Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Прочная Генерация гепатоцитов-подобных клеток из человеческих эмбриональных стволовых клеток населения

Published: October 26, 2011 doi: 10.3791/2969
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Medical Research Council Centre for Regenerative Medicine, University of Edinburgh

Summary

В этой статье основное внимание будет уделено поколению человека эндодермы печеночной из человеческих эмбриональных стволовых клеточных популяций.

Abstract

Несмотря на прогресс в области моделирования человеческих токсичность препарата, многие соединения неудачу во время клинических испытаний из-за непредвиденных побочных эффектов. Стоимости клинических исследований, были существенными, поэтому очень важно, чтобы более интеллектуальный экраны токсикологии разработаны и развернуты на ранних этапах разработки лекарственных средств (Greenhough и др. 2010). Человеческих гепатоцитов представляют текущие золотым стандартом модель для оценки токсичности препаратов, но ограниченный ресурс, обладающих переменной функции. Таким образом, использование увековечены клеточных линий и моделей животных тканей обычно заняты из-за их изобилия. Хотя оба эти источники являются информативными, они ограничены плохой функции, виды изменчивости и / или нестабильности в культуре (Dalgetty и др. 2009). Плюрипотентные стволовые клетки (ЭСК) являются привлекательной альтернативой источником человеческих гепатоцитов, как клетки (КГ) (Медина и др. 2010). ЭСК способны самообновления и дифференцировки для всех соматических клеток типов из взрослых, и тем самым представляютпотенциально неисчерпаемым источником дифференцированных клеток. Мы разработали процедуру, которая является простой, очень эффективный, поддается автоматизации и дает функциональную человека КГ (Hay и др. 2008; Флетчер и др. 2008; Hannoun и др. 2010; Пейн и др. 2011 и сена и др. 2011). Мы считаем, что наша технология приведет к масштабируемой производства КГ для открытия новых лекарств, болезнь моделирования, строительства дополнительных устройств-телесной и, возможно, клетка терапии на основе трансплантации.

Protocol

1. Первоначальная подготовка всех химических запасов и покрытия культуры Пластик

Все шаги, которые необходимо проводить в капот культуры ткани в асептических условиях.

  1. Подготовка человека основной фактор роста фибробластов (hbFGF)
    1. Подготовка 10% BSA решение в PBS и фильтруют через фильтр 0,22 мкм.
    2. С 10% раствора BSA подготовить 0,2% BSA решение.
    3. Добавить 10 мл 0,2% BSA solution/100 мкг hbFGF.
    4. Предварительно мокрой 0,22 мкм фильтр с помощью фильтрации 5 мл 10% BSA решение через фильтр. Откажитесь от 10 мл BSA стирки.
    5. Фильтры hbFGF через предварительно мыть фильтр.
    6. Алиготе hbFGF в стерильных eppendorfs и хранить при температуре -20 ° C.
  2. Подготовка по правам активин маточного раствора
    1. Добавить 1 мл 0,2% BSA в шприц и предварительно мокрым фильтром.
    2. Развести активин в 0,2% BSA в запас концентрации 100 мкг / мл.
    3. Фильтры Activiл раствора и аликвоты в стерильные eppendorfs, хранить при -20 ° C.
  3. Подготовка Мышь маточного раствора Wnt3a
    1. Добавить 200 мкл PBS в 2 мкг флакон Wnt3a на фондовом концентрации 10 мкг / мл.
    2. Алиготе в стерильных eppendorfs и хранить при температуре -20 ° C.
  4. Подготовка фонда человеческого HGF Решение (1000X)
    1. Развести HGF в ФБР, чтобы запас концентрации 10 мкг / мл.
    2. Фильтры решение HGF и аликвоты в стерильные eppendorfs, хранить при -20 ° C.
  5. Подготовка Oncostatin М маточного раствора (1000X)
    1. Развести OSM в ФБР, чтобы запас концентрации 20 мкг / мл.
    2. Фильтры OSM решения и аликвоты в стерильные eppendorfs, хранить при -20 ° C.
  6. Покрытие культуры Пластик с Матригель
    1. Оттепель 10 мл фондовом бутылку Матригель ночи при 4 ° С на льду, а затем добавить 10 мл КО-DMEM. Хорошо перемешайте использованием охлажденной пипетки и хранить 1мл аликвоты при -20 ° C.
    2. Оттепель аликвоту Матригель при 4 ° С в течение не менее 2 часов или на ночь, чтобы избежать образования геля.
    3. Добавьте 5 мл холодной КО-DMEM к Матригель, хорошо перемешать с пипеткой.
    4. Сделать до 15 мл холодной КО-DMEM и перемешать с помощью пипетки.
    5. Добавить Матригель на тарелку или колбе, на которую наносится (таблица (я))
Пластина / Колба Объем / Ну или колбу
12-луночного планшета 0,5 мл на лунку
6-луночный планшет 1 мл на лунку
25 см 2 колбы 2 мл в колбе

Таблица 1. Рекомендуемые объемы Матригель для покрытия типичных Пластик для чЭСК культуры.

