Robuuste Generatie van hepatocyt-achtige cellen uit menselijke embryonale stamcellen Populaties

Summary

Dit artikel zal zich richten op het genereren van humane lever endoderm van menselijke embryonale stamcellen populaties.

Abstract

Ondanks de vooruitgang in het modelleren van menselijke geneesmiddelen toxiciteit, veel stoffen niet tijdens klinische studies als gevolg van onverwachte bijwerkingen. De kosten van de klinische studies substantieel zijn, daarom is het essentieel dat meer voorspellende toxicologie schermen zijn ontwikkeld en vroeg ingezet in de ontwikkeling van geneesmiddelen (Greenhough et al., 2010). Humane hepatocyten vertegenwoordigen de huidige gouden standaard model voor het evalueren van drugs toxiciteit, maar zijn een beperkte hulpbron die variabele functie vertonen. Daarom zijn het gebruik van onsterfelijk gemaakte cellijnen en dierlijk weefsel modellen routinematig ingezet als gevolg van hun overvloed. Hoewel beide bronnen zijn informatief, worden ze beperkt door een slechte werking, soorten variabiliteit en / of instabiliteit in de cultuur (Dalgetty et al. 2009). Pluripotente stamcellen (PSC's) zijn een aantrekkelijk alternatief bron van menselijke hepatocyten achtige cellen (HLCS) (Medine et al. 2010). PSC's zijn in staat om zelfvernieuwing en differentiatie van alle somatische cellen soorten gevonden in de volwassen en daarmee vertegenwoordigeneen potentieel onuitputtelijke bron van gedifferentieerde cellen. We hebben een procedure ontwikkeld die eenvoudig, zeer efficiënt, vatbaar voor automatisering en levert functionele menselijke HLCS (Hay et al., 2008; Fletcher et al. 2008; Hannoun et al. 2010; Payne et al. 2011 en Hay et al. 2011). Wij geloven dat onze technologie zal leiden tot de schaalbare productie van HLCS voor drug discovery, ziekte modelleren, de bouw van extra-lichamelijke-apparaten en eventueel cell-based therapieën transplantatie.

Protocol

1. Eerste voorbereiding van alle chemische voorraden en coating van de cultuur plasticware

Alle stappen die moeten worden uitgevoerd in een weefselkweek kap onder aseptische omstandigheden.

1. De voorbereiding van de menselijke basis fibroblast groeifactor (hbFGF)
   1. Bereid 10% BSA-oplossing in PBS en filtreer door een 0,22 urn filter.
   2. Van de 10% BSA-oplossing bereiden een 0,2% BSA-oplossing.
   3. Voeg 10 mL 0,2% BSA solution/100 ug hbFGF.
   4. Pre-nat een 0,22 urn filter door het filteren van 5 ml 10% BSA-oplossing door het filter. Gooi de 10 ml BSA wassen.
   5. Filter de hbFGF via de pre-gewassen filter.
   6. Aliquot de hbFGF in steriele eppendorfs en bewaar bij -20 ° C.
2. De voorbereiding van de Mens Activin een stockoplossing
   1. Voeg 1 mL van 0,2% BSA in een spuit en vooraf nat van de filter.
   2. Verdun de Activin A in 0,2% BSA een voorraad concentratie van 100 ug / ml.
   3. De activiteiten filtern Een oplossing en aliquot in steriele eppendorfs, bewaren bij -20 ° C.
3. Voorbereiding van de muis Wnt3a Stock Solution
   1. Voeg 200 ul van PBS tot een 2 pg flacon Wnt3a een voorraad concentratie van 10 ug / ml.
   2. Aliquot in steriele eppendorfs en bewaar bij -20 ° C.
4. De voorbereiding van de Mens HGF Stock Solution (1000x)
   1. Verdun de HGF in PBS om een ​​voorraad concentratie van 10 ug / ml.
   2. Filter de HGF oplossing en aliquot in steriele eppendorfs, bewaren bij -20 ° C.
5. De voorbereiding van Oncostatin M Stock Solution (1000x)
   1. Verdun de OSM in PBS om een ​​voorraad concentratie van 20 ug / ml.
   2. Filter de OSM-oplossing en de hoeveelheid in steriele eppendorfs, bewaren bij -20 ° C.
6. Coating van de cultuur plasticware met Matrigel
   1. Ontdooi de 10 ml bouillon fles Matrigel overnacht bij 4 ° C op ijs en voeg dan 10 ml van het KO-DMEM. Meng goed met behulp van gekoeld pipetten en opslaan 1mL porties bij -20 ° C.
   2. Dooi een hoeveelheid van Matrigel bij 4 ° C gedurende ten minste 2 uur of 's nachts om de vorming van een gel te voorkomen.
   3. Voeg 5 ml koud KO-DMEM aan de Matrigel, goed mengen met een pipet.
   4. Vul aan tot 15 ml met koude KO-DMEM en meng met een pipet.
   5. Voeg Matrigel aan de plaat of fles te coaten (tabel (i))

