Summary
Мы представляем лентивирусов методика генетических манипуляций и визуализации одной обонятельной сенсорных аксонов нейронов и его терминал разветвление
Abstract
Развитие точных обонятельных схема опирается на точные проекции обонятельной сенсорных нейронов (ОСН), аксоны их синаптических целей в обонятельной луковице (OB). Молекулярные механизмы OSN аксон роста и ориентации не до конца понятны. Манипулирование экспрессии генов и последующей визуализации одного аксонов OSN и их терминал беседка морфологии до сих пор подвергают сомнению. Для изучения функций генов на одном уровне ячейки в указанный период времени, мы разработали лентивирусов техника выполнения манипулировать экспрессии генов в OSNs в естественных условиях. Лентивирусов частицы поступают в OSNs путем микроинъекции в обонятельный эпителий (OE). Выражение кассеты затем постоянно интегрироваться в геном трансдуцированных OSNs. Зеленый флуоресцентный белок определяет выражение инфицированных OSNs и очертания всей своей морфологии, в том числе аксон терминал беседке. Из-за короткого времени оборота между микроинъекции и репортер обнаружения, исследования функции генов может быть сосредоточено в пределах очень узкого периода развития. С помощью этого метода, мы обнаружили GFP выражение в всего лишь три дня и в течение трех месяцев после инъекции. Мы достигли как по-выражения и shRNA опосредованной нокдауна от лентивирусов микроинъекции. Этот метод обеспечивает подробные морфология OSN клеточных тел и аксонов на одном уровне клетка в живом организме, и таким образом позволяет характеристику кандидата функции генов обонятельных во время развития.
Protocol
1. Подготовка
Эта процедура биобезопасности 2-го уровня, поэтому все следующие препараты производятся в биологически опасных капотом, где микроинъекции процедура будет выполнена.
- Подготовка и подогрева 37 ° С водяной кровати: Заполнить пластиковый мешок хранения с водой - печать и установлен на опустели нагревательный блок инкубатора. Это позволит восстановить мышей после инъекции.
- Заполните контейнер для биологически опасных отходов с 10% хлорной извести на подходящего объема для погружения всех отходов от этой процедуры.
- Подготовка небольшой открытый блюдо из 70% этанола и второе блюдо с стерилизовать ddH2O и место в шкафу биологической безопасности.
- Стерилизовать 5 мкл мощностью Гамильтон шприц с 33-иглы путем распыления вниз тела и иглы с 70% этанола с поршнем вытащил все пути. Неоднократно аспирата этанола из блюду и выбросит все это путь, по крайней мере в 5 раз.
- Промойте шприц картридж, аспирационных и извлечения стерильной воды не менее 5 раз. Место шприца безопасно в сторону в культуре капот и дайте ему высохнуть.
- Удалить вирусной акции от -80 ° C хранения морозильника и поместить на лед, чтобы оттаивания. Микроинъекция требует 2μL вируса акции на мышь в титре 10 9 инфекционных единиц / мл. Лентивирусов могут быть получены из коммерческих источников или произведенных в лаборатории в соответствии с установленным протоколом (Лоис и соавт., 2002).
- Подготовка инъекций этап, который обеспечивает область приподнята над поверхностью капота - можете использовать блюдо 10 см культуры покрыта листом Kimwipe.
- Упорядочить спиртовые салфетки возле станции инъекции.
2. Микроинъекции лентивирусов частиц в обонятельный эпителий
Все животные процедур, выполняемых в этом методе осуществляется в соответствии с IACUC утверждены методические рекомендации. Мышцы Mus штамм C57BL/6J это животное, модель, используемая во всех экспериментах показано здесь.
- Анестезировать мыши щенков от переохлаждения, взяв щенка мыши (P0-P3) из клетки и положить щенка на отключения открытой перчаткой на льду в течение 5 минут.
- В ожидании щенок будет полностью под наркозом, аспирацию 2μL вирусных акций в стерилизованные шприцы Hamilton.
- Наведите щенка на вершине инъекции стадии. Осторожно потяните кожу от верхней части головы возле уха в направлении верхней части шеи. Это должно обеспечить учил поверхности кожи в течение полости носа и облегчит инъекции.