    1. Инкубируйте покрытием пластины или колба ночи при 4 ° С или комнатуtempature в течение 1 часа перед использованием.
    2. Пластины или колбы, которые были покрыты Матригель можно хранить при температуре 4 ° С в течение 1 недели. Они должны быть четко маркированы с указанием даты они были покрыты. Не использовать пластины или колба не используется в течение одной недели.
      1. Перед употреблением позволяют покрытием контейнер культуры приехать до комнатной температуры внутри капота культуры ткани.
      2. Непосредственно перед применением аспирации Матригель и добавить к клеточной суспензии хорошо или колбу.

2. Текущее техническое обслуживание чЭСК культур и характеристика

  1. Реанимация чЭСК линий
    1. Удалить из ЭСК жидком азоте и быстро оттепели в 37 ° С водяной бане.
    2. Передача клеточной суспензии тщательно стерильную пробирку, содержащую несколько мл теплой среде.
    3. Гранул клетки центрифугированием @ низкой скорости в течение 5 мин (1000 RPM).
    4. Аспирируйте от супернатант и очень нежно resusзависят клеток в теплой среде ES и пластину на слой подачи MEF.
    5. Refeed клетки ежедневно свежей средой ES и на subconfluence, клетки, клетки требуют пассажей.
  2. Текущее обслуживание чЭСК
    ЭС клетки выращиваются в виде пластин или колбы покрыты Матригель. Клетки должны быть исследованы и подается ежедневно:
    1. Изучение под микроскопом на предмет загрязнения, морфологии клеток и слияния.
    2. Аспирируйте провел среды.
    3. Добавить необходимый объем свежих мышиных эмбриональных фибробластов-кондиционированной среды (MEF-CM) + человеческий bFGF (конечная концентрация 4 нг / мл) или других сывороточных свободных средств массовой информации 6.
  3. Пассирования клеток с коллагеназы
    чЭСК линий (H1, H9 и РКМ-1) дойдет до слияния каждые 5-7 дней после пассажей в соотношении 1:3 раскол. Рано ЭСК проход в присутствии стромы растут медленнее и время на Матригель может стать важным фактором. Человеческих ЭСК не следует оставлять более чем на 14дней на том же Матригель из-за деградации и матрицы в данном случае это могут быть необходимы для прохождения клеток на 1:1 или 1:2 Коэффициент распределения, если клетки subconfluent.