Plaat / Flask	Volume / goed of Flask
12-well plaat	0,5 ml per goed
6-well plaat	1 ml per putje
25cm 2 fles	2 ml per fles

Tabel 1. Aanbevolen hoeveelheden van de Matrigel voor het coaten van typische plasticware voor hESC cultuur.

6. 6. Incubeer de gecoate plaat of vat nacht bij 4 ° C of kamertempature 1 uur voor gebruik.
   7. Platen of flesjes die zijn bekleed met Matrigel kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal 1 week. Ze moeten duidelijk worden geëtiketteerd met de datum waarop ze werden bekleed. Gooi alle platen of kolven niet binnen een week.
      1. Voor gebruik kan de coating cultuur container om te komen tot kamertemperatuur in een weefselkweek kap.
      2. Onmiddellijk voorafgaand aan het gebruik van de Matrigel zuigen en voeg de celsuspensie naar de bron of de kolf.

2. Routine onderhoud van hESC culturen en karakterisering

1. Reanimatie van hESC lijnen
   1. Verwijder de hESC 's uit vloeibare stikstof opslag en snel ontdooien in een 37 ° C waterbad.
   2. Breng voorzichtig de celsuspensie in een steriele buis met daarin een aantal ml warm medium.
   3. Pellet de cellen door centrifugatie @ lage snelheid voor de 5min (1000 RPM).
   4. Aspireren uit de supernatant en heel zachtjes resuspend de cellen in warme ES medium en plaat uit op een MEF feeder-laag.
   5. Opnieuw invoeren cellen dagelijks met verse ES medium en op subconfluence, de cellen, vereisen de cellen passage.
2. Routine hESC onderhoud
   ES-cellen worden gekweekt in platen of kolven gecoat met Matrigel. De cellen moeten worden onderzocht en gevoed dagelijks:
   1. Onderzoek onder de microscoop voor de verontreiniging, celmorfologie en samenvloeiing.
   2. Zuigen de gebruikte medium.
   3. Voeg een geschikt volume van verse muis embryonale fibroblast-geconditioneerd medium (MEF-CM) + menselijke bFGF (uiteindelijke concentratie 4 ng / mL) of andere serum vrije media ^6.
3. Passage cellen met collagenase
   hESC lijnen (H1, H9 en RCM-1) zal bereiken samenloop elke 5-7 dagen na de passage op een 1:03 splitsingsverhouding. Vroeg passage hESC 's in de aanwezigheid van stroma groeien langzamer en de tijd op de Matrigel kan een belangrijke factor te worden. Menselijke SER mag niet langer zijn dan 14 worden overgelatendag op dezelfde Matrigel wijten zijn aan matrixeffecten degradatie en in dit geval kan het noodzakelijk zijn om de passage van de cellen in een 1:1 of 1:2 splitsingsverhouding als de cellen worden subconfluent.
   