- Вставьте иглу через верхнюю часть носовой полости около 3 мм ниже поверхности кожи, чтобы достичь обонятельного эпителия. Microinject 0.5μL вируса решение за выстрел, выбор два участка с каждой стороны, и левые, и правые (четыре инъекции в целом на мышь = 2μL вируса необходимо). Инъекция сайты должны быть расположены зигзагообразно друг от друга. Для нападения на надлежащее для инъекции, поиск дорсальной поверхности черепа для подготовки плана обонятельной луковице. Эта линия едва заметны при рождении через полупрозрачное кожу и череп. Чтобы сделать две инъекции с каждой стороны, цель одна инъекция только ростральнее одну луковицу наброски на медиальной оси. Сделать второй вставки по бокам от лампы наброски, но убедитесь, что угол инъекции медиально, чтобы вы могли достичь обонятельный эпителий, который находится снизу под лампой. Избегайте проникающее обонятельной луковице!
- Пятно сухой любой остаточной решение вирус или кровь, которая может выйти из места инъекции или ноздрю отверстия использованием Kimwipe. Сразу распоряжаться Kimwipes в разбавленных жидких отбеливателя контейнер для биологически опасных.
- Место инъекции мыши на водяной кровати инкубатора.
- Повторите шаги 1-4 для всех мышей, который будет введен, помня, вам потребуется около 2μL вируса акции на мышь.
- Давайте мышей восстановиться на водяной кровати инкубаторе в течение 30 минут перед их возвращением в первоначальное вложение клетки.
- Утилизировать микроинъекции этапе дезинфекции салфетки и каких-либо дополнительных бумажных изделий уборка в жидкий отбеливатель биологически опасных отходов.
- Чистый шприц Гамильтон повторной аспирации и выброса этанола, а затем водой, как это сделано в подготовительных шагов. Разрешить шприц для просушки.
- Для максимальной эффективности трансдукции повторять эту процедуру раз в 4 часа. Зараженные OSNs можно представить по всей длине ячейки в качестве всего лишь три дня.
3. Immunohistochemistry плавучих обонятельных полособульба
- Жертву вводили мыши на нужную точку и время исправить перфузии ткани с 4% параформальдегида. Рассеките из OB. Инкубируйте в параформальдегида течение ночи и затем 30% сахарозы в PBS в течение ночи. Добавить в октябре вложение среды на сухой лед.
- Корональные разделы ОВ, полученных при 60μm толщиной использованием криостата. Развертки лампа разделов в блюдо 10 см культуры с 5 мл 1x PBS (рН 7,4). Разделы должны быть плавающие в ФБР, чтобы октября в гissolve. Передача плавающей разделов и PBS в 50 мл конические пробирки.
- Разрешить разделы оседают на дне флакона. Вакуумные от ФСБ без сосания любые разделы. Промыть срезах тканей с 20 мл PBS. Повторите осесть и пылесосить шагов. Ресуспендируют ткани с 10 мл PBS и передачи плавающей разделы 15мл флакон конические для иммунной окраски. После срезов ткани осели, вакуумные с PBS супернатанта, не нарушая ткани. Ресуспендируют секций с 0,3% Тритон Х-100 в 1x PBS, рН 7,4 (PBS-Tx), что позволяет моющим средством для перфорации мембраны клеток. Инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре. Вакуумные от супернатант и повторите инкубации с PBS-Tx в два раза.
- Инкубируйте срезов ткани в 10 мл блокирующий раствор (5% лошадиной сыворотки в PBS-Tx) в течение двух часов при комнатной температуре.
- Промыть блокирующий раствор по крайней мере два раза PBS-Tx в течение 15 минут при комнатной температуре.
- Подготовка 2 мл первичного решение антител в PBS-Tx. Смотрите Реактивы и оборудование раздел на наличие антител, используемых в этом эксперименте.
- Замените вторую PBS-Tx блокирование мыть с первичным решением антител. Инкубировать на медленно качалки платформы (~ 30rpm) при 4 ° С в течение 24-48 часов, чтобы обеспечить полное проникновение в 60μm плавающей разделов.