    Фермент Инкубационный
    1. Все шаги, которые необходимо проводить в капот культуры ткани в асептических условиях.
    2. Убедиться, что имеется новая Матригель покрытием блюдо или колбу подготовленные как указано в разделе 1.6.
    3. Определите желаемую Коэффициент распределения для клеток. Ряд факторов, которые участвуют в принятии решения Коэффициент распределения:
      1. Высокий уровень стромы с низким числом колоний: можно пассировать обратно в меньших размеров или хорошо можно пассировать 1:01 которая позволит избавиться от некоторых стромы и тем самым увеличить колонии соотношение стромы, способствуя чЭСК роста.
      2. Высокий уровень стромы с большими колониями, в зависимости от числа колоний, можно пассировать 1:1 или 1:2, если Есть достаточно большие колонии чЭСК.
      3. Типичные растущей ЭСК с небольшим улOMA или нет стромы и / или какой-либо дифференциации можно пассировать 1:2 или 3.
      4. Аспирируйте средств массовой информации из колодца или колбу.
      5. Промыть раз с 2 мл PBS (-MgCl 2,-CaCl 2).
      6. Добавить соответствующий объем коллагеназы (200 Ед / мл разведенного в КО-DMEM) и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 2-5 мин. Со 2 минут вперед изучить регулярно под микроскопом (с интервалом 1 минута). В том месте, дифференцированные клетки начинают отрываться и колониях начинают подъем на краю клетки готовы к пассировать.
    Зачистка и пулов ЭСК
      1. Аспирируйте коллагеназы.
      2. Промыть раз с 2 мл PBS (-MgCl 2,-CaCl 2).
      3. Добавить соответствующий объем MEF-CM в зависимости от коэффициенту распределения и использования ячейки Скребок физически устранить клетки с поверхности скважины или колбу, а затем растирают поколенияTLY пипетированием вверх-вниз 2-3 раз с помощью 10 мл пипетки. Важно, что ЭСК находятся в скопления клеток и не разбит на отдельные клетки.
    Replating ЭСК
      1. Replate результате клеточной суспензии на новый Матригель покрытием колбы или колодцев.
      2. Сделать объема MEF-CM до 4 мл для скважины 6-луночный планшет.
      3. При размещении клеток в инкубаторе агитировать контейнер культуре ткани, чтобы обеспечить как можно ровнее распределение колонии колоний, как правило, оседают в центре культуры тканей пластина / колбу, влияющих replating и дифференцировки клеток.
  4. Рутинное характеристика чЭСК населения с помощью проточной цитометрии
    1. чЭСК населения рассматриваются с помощью проточной цитометрии раз в месяц для стволовых клеток маркеры, такие как 3 октября / 4, Tra 1-60 и SSEA-4.
    2. чЭСКнаселения будут сняты с подложкой как отдельные клеточные суспензии следующие 5 минут лечения трипсина / ЭДТА (Invitrogen).
    3. Ресуспендируют одной клетки на 1х10 6 кл / мл в PBS дополнен с 0,1% БСА и 0,1% азида натрия.
    4. Инкубируйте клеточных препаратов при температуре 4 ° С с использованием соответствующей антител в течение 40 минут.
    5. Вымойте клетки дважды с PBS дополнен с 0,1% БСА и 0,1% азида натрия для удаления несвязанных антител и ресуспендируют до конечного объема 100 мкл и анализировать с помощью проточной цитометрии.
    6. Данные за 30000-40000 «живых» событий приобретаются для каждого образца с помощью FACS цитометр калибр оснащен 488-нм лазером и анализируются с помощью программного обеспечения CellQuest (Becton Dickinson, San Jose, CA). Неокрашенные клетки входят в качестве контроля. Мертвые и апоптоза клеток вместе с мусором, были исключены из анализа с использованием электронных жить ворота рассеяния вперед и параметры стороны разбегаются.

3. ДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫЕation из ЭСК к печеночной эндодермы