   Enzyme Incubation
   1. Alle stappen die moeten worden uitgevoerd in een weefselkweek kap onder aseptische omstandigheden.
   2. Zorg ervoor dat er een nieuw Matrigel gecoate schaal of fles bereid als per paragraaf 1.6.
   3. Beslis over de gewenste split ratio voor de cellen. Een aantal factoren zijn betrokken bij het bepalen van de split ratio:
      1. Hoog niveau van stroma met een lage aantallen kolonies: is terug te gepasseerd om een ​​kleiner formaat of goed kan worden gepasseerd 01:01 die zal zich te ontdoen van een aantal stroma en dus verhoging van de kolonie stroma ratio, het bevorderen van hESC groei.
      2. Hoog niveau van stroma met grote kolonies, afhankelijk van het aantal kolonies, kunnen worden gepasseerd 1:1 of 1:2 als er genoeg grote hESC kolonies.
      3. Typische groeien hESC 's met een beetje stroma of geen stroma en / of enige differentiatie kan worden gepasseerd 1:2 of 3.
      4. Aspireren van de media uit de put of de kolf.
      5. Was eenmaal met 2 ml PBS (-MgCl _{2,-CaCl 2).}
      6. Voeg een geschikt volume van collagenase (200 U / mL verdund in KO-DMEM) en incubeer bij 37 ° C gedurende 2-5 minuten. Vanaf 2 minuten verder regelmatig te onderzoeken onder de microscoop (1 minuut intervallen). Op het punt van de gedifferentieerde cellen beginnen te tillen en de kolonies beginnen te tillen aan de rand van de cellen zijn klaar om te worden gepasseerd.
   Schrapen en bundeling van de hESC 's
   3. 6. Zuig het collagenase.
      7. Was eenmaal met 2 ml PBS (-MgCl _{2,-CaCl 2).}
      8. Voeg een geschikt volume van MEF-CM, afhankelijk van de split-verhouding, en het gebruik van een cel schraper fysiek verwijderen van de cellen van het oppervlak van het goed of kolf, dan vermaal gentgevoerd door en neer te pipetteren 2-3 keer met behulp van een pipet van 10 ml. Het is belangrijk dat de hESC 's worden gehouden in groepjes van cellen en worden niet opgedeeld in afzonderlijke cellen.
   Replating de hESC 's
   3. 9. Replate de resulterende celsuspensie op de nieuwe Matrigel gecoate kolven of bronnen.
      10. Maak het volume van de MEF-CM tot 4 ml voor een goed van een 6-wells plaat.
      11. Bij het plaatsen van de cellen in de incubator roeren de weefselkweek container zo zelfs mogelijk een verdeling van de kolonies zorgen als de kolonies hebben de neiging zich te vestigen in het centrum van de weefselkweek plaat / fles van invloed zijn cel replating en differentiatie.
4. Routine karakterisering van hESC de bevolking door middel van flowcytometrie
   1. hESC populaties zijn onderzocht aan de hand flow cytometrie een keer per maand voor stamcel markers, zoals 03 oktober / 4, 10-60 en Tra SSEA-4.
   2. hESCpopulaties worden verwijderd uit hun substraat als single celsuspensies na een 5 minuten behandeling met trypsine / EDTA (Invitrogen).
   3. Resuspendeer enkele cellen op 1x10 ⁶ cellen / ml in PBS aangevuld met 0,1% BSA en 0,1% natriumazide.
   4. Incubeer celpreparaten bij 4 ° C met de juiste antilichamen voor 40 minuten.
   5. Twee keer wassen cellen met PBS aangevuld met 0,1% BSA en 0,1% natriumazide om ongebonden antilichamen te verwijderen en resuspendeer tot een eindvolume van 100 ul en analyseren door flowcytometrie.
   6. Gegevens voor 30000 tot 40000 "live" gebeurtenissen zijn verworven voor elk monster met behulp van een FACS Caliber cytometer uitgerust met een 488-nm laser en geanalyseerd met behulp van CellQuest software (Becton Dickinson, San Jose, CA). Ongekleurde cellen worden opgenomen als controles. Dode en apoptotische cellen, samen met puin werden uitgesloten van analyse met behulp van een elektronische live-poort op de voorwaartse verstrooiing en zijwaartse verstrooiing parameters.

