Summary
我々は、単一の嗅覚ニューロンの軸索とその終末分枝の遺伝子操作と可視化のためのレンチウイルス技術を提示
Abstract
正確な嗅覚回路の開発は、嗅球（OB）で、そのシナプスのターゲットへの嗅覚ニューロン（OSN）軸索の正確な投影に依存しています。 OSN軸索の成長と標的の分子メカニズムはよく理解されていない。遺伝子発現を操作すると、単一のOSNの軸索とその終末の形態の可視化、その後のことはこれまでに挑戦されている。指定された時間フレーム内の単一細胞レベルでの遺伝子機能を調べるために、我々は、in vivoで OSNsで遺伝子発現を操作するレンチウイルスベースの技術を開発。レンチウイルス粒子は、嗅上皮（OE）にマイクロインジェクションによってOSNsに配信されます。発現カセットは、その後、恒久的に形質導入OSNsのゲノムに組み込まれている。緑色蛍光タンパク質の発現は、感染したOSNsを識別し、軸索終末分を含めて、彼らの全体の形態の概要を説明します。マイクロインジェクションし、レポーターの検出との間の短いターンアラウンドタイムのために、遺伝子機能の研究は、開発の非常に狭い期間内に集中することができます。この方法では、我々は、3日間、わずか三ヶ月限り、次の注入内でGFPの発現を検出した。私たちは、ノックダウンレンチウイルスマイクロインジェクションによって媒介過剰発現やshRNAの両方を達成している。このメソッドは、 生体内での単一細胞レベルでのOSN細胞体と軸索の詳細な形態を提供するため、嗅覚、開発中の候補遺伝子の機能の特性評価が可能になります。
Protocol
1。準備
この手順では、バイオセーフティーレベル2であり、従って、以下のすべての準備がマイクロインジェクションの手順が実行されるバイオハザードフードで作られています。
- 準備と予備加熱。37℃のウォーターベッド：水とビニール袋を記入 - 空に加熱ブロックインキュベーターのシールとのセットを。これは、マウスは、次の注入を回復することができます。
- この手順からのすべての廃棄物の浸漬に適した量に10％漂白剤でバイオハザード廃棄物容器を埋める。
- 70％エタノールおよび生物学的安全キャビネットの滅菌ddH2Oと場所で2番目の皿の小さなオープン皿を準備します。
- プランジャーは、すべての方法を引き出して70％エタノールで体や針の下に噴霧することにより、33ゲージ針で5μL容量ハミルトンシリンジを滅菌する。繰り返し皿からエタノールを吸引除去し、少なくとも5回、それすべての方法を取り出します。
- 少なくとも5回吸引して排出する滅菌水で注射器のカートリッジを洗浄します。安全な場所文化のフードで注射器を置き、それが乾燥することができます。
- 解凍できるように、氷上で-80℃の冷凍庫に保管し、場所からウイルスストックを取り外します。マイクロインジェクションは、10 9感染単位/ mLの力価でマウスあたりのウイルスストックの2μlを必要とします。レンチウイルスは、確立されたプロトコル（ロイスら 、2002）によると商業的供給源から入手または実験室で製造することができる。
- フードの表面から浮き出た面積を提供するインジェクション段階を準備 - キムワイプのシートで覆われた10cmの培養皿を使用することができます。
- 注入駅近くのアルコール綿を手配。
2。嗅上皮へのレンチウイルス粒子のマイクロインジェクション
このメソッドで実行されるすべての動物の手順はIACUC承認されたガイドラインに基づいて行われます。ハツカネズミ系統C57BL/6Jは、ここに示したすべての実験で用いた動物モデルである。
- ケージから子犬マウス（P0 - P3）を取り出し、氷上で5分間のカット、オープン手袋に子犬を置くことによって、低体温による仔マウスをAnaesthetize。
- 子犬が滅菌ハミルトンシリンジにウイルスストックの完全に麻酔、吸引2μlをされるのを待つ間。
- 注射のステージの上に子犬マウスを置きます。ゆっくりと首の上部に向かって耳に頭の上から離れて肌を引き出します。これは、鼻腔を介して教えて皮膚表面を提供する必要がありますし、注入を容易に行うことができる。
- 嗅上皮に到達するための皮膚表面下に3ミリメートル程度鼻腔の上部から針を挿入します。左と右の両方の側面ごとに2つのサイトを、（マウス1匹あたり合計4回の注射に必要なウイルスの=2μlの）選択、ショットごとのウイルス溶液の0.5μLを顕微注入する。注射部位は、互いに間隔ずらして配置する必要があります。適切な注射部位を標的とするために、嗅球の概要については、背側頭蓋骨表面を検索する。この行は、半透明の皮膚や頭蓋骨を介して出生時にほとんど見えないです。側面ごとに2回の注射を行うには、中心軸一つの電球の輪郭にちょうど吻側回の注射を目指しています。電球の輪郭に横秒の挿入を行い、まだ内側にするので、電球の下に腹側に存在する嗅上皮に到達する可能性があることを注入を角度にしてください。嗅球を貫通しないでください！