  1. Подготовка информации для дифференциации ЭСК к печеночной эндодермы. Все подготовке массовой информации должны осуществляться в капот культуры ткани в асептических условиях.
    1. Подготовка RPMI: B27 грунтовки среда для дифференциации эндодермы
      1. Для RPMI-B27 среды, смесь RPMI 1640 (500 мл) и B27 (50х, 10 мл)
      2. Swirl смешать компоненты.
      3. Добавьте все компоненты в фильтр и фильтр под вакуумом, хранить при 4 ° C.
    2. Подготовка SR-ДМСО средой для гепатоцитов дифференциации
      1. Для SR-ДМСО среды, смесь 80% КО-DMEM, 20% КО-SR, 0,5% L-глутамина, 1%, без незаменимых аминокислот, 0,1 мм β-меркаптоэтанол и 1% ДМСО.
      2. Фильтры раствора под vacum, хранить при температуре 4 ° С и аликвоты и храните при температуре от -20 ° C, если потребуется.
      3. Используйте 4 мл на лунку 6-луночный планшет, и 6 мл на T25 колбу.
    3. Подготовка L15 созревания среда для HEPAtocyte созревания
      1. Для L-15 средний, смешать 500 мл Лейбовиц L-15 среде, tryptose фосфат бульон (конечная концентрация 8,3%), тепло инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (конечная концентрация 8,3%), 10 мкМ гидрокортизона 21-гемисукцинат, 1 мкМ Инсулин (бычий поджелудочной железы ), 1% L-глутамина, 0,2% аскорбиновой кислоты.
      2. Фильтры раствора под vacum, хранить при температуре 4 ° С и аликвоты и храните при температуре от -20 ° C, если потребуется.
    4. Подготовка окончательного RPMI: B27 грунтовки среда
      1. Внесите необходимый объем грунтовки среда для эксперимента (1 мл на лунку 6-луночный планшет, и 2 мл в колбе T25).
      2. Добавить активин до конечной концентрации 100 нг / мл.
      3. Добавить рекомбинантный Wnt3a до конечной концентрации 50 нг / мл.
      4. Хорошо перемешайте и средств массовой информации в настоящее время готова к использованию.
      5. Этот заключительный СМИ должны быть свежие каждый день.
    5. Подготовка окончательного L-15 созревания средний
      1. Внесите необходимыеОбъем L-15 среда для эксперимента (4 мл на лунку 6-луночный планшет, и 6 мл в колбе T25).
      2. Добавить HGF в конечной концентрации 10 нг / мл.
      3. Добавить OSM до конечной концентрации 20 нг / мл.
      4. Хорошо перемешайте и средств массовой информации в настоящее время готова к использованию.
      5. Этот заключительный СМИ должны быть свежие каждый день.
  2. Грунтовка ЭСК к окончательному эндодермы
    1. Культура ЭСК (H1, H9 и РКМ-1) и распространяются на Матригель пластинок, покрытых с мышиных эмбриональных фибробластов MEF-CM дополнен bFGF.
    2. Инициировать печеночной дифференциации, когда ЭСК достичь слияния уровне примерно 30% -60% (в зависимости от чЭСК линия), заменив MEF-CM с грунтовки среды (RPMI 1640-B27 дополнен 100 нг / мл активин и 50 нг / мл Wnt3a.
    3. Клетки культивировали в среде грунтовки в течение 3 дней (изменение среды каждые 24 часов), и окончательный средний грунтовки с активин и Wnt3a состоит из свежих каждый день.
    4. На 8-й день культуры клеток в среде созревания и техническое обслуживание (L-15) с добавлением 10 нг / мл hHGF и 20 нг / мл OSM в течение 9 дней (изменение среды каждые 48 часов). Созревание и обслуживание среды с hHGF и OSM состоит из свежих каждый день.
    5. Клетки постепенно выставлять морфологических изменений с остроконечными / треугольной формы с характерной морфологией печени отображения многоугольных внешний вид (рис. 2A).
    6. Схема для гепато-клеточной дифференцировки:

4. Характеристика чЭСК производные печеночной эндодермы

  1. Иммуноокрашивание
    1. Вымойте чЭСК производные КГ с PBS в два раза, 1 минута каждого мытья.
    2. Fix КГ с 4% PFA в течение 20 минут при комнатной температуре (ячейкаы могут быть сохранены в PBS при 4 ° С и окрашенных в более позднее время). Клетки могут также быть исправлены с помощью ледяной метанола в течение 10 мин при температуре -20 ° C.
    3. Вымойте клетки дважды с PBS, 5 минут каждого мытья.
    4. Инкубируйте клетки в течение 2 минут при комнатной температуре со 100% этилового спирта для ядерных окрашивания (этот шаг не требуется, если метанол фиксации используется).
    5. Вымойте клетки дважды с PBS, 5 минут каждого мытья.
    6. Блок ячеек с PBS / т (0,1% Твин) / 10% BSA в течение 1 часа при комнатной температуре.
    7. Удалите блокирующий буфер и добавить соответствующих первичных антител разводят в PBS / т (0,1% Твин) / 1% BSA и инкубировать в течение 2 часов при комнатной температуре или на ночь при 4 ° С при перемешивании.
    8. Вымойте клетки 3 раза PBS / T (0,1% Твин) / 1% BSA при комнатной температуре, в 5 минутах каждого мытья.
    9. Добавить соответствующих подзаконных Alexa Fluor антител (1:400) разводят в PBS в клетки и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа в темноте с агитацией. Вымойте клетки 3 раза PBS, 5 минут каждого мытья.
    10. Горы каждую лунку с MOWIOL 4-88 и DAPI (1:1000). Обложка хорошо с покровным стеклом, при нажатии покровное осторожно, чтобы гарантировать, что все пузырьки воздуха удаляют и хранят при температуре 4 ° С в темноте.
  2. РНК изоляции и добыча
    1. Вымойте чЭСК производные КГ с PBS и аспирации.
    2. Добавить 1 мл TRIZOL реагентов и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут.
    3. Очистите клетки и поместить в 1,5 мл Eppendorf (хранить при -80 ° C для дальнейшего использования в случае необходимости).
    4. Добавить 0,5 мл хлороформа и смешайте Эппендорф путем обращения, убедитесь, что это делается в вытяжном шкафу.
    5. Центрифуга решение при 13000 оборотов в течение 15 минут при 4 ° C.
    6. Сбор водного слоя и поместить в чистую Эппендорф, убедитесь, что нет никакого загрязнения интерфейс.
    7. Добавьте 1 мл изопропанола и перемешать путем обращения, оставить при комнатной температуре в течение 10 минут precipiтатэ РНК.
    8. Центрифуга при 13000 оборотов в течение 10 минут при 4 ° C.
    9. Аспирируйте супернатант и убедитесь, что не нарушить РНК гранул. Промыть 0,5 мл 70% этанола и оставить при комнатной температуре в течение 5 минут.
    10. Центрифуга в 8000 оборотов в течение 5 минут при температуре 4 ° C.
    11. Аспирируйте этанола и оставляют сушиться при комнатной температуре в течение 5-10 минут.
    12. После того как все этанола испарилась, ресуспендируют осадок в 30 мкл деионизированной воды. Магазин РНК при -80 ° C для дальнейшего использования.
    13. Количественная концентрации РНК с использованием nanodrop.
  3. Обратной транскрипции ПЦР
    1. Настройка реакции, используя ранее изолированной РНК (200 нг), случайные гексамеров, нуклеотиды (10 мм) обратной транскриптазы и соответствующего буфера в тонкостенные 0,5 мл Eppendorf.
    2. Настройка отрицательные РТ, выше реакции без обратной транскриптазы.
    3. Место труб в тепло циклер, ПЦР машины, и установить следующие рrogram:
      1. 37 ° С - 5 минут (1 цикл)
      2. 42 ° С - 1 час (1 цикл)
      3. 95 ° С - 5 минут (1 цикл)
    4. Магазин кДНК при температуре -20 ° C для дальнейшего использования в случае необходимости.
  4. TaqMan количественной обратной транскриптазы полимеразной цепной реакции урожая клетки в различные моменты времени по всему дифференциации протокола. Извлечение РНК и осуществлять обратную транскрипцию КПЦР использованием следующих праймеров и Пробирной по требованию (Applied Biosystems) протокол:
    1. 4 октября Hs03005111_g1
    2. Nanog Hs02387400_g1
    3. Альбумин Hs00910225_m1
    4. Альфа-фетопротеин Hs00173490_m1