- После инкубации, первичных антител решение может быть восстановлена, тщательно используя пипетку и хранить при температуре 4 ° С для повторного использования до двух раз в течение двух недель без каких-либо значительных потерь интенсивности окрашивания.
- Вымойте разделы три раза PBS-Tx в течение 20 минут каждый при комнатной температуре с легким вращением (~ 30rpm).
- Подготовка 2 мл вторичного разведения антител в PBS-Tx. Вакуумные от последнего вымыть и добавить вторичные антитела к решению срезах тканей. Заверните за пределами окрашивания флакон в алюминиевую фольгу, чтобы блокировать свет, что может привести к флуорофора фотообесцвечивания. Место завернуты флакон на медленно качания платформы и инкубировать при температуре 4 ° С в течение ночи.
- Отменить решение вторичных антител пылесосом далеко. Вымойте разделы сразу с PBS-Tx в течение 20 минут каждый при комнатной температуре. Промыть еще два раза с PBS (рН 7,4) в течение 20 минут каждый при комнатной температуре. Горы окрашенные срезы ткани на стеклах использованием Fluoromount Г.
- Экран через окрашенные срезы для положительно зараженный OSN аксонов и аксонов концы с флуоресцентным микроскопом.
- Для построения трехмерного зрения помечены OSN аксон и терминальные беседку, сделать серию оптических срезов через 60μm глубину ткани целевой О.Б. срез (по оси г) с помощью конфокальной микроскопии.
- Этот стек зетовый изображения могут быть впоследствии прогнозируемых вместе, чтобы реконструировать вращающаяся на 360 ° точки зрения одного помечены OSN аксонов, в том числе терминала беседка подробно в полном объеме. Любой из одного угла поворота может быть захвачен и экспортируются в виде графического файла (например, JPG, TIFF) для 2D-формате презентации.
4. Представитель Результаты
С методов, описанных здесь, мы можем преобразовывать обонятельной сенсорных нейронов лентивирус в естественных условиях. До сих пор мы визуализировали инфицированных OSNs с GFP и mCherry флуоресцентные журналистам, а также с Myc с метками гибридный белок через иммуноцитохимия. Этот метод обеспечивает обилие инфицированных OSNs. Тем не менее, трансдукции происходит спорадически достаточно, чтобы обеспечить индивидуальными этикетками OSNs, что позволяет обеспечить анализ одного морфологии клетки. Аксоны и аксонов терминалов в образ будут включены в разделы О.Б. ткани на фоне их родной среде с помощью конфокальной микроскопии (рис. 1). Весь OSN аксон терминал беседку как правило, может быть пленен в 40-50 мкм оптической части. Высокое увеличение зараженных аксонов терминалов OSN позволяет детального анализа морфологии аксонального беседки на клубочковой слоя.
Рисунок 1. Траектория одной обонятельной сенсорных нейрона аксон и его терминал беседке.) Корональной части обонятельной луковицы P7 мыши показывает обонятельный нерв слой (ONL) immunostained для OMP (красный) и клубочковой слоя (GL) immunostained как с OMP и Vglut2 (серый). Одной обонятельной сенсорных аксонов нейронов выражения GFP (зеленый) путешествует в пределах ONL и проникает в клубочковой структуры. Б) Аксон терминал беседка морфологии в клубочек четко подчеркивается GFP выражения. Vglut2 совместного окрашивания в серый освещает общую glomular район, в котором GFP-положительных аксон разрабатывает терминал абортов. С) лентивирусов инфицированных OSNs выражения GFP (зеленый) в OE. Cytostructure из обонятельного эпителия показана с DAPI окрашивания (синий). GFP выражение позволяет визуализировать OSN клеточных тел и их клеточные процессы в OE. D) аксонов OSN и его терминал морфологии с Rap1GAP2 выражение нокдауна от shRNA. Лентивирусов проведение двойной кассетный выражение с Rap1GAP2 shRNA под промоутер мыши U6 и GFP подCMV промотора были применены к OE. Зараженные обонятельных терминалов аксона выставлены более упрощенный терминал беседке, когда по сравнению с GFP только контроль. Bar = 20 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Микроинъекции лентивирус приводит к постоянной передаче генные конструкции в геномной ДНК OSN. Такой подход позволяет нам выполнять краткосрочные или долгосрочные манипуляции генов-кандидатов через гиперэкспрессия или опосредованной shRNA нокдауна. Кроме того, мы можем флуоресцентно этикетке одного OSNs в существующие линии трансгенных мышей для наблюдения совместно локализации популяций одоранта рецептор. Микроинъекция требуется для лентивирусов трансдукции OSNs. Мы попытались промывки лентивирус суспензии в полость носа для трансдукции OSNs без какого-либо успеха. Поэтому мы выполнять микроинъекций через спинной поверхности носа для того, чтобы доставить вирус на внутренних слоях OE, где тела OSN ячейки ложь.