- 注射部位またはキムワイプを使用して鼻孔の開口部から脱出する可能性のある残存ウイルス液や血液を乾燥汚点。直ちに希釈液の漂白剤バイオハザード容器にキムワイプ処分する。
- ウォーターベッドのインキュベーターに注入マウスを置きます。
- 繰り返しますがマウス当たりウイルスストックの2μlの約が必要になります覚えて、注入されるすべてのマウスの1-4を繰り返します。
- 元のネストケージに戻す前に、マウスが30分間ウォーターベッドのインキュベーターにリカバリできます。
- マイクロインジェクションのステージ、消毒ワイプと液体漂白剤バイオハザード廃棄に余分なクリーニングの紙製品を廃棄してください。
- として準備のステップで行う繰り返し吸引とエタノールの放出し、水でハミルトンシリンジを清掃してください。シリンジが乾燥することができます。
- 最大の導入効率のために4時間で再び、この手順を繰り返します。感染OSNsは3日間、わずかに細胞の長さにわたって可視化されることがあります。
3。フローティング嗅球切片の免疫組織化学
- 希望する時点で注入マウスを犠牲にし、血流は、4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定する。 OBをばらばらにする。一晩一晩して、パラホルムアルデヒドでPBSに30％ショ糖をインキュベートする。ドライアイス上のOCT包埋媒体に埋め込む。
- 冠状OBのセクションは、クライオスタットを用いて厚さ60μmで得られる。 5mLの1 × PBS（pH7.4）で10cmの培養皿に電球のセクションをスイープ。セクションは、DにOCTを許可するようにPBSに浮かんで維持する必要がありますissolve。 50mLのコニカルバイアルにフローティングセクションとPBSを転送する。
- セクションはバイアルの底に沈降することができます。任意のセクションを吸うことなく、PBS掃除機で吸い取る。 20mlのPBSで組織切片を洗浄します。落ち着くと掃除機をかける手順を繰り返します。 10mLのPBSと免疫染色用15mlのコニカルバイアルへの転送フローティングセクションで再懸濁します組織。一度組織切片では、組織を乱すことなく、PBS清オフ真空を解決している。 0.3パーセントトリトンX - 100界面活性剤は細胞膜を穿孔することができます1X PBS、pH7.4の（PBS - TX）にある再懸濁しますセクション。室温で10分間インキュベートする。 PBS - TXと上清と繰り返しインキュベーションオフ真空倍。
- 室温で2時間ブロッキング溶液の10mLを（PBS - TXの5％ウマ血清）で組織切片をインキュベートします。
- 室温で15分間ごとに、PBS - TXで少なくとも二回ブロッキング溶液を洗い流す。
- PBS - TXでの一次抗体溶液の2mLのを準備します。この実験で使用した抗体のための試薬および器具のセクションを参照してください。
- 一次抗体溶液で2番目のPBS - Txのブロッキング洗浄を交換してください。 ℃で24〜48時間60μmフローティングセクションに徹底浸透を確実にするために4℃でゆっくり振盪プラットフォーム（〜30rpm）でインキュベートする。
- インキュベーション後、一次抗体溶液を注意深くピペットを使って取り出すことができますし、4℃で保存強度を染色のいずれかをあまり失うことなく、二週間以内にさらに2回まで再利用のためのC。
- 穏やかに回転（〜30rpm）で、室温で切片を20分ごとに、PBS - TXで3回洗浄する。
- PBS - TXの二次抗体の希釈の2mLのを準備します。最後の洗浄を掃除機で吸い取ると組織切片への二次抗体溶液を加える。フルオロフォアの光退色を引き起こす可能性がある光を、遮断するアルミ箔で染色バイアルの外側を包みます。場所は、4℃で一晩ゆっくりと揺動プラットフォームとインキュベートでバイアルを包んだ。
- 離れて掃除機で二次抗体溶液を捨てる。室温で20分間ごとに、PBS - TXで一回のセクションを洗ってください。室温で20分間ずつPBSでさらに2回（pH7.4）をすすいでください。 Fluoromount G.を使用してガラススライド上に染色した組織切片をマウントします。
- 蛍光顕微鏡で積極的に感染OSNの軸索と軸索の末端のための染色切片を介してスクリーン。