3. Gedifferentieerdeatie van hESC 's de lever endoderm

1. Voorbereiding van de Media voor de differentiatie van hESC 's de lever endoderm. Alle media de voorbereiding moeten worden uitgevoerd in een weefselkweek kap onder aseptische omstandigheden.
   1. Voorbereiding van RPMI: B27 priming medium voor endoderm differentiatie
      1. Voor RPMI-medium B27, mix RPMI 1640 (500 ml) en B27 (50x, 10 ml)
      2. Swirl om componenten te mengen.
      3. Voeg alle componenten om een ​​filter en filter onder vacuüm, bewaren bij 4 ° C.
   2. Voorbereiding van de SR-DMSO medium voor hepatocyt differentiatie
      1. Voor SR-DMSO medium, meng 80% KO-DMEM, 20% KO-SR, 0,5% L-glutamine, 1% niet-essentiële aminozuren, 0,1 mm β-mercapto-ethanol en 1% DMSO.
      2. Filtreer de oplossing onder vacum, bewaren bij 4 ° C en aliquot en bewaar bij -20 ° C indien nodig.
      3. Gebruik 4 ml per putje van een 6-well plaat, en 6 ml per T25 fles.
   3. Voorbereiding van de L15 rijping medium voor hepatocyte rijping
      1. Voor L-15-medium, meng 500 ml Leibovitz L-15-medium, tryptose fosfaat bouillon (eindconcentratie 8,3%), warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (eindconcentratie 8,3%), 10 uM hydrocortison 21-hemisuccinaat, 1 uM Insuline (runderen pancreas ), 1% L-Glutamine, 0,2% ascorbinezuur.
      2. Filtreer de oplossing onder vacum, bewaren bij 4 ° C en aliquot en bewaar bij -20 ° C indien nodig.
   4. De voorbereiding van de uiteindelijke RPMI: B27 priming medium
      1. Bereid het gewenste volume van de priming medium voor het experiment (1 ml per putje van een 6-well plaat, en 2 ml per T25 fles).
      2. Voeg Activin A tot een uiteindelijke concentratie van 100 ng / mL.
      3. Voeg recombinant Wnt3a tot een uiteindelijke concentratie van 50 ng / mL.
      4. Meng goed en de media is nu klaar voor gebruik.
      5. Deze laatste media moeten worden samengesteld uit dagelijks vers.
   5. De voorbereiding van de uiteindelijke L-15 rijping medium
      1. Bereid het gewenstevolume van de L-15 medium voor het experiment (4 ml per putje van een 6-well plaat, en 6 ml per T25 fles).
      2. Voeg HGF tot een uiteindelijke concentratie van 10 ng / mL.
      3. Voeg OSM tot een uiteindelijke concentratie van 20 ng / mL.
      4. Meng goed en de media is nu klaar voor gebruik.
      5. Deze laatste media moeten worden samengesteld uit dagelijks vers.
2. Priming hESC 's definitieve endoderm
   1. Cultuur hESC 's (H1, H9 en RCM-1) en propageren op Matrigel gecoate platen met de muis embryonale fibroblasten MEF-CM aangevuld met bFGF.
   2. Initiëren lever differentiatie als hESC 's tot een confluentie niveau van ongeveer 30% -60% (afhankelijk van de hESC lijn) door het vervangen van de MEF-CM met priming medium (RPMI 1640-B27 aangevuld met 100 ng / mL Activin A en 50 ng / mL Wnt3a.
   3. De cellen worden gekweekt in priming medium voor 3 dagen (veranderen van het medium elke 24 uur), en laatste priming medium met Activin A en Wnt3a bestaat uit dagelijks vers.
   4. Op dag acht de cultuur van de cellen in rijping en onderhoud van medium (L-15), aangevuld met 10 ng / mL hHGF en 20 ng / mL OSM voor 9 dagen (veranderende medium elke 48 uur). Rijping en onderhoud medium met hHGF en OSM bestaat uit dagelijks vers.
   5. De cellen geleidelijk aan vertonen morfologische veranderingen van een puntige / driehoekige vorm met een kenmerkende morfologie lever het weergeven van een veelhoekige uiterlijk (figuur 2A).
   6. Schematische voor hepato-cellulaire differentiatie:

4. Karakterisering van hESC afgeleid lever endoderm

1. Immunokleuring
   1. Was hESC afgeleid HLCS met PBS twee keer, 1 minuut per wasbeurt.
   2. Bevestig de HLCS met 4% PFA gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (de cels kunnen worden opgeslagen in PBS bij 4 ° C en gekleurd op een later tijdstip). De cellen kunnen ook worden bevestigd met ijskoude methanol gedurende 10 minuten bij -20 ° C.
   3. Twee keer wassen van de cellen met PBS, 5 minuten per wasbeurt.
   4. Incubeer de cellen gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur met 100% ethanol voor de nucleaire kleuring (deze stap is niet nodig als methanol fixatie wordt gebruikt).
   5. Twee keer wassen van de cellen met PBS, 5 minuten per wasbeurt.
   6. Blokkeer de cellen met PBS / T (+0,1% Tween) / 10% BSA gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
   7. Verwijder de blokkeerbuffer en voeg de respectievelijke primaire antilichaam verdund in PBS / T (+0,1% Tween) / 1% BSA en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur, of overnacht bij 4 ° C met agitatie.
   8. Was de cellen drie keer met PBS / T (+0,1% Tween) / 1% BSA bij kamertemperatuur, op 5 minuten per wasbeurt.
   9. Voeg de juiste secundaire Alexa Fluor antilichaam (1:400), verdund in PBS op de cellen en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur in het donker met agitatie. Was de cellen drie keer met PBS, 5 minuten per wasbeurt.
   10. Mount elk putje met Mowiol 4-88 en DAPI (1:1000). Bedek de goed met een dekglas, het indrukken van de dekglaasje voorzichtig om ervoor te zorgen dat alle luchtbellen worden verwijderd en bewaar bij 4 ° C in het donker.
2. RNA-isolatie en extractie
   1. Was de hESC afgeleid HLCS met PBS en aspireren.
   2. Voeg 1 ml TRIzol reagens en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
   3. Schraap de cellen en in een 1,5 ml Eppendorf (bewaren bij -80 ° C voor later gebruik indien nodig).
   4. Voeg 0,5 ml chloroform aan de eppendorf en meng door, zorg ervoor dat dit wordt gedaan in een zuurkast.
   5. Centrifugeer de oplossing bij 13.000 rpm gedurende 15 minuten bij 4 ° C.
   6. Verzamel de waterige laag en plaats in een schone Eppendorf, zorg ervoor dat er geen vervuiling van de interface.
   7. Voeg 1 ml isopropanol en meng door, laat op kamertemperatuur gedurende 10 minuten op neerslagTate het RNA.
   8. Centrifugeer bij 13.000 rpm gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
   9. Zuig het supernatant en zorg ervoor dat niet aan de RNA-pellet te verstoren. Wassen met 0,5 ml 70% ethanol en laat op kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
   10. Centrifugeer bij 8000 rpm gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
   11. Aspireren van de ethanol en laten drogen bij kamertemperatuur gedurende 5-10 minuten.
   12. Wanneer alle ethanol verdampt is, resuspendeer de pellet in 30 pi van gedemineraliseerd water. Bewaar het RNA bij -80 ° C voor later gebruik.
   13. Kwantificeren van de RNA-concentratie met behulp van een nanodrop.
3. Reverse transcriptie PCR
   1. Stel een reactie met gebruikmaking van voorheen geïsoleerde RNA (200 ng), random hexameren, nucleotiden (10mm) reverse transcriptase en de respectieve buffer in een dunwandige 0,5 ml Eppendorf.
   2. Stel een negatieve RT, de bovenstaande reactie zonder de reverse transcriptase.
   3. Plaats de buizen in een thermo fietser, PCR machine, en het opzetten van de volgende program:
      1. 37 ° C - 5 minuten (een cyclus)
      2. 42 ° C - 1 uur (1 cyclus)
      3. 95 ° C - 5 minuten (een cyclus)
   4. Bewaar de cDNA bij -20 ° C voor later gebruik indien nodig.
4. TaqMan kwantitatieve reverse transcriptase polymerase chain reaction Oogst de cellen op verschillende tijdstippen gedurende de differentiatie protocol. Pak de RNA en uit te voeren reverse transcriptie qPCR met de volgende primers en Assay-on-demand, (Applied Biosystems) protocol:
   1. 04 oktober Hs03005111_g1
   2. NANOG Hs02387400_g1
   3. Albumine Hs00910225_m1
   4. Alfa-foetoproteïne Hs00173490_m1