Есть много преимуществ в использовании лентивирус сверх установленных аденовирусных манипуляции. Lentivral трансдукции интегрируется в геном позволяет долгосрочных исследований, в то время как аденовирус дает лишь временной трансфекции с ограниченной timecourse генных манипуляций (Doi и соавт., 2005). Мы обнаружили, lentivirally трансдуцированных OSNs тех пор, пока через три месяца после микроинъекции. Срок службы OSNs у взрослых грызунов, как правило, в пределах 1-3 месяцев. Лентивирусов инфицированных OSNs Таким образом, можно визуализировать через большую часть своей жизни, позволяя исследование OSN аксон рост, синаптическую формирования и ведения, а также одоранта-стимулированных реакций и оборота процесса. Кроме того, лентивирусов могут инфицировать клетки-предшественники, а также и позволяют визуализации OSNs течение более длительных периодов времени. Аденовирус легко преобразовывает OSNs когда вливаются в носовой полости (Zhao и соавт., 1996). Тем не менее, аденовирусная инфекция часто широко с точки воздействия, и не дает изолированном преобразователями ячейки также надежно, как лентивирусов. Лентивирусов-опосредованной генетические манипуляции в OSNs поэтому мощный и эффективный метод для характеристики функции генов в одном OSNs в естественных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Этот протокол является биологической безопасности 2-го уровня совместимым. Все необходимые рабочее пространство, средства индивидуальной защиты, и вирусные меры содержатся отходы были установлены соответствующим образом. Все животные процедуры были выполнены в соответствии с IACUC руководящих принципов.
Acknowledgments
Это исследование проводится при поддержке НИЗ DC052256 и DC006015 и NSF 0324769 на QG и T32-DC008072 к BS.
Materials
Microinjection: Newborn mice were microinjected using a 5μL Hamilton syringe (Hamilton #7647-01) fitted with a 33 gauge needle (Hamilton #7762-06). Immunocytochemistry Reagents: Primary antibodies: rabbit polyclonal antibody GFP (Molecular Probes# A-6455), chicken polyclonal antibody against OMP (custom) (Chen et al., 2005), guinea pig polyclonal antibody against VGlut2 (Millipore# AB2251). Secondary antibodies: Cy2-conjugated donkey anti-rabbit (Jackson Immunolab# 711-225-152), Cy3-conjugated donkey-anti-chicken (Jackson Immunolab# 703-165-155) and Cy5-conjugated goat anti-guinea pig (Jackson Immunolab# 106-175-008). Sections were mounted on glass slides with Fluoromount G (Southern Biotech# 0010-01) with 50ng/mL DAPI chromatin stain solution. Confocal Imaging: Z-stack images were taken using an Olympus Flouview FV1000 confocal microscope and images collected and processed into 3D projections using Olympus FV10-ASW 2.01 confocal acquisition and analysis software. |
References
- Chen, H., Kohno, K., Gong, Q. Conditional ablation of mature olfactory sensory neurons mediated by diphtheria toxin receptor. J Neurocytol. 34, 1-2 (2005).
- Doi, K., Nibu, K., Ishida, H., Okado, H., Terashima, T. Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory epithelium and olfactory bulb: a long-term study. Ann Otol Rhinol Laryngol. 114, 629-633 (2005).
- Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295, 868-872 (2002).
- Zhao, H., Otaki, J. M., Firestein, S. Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory neurons in vivo. J Neurobiol. 30, 521-530 (1996).