- ラベル付けOSN軸索と終末の三次元ビューを構築するために、共焦点顕微鏡を使用してターゲットOBの組織切片（z軸に沿った）の60μmの深さを介して光セクションのシリーズを作る。
- Z -セクションの画像のこのスタックは、その後、その全体のターミナルアーバの詳細を含む単一のラベルが付いたOSN軸索の360 °回転する視点を、再構築するために一緒に投影することができます。いずれかの単一の回転角度がキャプチャされ、2次元形式のプレゼンテーション用のイメージファイル（例：JPG、TIFF）としてエクスポートすることができます。
4。代表的な結果
方法はここで説明すると、我々はin vivoでのレンチウイルスによって嗅覚ニューロンを伝達することができます。我々はこれまで免疫細胞を介したmycタグ融合タンパク質と同様に、GFPとmCherry蛍光レポーターと感染OSNsを可視化した。この手法は、感染したOSNsの豊富さを提供します。それでも、伝達では、単一の細胞形態の解析を可能にする、個別にラベル付けOSNsを提供するために散発的に十分に発生します。軸索と軸索末端は、共焦点顕微鏡（図1）により、ネイティブな環境に囲まれたOB組織切片内に撮像されています。全体OSN軸索終末は通常40 -50μmの光学部内で魅了することができます。感染OSNの軸索末端の高倍率は、糸球体層における軸索のアーバーの形態の詳細な分析を行うことができます。
図1。単一の嗅覚ニューロンの軸索とその端末のアーバーの軌跡。）嗅神経層（ONL）を示すP7のマウスの嗅球の冠状セクションでは、OMP（赤）を免疫染色し、糸球体層（GL）は、OMPの両方を用いて免疫染色とVglut2（グレー）。 GFP（緑）を発現する単一の嗅覚ニューロンの軸索は、ONL内に移動し、糸球体の構造に浸透する。 B）糸球体内の軸索終末の形態は、明らかにGFPの発現によって強調。灰色のVglut2共同染色は、GFP陽性の軸索は、端末のABORをきれいに仕上ている内に、総glomular面積を照らす。 C）OEにおけるGFP（緑）を発現するレンチウイルス感染OSNsが。嗅上皮のcytostructureは、DAPI染色（青色）で表示されます。 GFPの発現は、OEのOSNの細胞体およびそれらの細胞プロセスを可視化できる。 D）Rap1GAP2発現とOSNの軸索とその端末の形態がノックダウンしたshRNAによる。下のマウスU6プロモーターとGFPの下Rap1GAP2 shRNAを使用してデュアル発現カセットを運ぶレンチウイルスCMVプロモーターは、OEに適用した。 GFPのみのコントロールのそれと比較した場合、感染した嗅覚軸索末端はより簡素化されたターミナルアーバーを示した。バー=20μmの。
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Discussion
OSNゲノムDNAに遺伝子構築物の永久的な移転のレンチウイルスの結果のマイクロインジェクション。このアプローチは、私たちは過剰発現またはshRNAを介したノックダウンを経由して候補遺伝子の短期または長期の操作を実行することができます。さらに、我々は蛍光嗅覚受容体の個体群の共局在を観察するために、既存のトランスジェニックマウスのラインで単一のOSNsにラベルを付けることができます。マイクロインジェクションは、OSNsのレンチウイルス形質導入のために必要です。我々は、任意の成功なしOSNsを形質導入する鼻腔内にフラッシュするレンチウイルス懸濁液を試みた。そこで、OSNの細胞体が位置するOEの内側の層にウィルスを配信するために、背側鼻の表面を通してmicroinjectionsを実行します。
確立されたアデノウイルスの操作上のレンチウイルスを使用することには多くの利点があります。アデノウイルスは、遺伝子操作の限られたtimecourse（土井ら 、2005）でのみ一過性トランスフェクションを提供しながらLentivral伝達は、長期的な研究をできるようにゲノムに統合されています。我々はlentivirallyマイクロインジェクション後三ヶ月限りOSNsを形質導入を検出した。成体げっ歯類におけるOSNsの寿命は、通常1〜3ヶ月の間です。レンチウイルス感染OSNsは、このようにOSN軸索の成長、シナプス形成と維持だけでなく、嗅覚刺激による反応と売上高のプロセスの調査を可能にする、彼らの生涯の大半を通じて可視化することができる。さらに、レンチウイルスは、同様に前駆細胞に感染し、長い期間のためのOSNsの可視化を許可することができます。鼻腔（趙ら 、1996）に注入するときにアデノウイルスは、容易にOSNsを伝達する。しかし、アデノウイルス感染症はしばしば曝露の点から広がっている、とのような信頼性の高いレンチウイルスとして分離された単一のセルtransductionsを生成しません。 OSNsのレンチウイルスを介した遺伝子操作は、したがって、in vivoで単OSNsにおける遺伝子機能の特性評価のための強力かつ効率的な手法です。