Для РНК изоляции и извлечения пожалуйста, обратитесь к разделу 3.3.2

  1. Обратная транскрипция и TaqMan КПЦР
    1. Принимать по 1 мкг РНК и обратной транскрипции с использованием кДНК Надстрочный Invitrogen в III обратной транскрипцииКомплект, в соответствии с инструкциями производителя.
    2. 1 мкл кДНК, используемые в 25 мкл реакции TaqMan, состоящий из соответствующих праймеров от Applied Biosystems, 18S рибосомной грунтовки контроля и Invitrogen в 2x платины КПЦР СУПЕРМИКС UDG с ROX и соответствующий объем воды.
    3. Хорошо перемешайте и положите по 10 мкл каждого образца в двух скважин либо 96 или 384 луночный планшет КПЦР.
    4. После того как все образцы будут загружены, а также надлежащего контроля), печать пластины и анализа на Applied Biosystems машины 7900HT TaqMan.
    5. Результаты выражаются в относительном выражении в течение контрольного образца.
  1. Функциональный анализ чЭСК производных энтодермы цитохрома P450 Анализы - http://www.promega.com/tbs/tb325/tb325.pdf
    1. Инкубируйте день 17 чЭСК производные он с конкретным субстрат в течение 5 часов при температуре 37 ° С (п = 3). Используйте носитель культуры тканей, какОтрицательный контроль и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 5 часов.
    2. Сбор супернатанты и проводить анализ в соответствии с инструкциями производителя.
    3. Мера относительные уровни базальной активности и нормализации на мг белка, как это определено BCA анализ (http://www.piercenet.com/products/browse.cfm?fldID=02020101).

Примечания

  1. Все тома на основе 6-луночный планшет формата. Отрегулируйте объемы, соответственно, для необходимых пластины или колба.
  2. Все грунтовки, дифференцировку и созревание Среду фильтруют под вакуумом перед использованием.
  3. Грунтовка, дифференцировки и созревания среду хранить при температуре 4 ° С в течение не более 2 недель. Оценить, насколько среда, необходимые для эксперимента и аликвоту оставшиеся средства массовой информации и храните при температуре от -20 ° C для дальнейшего использования.
  4. Матригель составлена ​​в соответствии с инструкциями изготовителя; 1 мл аликвоты можно хранить при температуре от -20 ° C до использования.
  5. Грут-го фактора когда-то сделал и аликвоты можно хранить при температуре -20 ° С и при талой можно хранить при температуре 4 ° С в течение не более 2 недель.
  6. Первичные антитела обычно используется для характеристики чЭСК производные КГ является альбумин (1:250, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури).