Voor RNA isolatie en extractie verwijzen wij u naar paragraaf 3.3.2

1. Reverse transcriptie en TaqMan qPCR
   1. Neem 1 ug van RNA en reverse transcriptie tot cDNA met behulp van Invitrogen's Superscript III reverse transcriptiekit, volgens instructies van de fabrikant.
   2. 1 ul van de cDNA gebruikt in een 25 ul TaqMan reactie bestaat uit de juiste primers van Applied Biosystems, 18S ribosomale controle primers en 2x platina Invitrogen's qPCR supermix UDG met rox en een passende hoeveelheid water.
   3. Meng goed en plaats 10 pi van elk monster in twee putten van ofwel een 96 of 384 goed qPCR plaat.
   4. Zodra alle monsters zijn geladen, plus de nodige controles), sluit de plaat en analyseren van de Applied Biosystems TaqMan 7900HT machine.
   5. De resultaten worden uitgedrukt als relatieve expressie over een controlemonster.

5. Functionele analyse van hESC Derived Verminderde Endoderm Cytochroom P450 Assays - http://www.promega.com/tbs/tb325/tb325.pdf
   1. Incubeer dag 17 hESC afgeleid HE met de specifieke substraat voor 5 uur bij 37 ° C (n = 3). Gebruik weefselcultuurmedia als eennegatieve controle en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 uur.
   2. Verzamel de bovenstaande vloeistoffen en het uitvoeren van de test volgens de instructies van de fabrikant.
   3. Meet de relatieve niveaus van de basale activiteit en normaliseren om per mg eiwit, zoals bepaald door de BCA Assay (http://www.piercenet.com/products/browse.cfm?fldID=02020101).

Opmerkingen

1. Alle volumes zijn gebaseerd op een 6-well plaat formaat. Dienovereenkomstig aan te passen de volumes voor de vereiste plaat of de kolf.
2. Alle priming, differentiatie en rijping medium is gefilterd onder vacuüm voor gebruik.
3. Priming, differentiatie en rijping medium is opgeslagen bij 4 ° C gedurende niet langer dan 2 weken. Beoordelen hoe veel medium nodig is voor het experiment en de resterende hoeveelheid media en bewaar bij -20 ° C voor toekomstig gebruik.
4. Matrigel is samengesteld volgens de instructies van de fabrikant; 1 ml monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C tot gebruik.
5. Growth factoren een keer uit en in hoeveelheden kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C en wanneer ontdooid kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende niet langer dan 2 weken.
6. Het primaire antilichaam gewoonlijk gebruikt om hESC afgeleid HLCS karakteriseren is albumine (1:250, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

5. Representatieve resultaten:

Karakterisering van hESC 's onderhouden voorafgaand aan de lever differentiatie

Om de stamcellen status van de H9 hESC 's gebruikt in de studie karakteriseren we onderzochten een aantal parameters. De cellen vertoonden hESC morfologie, kleine, dicht opeengepakte cellen groeien in bepaalde kolonies (Figuur 1A) en sprak de pluripotente stamcel-gen markers, okt-3 / 4 en NANOG (Figuur 1B). We vonden geen significante verschillen in de expressie van deze genen in vergelijking met een H7 hESC lijn positieve controle. Bovendien, 90,1% van de bevolking hESC 's was positief voor de stamcel marker SSEA-4 (figuur 1C).

hESC differentiatie de lever endoderm

Menselijke embryonale stamcellen efficiënt kunnen worden gedifferentieerd naar de lever endoderm in vitro (Hay et al. 2008). Op dag 9 van de differentiatie, werden de cellen geoogst en differentiatie van hESC tot HLCS werd beoordeeld. Zoals eerder gemeld de hESC 's vertoonden een reeks ingrijpende morfologische veranderingen, en door de dag 9, tentoongesteld begin van de hepatocyten morfologie het ontwikkelen van een veelhoekige uiterlijk (figuur 2A). Bovendien was downregulatie van oktober-3 / 4 over de negen dagen tijdsverloop waargenomen (Figuur 2B). In tegenstelling, lever transcripties AFP en albumine zijn up-gereguleerd (figuur 2C) vanaf dag 7 en later.