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Disclosures
このプロトコルは、バイオセーフティレベル2に準拠しています。すべての適切なワークスペース、個人用保護具、およびウイルス性廃棄物の封じ込め対策がそれに応じて確立されている。すべての動物の手順は、IACUCガイドラインに従って行った。
Acknowledgments
本研究では、BSにQGとT32 - DC008072にNIH DC052256とDC006015、およびNSF 0324769によってサポートされています。
Materials
Microinjection: Newborn mice were microinjected using a 5μL Hamilton syringe (Hamilton #7647-01) fitted with a 33 gauge needle (Hamilton #7762-06). Immunocytochemistry Reagents: Primary antibodies: rabbit polyclonal antibody GFP (Molecular Probes# A-6455), chicken polyclonal antibody against OMP (custom) (Chen et al., 2005), guinea pig polyclonal antibody against VGlut2 (Millipore# AB2251). Secondary antibodies: Cy2-conjugated donkey anti-rabbit (Jackson Immunolab# 711-225-152), Cy3-conjugated donkey-anti-chicken (Jackson Immunolab# 703-165-155) and Cy5-conjugated goat anti-guinea pig (Jackson Immunolab# 106-175-008). Sections were mounted on glass slides with Fluoromount G (Southern Biotech# 0010-01) with 50ng/mL DAPI chromatin stain solution. Confocal Imaging: Z-stack images were taken using an Olympus Flouview FV1000 confocal microscope and images collected and processed into 3D projections using Olympus FV10-ASW 2.01 confocal acquisition and analysis software. |
References
- Chen, H., Kohno, K., Gong, Q. Conditional ablation of mature olfactory sensory neurons mediated by diphtheria toxin receptor. J Neurocytol. 34, 1-2 (2005).
- Doi, K., Nibu, K., Ishida, H., Okado, H., Terashima, T. Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory epithelium and olfactory bulb: a long-term study. Ann Otol Rhinol Laryngol. 114, 629-633 (2005).
- Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295, 868-872 (2002).
- Zhao, H., Otaki, J. M., Firestein, S. Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory neurons in vivo. J Neurobiol. 30, 521-530 (1996).