5. Представитель Результаты:

Характеристика ЭСК и до момента печеночной дифференциации

Для того чтобы охарактеризовать состояние стволовых клеток H9 ЭСК, используемые в исследовании мы изучали число параметров. Клетки выставлены чЭСК морфологии, маленькие, плотно упакованных клеток, растущих в определенных колониях (рис. 1А), и выразил плюрипотентных стволовых клеток, генов маркеров, октябрь-3 / 4 и Nanog (рис. 1б). Мы не обнаружили существенных различий в экспрессии этих генов по сравнению с линии H7 чЭСК положительного контроля. Кроме того, 90,1% населения ЭСК был положительным для маркера стволовых клеток SSEA-4 (Рис. 1С).

онSC дифференциации печеночной эндодермы

Человеческих эмбриональных стволовых клеток может быть эффективно дифференцированы с печеночной энтодермы в пробирке (Хей и др. 2008). На 9-й день дифференциации, клетки собирали и дифференциации чЭСК в КГ был оценен. Как сообщалось ранее ЭСК выставила серию глубоких морфологических изменений, а днем ​​9, выставлены ранние гепатоцитов морфологии развивающихся полигональных внешний вид (рис. 2A). Более того, снижение экспрессии октября-3 / 4 за 9 курс дневной наблюдалось (рис. 2В). В отличие от этого, печень стенограммы AFP и альбумин выросли регулируемые (рис. 2C) с 7-й день года.

В пробирке созревание Печеночная эндодермы

Печеночная эндодермы была созрела в пробирке использования в установленном порядке (Хей и др. 2008). В заключительный день дифференциации культур immunostained для человека маркеры печени альбумина, АФП и E-кадгерина. Выход КГ используя наши Процедура, как правило, 90% (Hay и др. 2008; Ханун и др. 2010; Пейн и др. 2011). КГ окрашенные положительными для альбумин, альфа-фетопротеин и E-кадгерина (рис. 3).

Рисунок 1
Рисунок 1. Характеристика ЭСК, используемые в этом исследовании. () Этап контрастной микроскопии изображений представитель чЭСК морфологии наблюдается в культуре на 4x и 10x увеличением. Изображения были получены с помощью Nikon TE3000 / U инвертированного микроскопа (B) ЭСК являются культурными октамера (Oct-3 / 4) положительные и Nanog положительным. H7 ЭСК было использовать в качестве контроля за плюрипотентности уровень экспрессии гена. Относительное выражение относится к складкам индукции по сравнению с эндогенным контролем гена β-2-микроглобулина. (С) FACS графики показывают чЭСК поверхностным маркером уровня экспрессии, в том числе стадии эмбрионального конкретных антигенов SSEA 4.

69/2969fig2.jpg "/>
Рисунок 2. () Этап контрастной микроскопии представитель образы чЭСК происхождения морфологии эндодермы печеночной на 9 день дифференциация наблюдается в области культуры, на x4 и x10 увеличение. (Б) характеристика изменения в экспрессии генов. РНК экстрагировали и кДНК была проанализирована количественной полимеразной цепной реакции, показывая прогрессивное снижение экспрессии недифференцированные экспрессии генов клетки (Oct-3 / 4) и (С) регуляция экспрессии генов гепатоцитов (альбумин и α-фетопротеин). Относительное выражение относится к складкам индукции по сравнению с эндогенным контролем гена β-2-микроглобулина в день 0 дифференциации. P <0,05 обозначается * и Р <0,001 обозначается *** измеряется студентов т-тест по сравнению с ЭСК в день 0. Планки погрешностей составляют 1 стандартное отклонение.

Рисунок 3
Рисунок 3. Ч.aracterisation из чЭСК производные энтодермы печеночной
Иммуноцитохимическая показывает выражение гепатоцитов маркеры, альбумина, АФП и E-кадгерина в чЭСК (H9), полученные эндодермы печени. Отрицательного контроля были проведены с соответствующими иммуноглобулина G (IgG), а также представители изображения показано на рисунке.