In vitro maturatie van Lever Endoderm

Lever endoderm werd gerijpt in vitro met behulp van de vastgestelde procedure (Hay et al. 2008). Op de laatste dag van de differentiatie culturen werden immunostained voor de menselijke lever-markers albumine, AFP en E-cadherine. De opbrengst van HLCS het gebruik van onze procedure is meestal 90% (Hay et al., 2008; Hanoun et al. 2010; Payne et al. 2011). HLCS gekleurd positief voor Albumine, Alpha-foetoproteïne en E-cadherine (figuur 3).

Figuur 1. Karakterisatie van hESC 's gebruikt in deze studie. (A) Fase contrast microscopie beelden vertegenwoordiger van hESC morfologie waargenomen in cultuur op 4x en 10x vergroting. De beelden werden vastgelegd met behulp van een Nikon TE3000 / U omgekeerde microscoop (B) gecultiveerde hESC 's zijn octameer (okt-3 / 4) positieve en NANOG positief. H7 hESC 's zijn te gebruiken als een controle voor pluripotentie genexpressie niveaus. Relatieve expressie verwijst naar de plooien van de inductie in vergelijking met het endogene gen controle, β-2-microglobuline. (C) FACS plots tonen hESC oppervlak marker expressie niveaus, met inbegrip van getrapte specifieke embryonale antigenen SSEA 4.

69/2969fig2.jpg "/>
Figuur 2. (A) Fase contrast microscopie representatief beeld van hESC-afgeleide lever endoderm morfologie op dag 9 van de differentiatie waargenomen in de cultuur, op x4 en x10 vergroting. (B) Karakterisering van veranderingen in de genexpressie. RNA werd geëxtraheerd en het cDNA werd geanalyseerd met behulp van kwantitatieve polymerase chain reaction, waaruit geleidelijke downregulatie van ongedifferentieerde cel genexpressie (oktober-3 / 4) en (C) opregulatie van hepatocyten genexpressie (albumine en α-foetoproteïne). Relatieve expressie verwijst naar de plooien van de inductie in vergelijking met het endogene gen controle, β-2-microglobuline op dag 0 van de differentiatie. P <0,05 wordt aangeduid * en P <0,001 wordt aangeduid *** gemeten door studenten t-test in vergelijking met hESC 's op dag 0. Foutbalken representeren een standaarddeviatie.

Figuur 3. Characterisation van hESC-afgeleide lever endoderm
Immunocytochemie met expressie van hepatocyt markers, albumine, AFP en E-cadherine in hESC (H9), afkomstig lever endoderm. Negatieve controles werden uitgevoerd met bijbehorende immunoglobuline G (IgG) en vertegenwoordigers beelden worden getoond.

Figuur 4. HESC (H9) afgeleid HLCS vertonen metabolische activiteit. Op dag 17, H9 gedifferentieerd om HLCS tentoongesteld CYP3A metabole activiteit (n = 6).

Discussion

We hebben een eenvoudig, homogeen en zeer reproduceerbaar in vitro model om schaalbare niveaus van menselijke HLCS te genereren. Ons model is gevalideerd door een aantal externe samenwerkende laboratoria. We routinematig karakteriseren van stamcellen afgeleid HLCS het gebruik van onze in-house gereedschapskist van de ontwikkelings-markers en de lever specifieke functionele assays (waarvan de meeste in de handel verkrijgbaar). De kritische stappen in ons proces zijn: het behoud van stamcellen pluripotentie, de mogelijkheid om stamcellen differentiatie direct naar definitieve endoderm, de specificatie van homogene culturen van de lever endoderm en de mogelijkheid af te leiden volwassen lever endoderm exposeren breed scala functie in vitro.

