Cy3-conjugated donkey-anti-chicken (Jackson Immunolab# 703-165-155) and Cy5-conjugated goat anti-guinea pig (Jackson Immunolab# 106-175-008). Sections were mounted on glass slides with Fluoromount G (Southern Biotech# 0010-01) with 50ng/mL DAPI chromatin stain solution.

Confocal Imaging: Z-stack images were taken using an Olympus Flouview FV1000 confocal microscope and images collected and processed into 3D projections using Olympus FV10-ASW 2.01 confocal acquisition and analysis software.

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References

  1. Chen, H., Kohno, K., Gong, Q. Conditional ablation of mature olfactory sensory neurons mediated by diphtheria toxin receptor. J Neurocytol. 34, 1-2 (2005).
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  4. Zhao, H., Otaki, J. M., Firestein, S. Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory neurons in vivo. J Neurobiol. 30, 521-530 (1996).

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Sadrian, B., Chen, H., Gong, Q.… More

Sadrian, B., Chen, H., Gong, Q. Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo. J. Vis. Exp. (51), e2951, doi:10.3791/2951 (2011).

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