Рисунок 4
Рисунок 4. ЧЭСК (H9), полученные КГ выставку метаболической активности. В 17 день, H9 дифференцированы с КГ выставлены CYP3A метаболической активности (п = 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы разработали простой, однородной и высокой воспроизводимостью в пробирке модель для создания масштабируемого уровня человеческого КГ. Наша модель была проверена на количество внешних сотрудничающих лабораторий. Мы регулярно характеризуют стволовых клеток производных КГ используя наш дом в ящик для инструмента развивающего маркеров и печени конкретных функциональных тестов (большинство из которых имеются в продаже). Критических этапов в нашем процессе, являются: поддержание стволовых клеток плюрипотентности, возможность прямой дифференциации стволовых клеток к окончательному энтодермы; спецификация однородных культур печеночной энтодермы и способностью извлекать зрелые эндодермы печеночной проявило широкую функцию диапазона в пробирке.

Одним из ограничений для развертывания больших масштабах стволовых клеток производных HLC технология была краткосрочной дифференцированные функции зрелых эндодермы печеночных в культуре (~ 4 дней на Матригель). Таким мы экранированный полимерабиблиотека для биологически активных и новых сотовых поддерживает. Это привело к выявлению новых поддержки, которая поддерживает функции печени в течение 15 дней. Будущие направления для этой технологии, первоначально промышленное применение в процессе обнаружения наркотиков (Хей и др. 2011). Среднесрочной перспективе годы от этой технологии, вероятно, будут гуманизированное экстра-телесным печени поддержки устройств для преодоления или лечения пациентов с заболеваниями печени. Долгосрочные выгоды от этой технологии может в клеточной терапии, основанной на трансплантацию печени болезни, однако текущие данные показывают, что эта стратегия требует значительных усилий, прежде чем он может безопасно использоваться в клинике (Payne и др. 2011).

В заключение, значение нашего в пробирке технологии является способность генерировать однородный и безграничный культур с высокой точностью человека КГ прикладной биологии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Доктор Сено было поддержано RCUK стипендий, д-р Запада была поддержана кафедрой хирургии, доктор Медина была поддержана грантом Фонда Основные BHF, г-н Бальтасар Lucendo-Villarin была поддержана MRC кандидат Studenship. Д-р Чжоу был поддержан стипендию китайского правительства.

Materials

Matrigel coating plates and flasks

  1. Matrigel (10 mL, BD Biosciences, UK); store at -20°C.
  2. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  3. Tissue culture plates (6 well, 12 well, Corning, UK)
  4. Tissue culture flask (25 cm2 vented, Corning, UK)

hESC Maintenance

  1. Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA); store at -20°C.
  2. BSA solution (50 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
  3. Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.

Passaging hESCs with collagenase

  1. Confluent well or flask of hESCs.
  2. Matrigel coated wells or flasks as appropriate.
  3. Phospate buffered saline (-MgCl2, -CaCl2) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature.
  4. Collagenase IV (1 g, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  5. Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA).
  6. Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA).

Differentiation of hESCs to hepatic endoderm

  1. RPMI 1640 (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  2. B27 Supplement (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
  3. Activin A (2 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.
  4. Recombinant mouse Wnt3a (2 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C.
  5. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  6. KO-SR (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
  7. Non-essential amino acids (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  8. β-Mercapt–thanol (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  9. DMSO (Sigma Aldrich, UK); store at room temperature
  10. Leibovitz L-15 culture medium (500 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
  11. Tryptose phosphate broth (100 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
  12. F–tal bovine serum, heat inactivated (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
  13. Hydrocortisone 21-hemisuccinate (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
  14. Insulin (bovine pancreas) (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
  15. L-Glutamine (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
  16. Ascorbic acid (25 g, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
  17. Human HGF (10 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.
  18. Recombinant Human Oncostatin M (OSM) (50 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C.
  19. Syringe driven filter unit 0.22 μm (Millipore, UK)