Een beperking van de grootschalige inzet van de stamcellen afkomstig van HLC technologie is het op korte termijn gedifferentieerde functie van de volwassen lever endoderm in de cultuur (~ 4 dagen op Matrigel). Als zodanig hebben we gescreend een polymeerbibliotheek voor bio-actieve en nieuwe cellulaire ondersteunt. Dit heeft geleid tot de identificatie van een nieuwe steun die leverfunctie onderhoudt gedurende minstens 15 dagen. De toekomstige aanwijzingen voor deze technologie worden in eerste instantie industriële toepassing in het drug discovery proces (Hay et al., 2011). Middellange termijn winsten vormen deze technologie zijn waarschijnlijk gehumaniseerd extra-corporele lever-ondersteunende apparatuur voor het overbruggen van of het behandelen van patiënten met een leverziekte. Op lange termijn voordelen van deze technologie kan in cel op basis van transplantatie therapie voor leverziekte, maar de huidige gegevens toont aan dat deze strategie grote inspanning vereist voordat het veilig kan worden gebruikt in de kliniek (Payne et al., 2011).

Kortom, de betekenis van onze in-vitro-technologie is de mogelijkheid om homogene en grenzeloze culturen van high fidelity menselijke HLCS voor toegepaste biologie genereren.

Materials

Matrigel coating plates and flasks Matrigel (10 mL, BD Biosciences, UK); store at -20°C. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C. Tissue culture plates (6 well, 12 well, Corning, UK) Tissue culture flask (25 cm2 vented, Corning, UK) hESC Maintenance Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA); store at -20°C. BSA solution (50 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C. Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA); store at -20°C. Passaging hESCs with collagenase Confluent well or flask of hESCs. Matrigel coated wells or flasks as appropriate. Phospate buffered saline (-MgCl2, -CaCl2) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature. Collagenase IV (1 g, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C. Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA). Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA). Differentiation of hESCs to hepatic endoderm RPMI 1640 (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C. B27 Supplement (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C. Activin A (2 μg, Peprotech, USA); store at -20°C. Recombinant mouse Wnt3a (2 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C. KO-SR (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C. Non-essential amino acids (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C. β-Mercapt–thanol (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C. DMSO (Sigma Aldrich, UK); store at room temperature Leibovitz L-15 culture medium (500 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C. Tryptose phosphate broth (100 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C. F–tal bovine serum, heat inactivated (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C. Hydrocortisone 21-hemisuccinate (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C. Insulin (bovine pancreas) (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C. L-Glutamine (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C. Ascorbic acid (25 g, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C. Human HGF (10 μg, Peprotech, USA); store at -20°C. Recombinant Human Oncostatin M (OSM) (50 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C. Syringe driven filter unit 0.22 μm (Millipore, UK) Characterisation of hESC derived Hepatic Endoderm Immunostaining Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature. PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20 (Sigma-Aldrich, UK). Paraformaldehyde (PFA) (Sigma-Aldrich, UK) is made up in PBS, store -20°C. Glycerol (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature. Tris Base (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature. Ethanol Serum (AbD Serotech, UK), store at -20°C. Secondary Antibody, Alexa Fluorophores (Molecular Probes, Invitrogen, UK). MOWIOL 4-88 (Polysciences Inc, USA) is made up in Tris HCL and glycerol as per manufacturers instructions. DAPI (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK) is added to the MOWIOL solution at a 1:1000 dilution. Primary antibodies Antigen* Type Supplier Dilution ALB Mouse Monoclonal Sigma Aldrich 1/500 E-Cadherin Mouse Monoclonal Millipore 1/100 α-fetoprotein Mouse Monoclonal Sigma 1/500 SSEA-4 FITC Mouse Monoclonal Biolegend 1/100 IgG Mouse Monoclonal DAKO 1/500 Secondary antibodies Anti-mouse FITC conjugate Goat Monoclonal Invitrogen 1/400 Table 2. The antibodies used for hESC derived hepatic endoderm immunostaining, the concentrations used, the species developed in and the companies they are purchased from. Functional Analysis of Hepatic Endoderm and Normalisation (per mg protein) Cytochrome P450 Assays p4-GLO CYP3A4, CYP1A2, Kits and luminometer (Promega, USA). White flat bottom 96 well assay plate (BD Biosciences, UK). BCA Assay Kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK). Transparent 96 well assay plate (IWAKI, UK)