Characterisation of hESC derived Hepatic Endoderm

Immunostaining

  1. Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature.
  2. PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20 (Sigma-Aldrich, UK).
  3. Paraformaldehyde (PFA) (Sigma-Aldrich, UK) is made up in PBS, store -20°C.
  4. Glycerol (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature.
  5. Tris Base (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature.
  6. Ethanol
  7. Serum (AbD Serotech, UK), store at -20°C.
  8. Secondary Antibody, Alexa Fluorophores (Molecular Probes, Invitrogen, UK).
  9. MOWIOL 4-88 (Polysciences Inc, USA) is made up in Tris HCL and glycerol as per manufacturers instructions. DAPI (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK) is added to the MOWIOL solution at a 1:1000 dilution.
Primary antibodies
Antigen* Type Supplier Dilution
ALB Mouse Monoclonal Sigma Aldrich 1/500
E-Cadherin Mouse Monoclonal Millipore 1/100
α-fetoprotein Mouse Monoclonal Sigma 1/500
SSEA-4 FITC Mouse Monoclonal Biolegend 1/100
IgG Mouse Monoclonal DAKO 1/500
Secondary antibodies
Anti-mouse FITC conjugate Goat Monoclonal Invitrogen 1/400

Table 2. The antibodies used for hESC derived hepatic endoderm immunostaining, the concentrations used, the species developed in and the companies they are purchased from.

Functional Analysis of Hepatic Endoderm and Normalisation (per mg protein)

Cytochrome P450 Assays

  1. p4-GLO CYP3A4, CYP1A2, Kits and luminometer (Promega, USA).
  2. White flat bottom 96 well assay plate (BD Biosciences, UK).
  3. BCA Assay Kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK).
  4. Transparent 96 well assay plate (IWAKI, UK)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Asgari, S., Pournasr, B., Salekdeh, G. H., Ghodsizadeh, A., Ott, M., Baharvand, H. Induced pluripotent stem cells: a new era for hepatology. J. Hepatol. 53, 738-751 (2010).
  2. Hay, D. C., Pernagallo, S., Diaz-Mochon, J. J., Medine, C. N., Greenhough, S., Hannoun, Z., Schrader, J., Black, J. R., Fletcher, J., Dalgetty, D. Unbiased Screening of Polymer Libraries to Define Novel Substrates for Functional Hepatocytes with Inducible Drug Metabolism. Stem Cell Research. 6, 92-101 (2011).
  3. Payne, C. M., Samuel, K., Pryde, A., King, J., Brownstein, D., Schrader, J., Medine, C. N., Forbes, S. J., Iredale, J. P., Newsome, P. N. Persistence of Functional Hepatocyte Like Cells in Immune Compromised Mice. Liver International. 31, 254-262 (2011).
  4. Greenhough, S., Medine, C., Hay, D. C. Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocyte Like Cells and their Potential in Toxicity Screening. Toxicology. 278, 250-255 (2010).
  5. Medine, C. N., Greenhough, S., Hay, D. C. The Role of Stem Cell Derived Hepatic Endoderm in Human Drug Discovery. Biochemical Society Transactions. 38, 1033-1036 (2010).
  6. Hannoun, Z., Fletcher, J., Greenhough, S., Medine, C. N., Samuel, K., Sharma, R., Pryde, A., Black, J. R., Ross, J. A., Wilmut, I., Iredale, J. P., Hay, D. C. The Comparison between Conditioned Media and Serum Free Media in Human Embryonic Stem Cell Culture and Differentiation. Cellular Reprogramming. 12, 133-140 (2010).
  7. Dalgetty, D. M., Medine, C., Iredale, J. P., Hay, D. C. Progress and Future Challenges in Stem Cell-Derived Liver Technologies. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, 241-248 (2009).
  8. Hay, D. C., Fletcher, J., Payne, C., Terrace, J. D., Gallagher, R. C. J., Snoeys, J., Black, J., Wojtacha, D., Samuel, K., Hannoun, Z., Pryde, A. Highly Efficient Differentiation of hESCs to Functional Hepatic Endoderm Requires ActivinA and Wnt3a Signalling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 12301-12306 (2008).
  9. Fletcher, J., Cui, W., Samuels, K., Black, J. R., Currie, I. S., Terrace, J. D., Payne, C., Filippi, C., Newsome, P., Forbes, S. J., Ross, J. A., Iredale, J. P., Hay, D. C. The Inhibitory Role of Stromal Cell Mesenchyme on Human Embryonic Stem Cell Hepatocyte Differentiation is Overcome by Wnt3a Treatment. Cloning and Stem Cells. 10, 331-340 (2008).

Tags

Биология развития выпуск 56 Стволовые клетки чЭСК развития эндодермы печени гепатоцитов эндокринную функцию экзокринной функции
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Medine, C. N., Lucendo-Villarin, B., … More

Medine, C. N., Lucendo-Villarin, B., Zhou, W., West, C. C., Hay, D. C. Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations. J. Vis. Exp. (56), e2969, doi:10.3791/2969 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter