Robust generationens Hepatocyte-liknande celler från mänskliga embryonala patientgrupper Stem Cell

Summary

Denna artikel kommer att fokusera på skapandet av mänskliga nedsatt endoderm från mänskliga embryonala populationer stamceller.

Abstract

Trots framsteg i modellera människans läkemedelstoxicitet, många föreningar misslyckas under kliniska prövningar på grund av oförutsedda biverkningar. Kostnaden för kliniska studier är betydande, därför är det viktigt att mer prediktiva toxikologi skärmar utvecklas och distribueras tidigt i läkemedelsutveckling (Greenhough et al 2010). Humana hepatocyter representerar det nuvarande guldmyntfoten modell för utvärdering läkemedelstoxicitet, men är en begränsad resurs som uppvisar varierande funktion. Därför är användningen av förevigat cellinjer och djurmodeller vävnad rutinmässigt används på grund av sitt överflöd. Även om båda källorna är informativa, de är begränsade av dålig funktion, arter variabilitet och / eller instabilitet i kultur (Dalgetty et al 2009). Pluripotenta stamceller (PSC) är ett attraktivt alternativ källa av mänskliga hepatocyte liknande celler (HLCs) (Medine et al 2010). PSC kan självförnyelse och differentiering till alla somatiska celltyper som finns i vuxna och därmed representeraren potentiellt outtömlig källa av differentierade celler. Vi har utvecklat ett förfarande som är enkel, mycket effektiv, mottagliga för automatisering och ger funktionella mänskliga HLCs (Hay et al 2008; Fletcher et al 2008; Hannoun et al 2010; Payne et al 2011 och Hay et al 2011). Vi tror att vår teknologi kommer att leda till skalbar produktion av HLCs för läkemedelsutveckling, sjukdom modellering, konstruktion av extra fysiska enheter och eventuellt cellbaserade terapier transplantation.

Protocol

1. Första bearbetning av alla kemiska lager och ytbeläggning av kultur plasten

Alla steg skall utföras i en vävnad kultur huva under aseptiska förhållanden.

1. Beredning av människans grundläggande Fibroblast Growth Factor (hbFGF)
   1. Bered 10% BSA lösning i PBS och filtrera genom ett 0,22 ìm filter.
   2. Från 10% BSA Bered en 0,2% BSA lösning.
   3. Tillsätt 10 ml 0,2% BSA solution/100 mikrogram hbFGF.
   4. Pre-wet ett 0,22 ìm filter genom att filtrera 5 ml 10% BSA lösningen genom filtret. Kasta 10 mL BSA tvätt.
   5. Filtrera hbFGF genom förtvättad filter.
   6. Alikvotera den hbFGF i sterila eppendorfs och förvara vid -20 ° C.
2. Beredning av mänskliga Activin en stamlösning
   1. Tillsätt 1 mL 0,2% BSA i en spruta och förskolor blöta filtret.
   2. Späd Activin A i 0,2% BSA ett bestånd koncentration av 100 mikrogram / ml.
   3. Filtrera aktivitetern en lösning och delprov i sterila eppendorfs, förvara vid -20 ° C.
3. Beredning av Mouse Wnt3a stamlösning
   1. Tillsätt 200 l PBS till 2 mikrogram injektionsflaska med Wnt3a ett bestånd koncentration av 10 mikrogram / ml.
   2. Fördela i sterila eppendorfs och förvara vid -20 ° C.
4. Beredning av mänskliga HGF stamlösning (1000X)
   1. Späd HGF i PBS till ett lager koncentration av 10 mikrogram / ml.
   2. Filtrera HGF lösningen och delprov i sterila eppendorfs, förvara vid -20 ° C.
5. Beredning av Oncostatin M stamlösning (1000X)
   1. Späd OSM i PBS till ett lager koncentration av 20 mikrogram / ml.
   2. Filtrera OSM lösningen och delprov i sterila eppendorfs, förvara vid -20 ° C.
6. Beläggning av kultur plasten med Matrigel
   1. Tina 10 flaskan mL lager av Matrigel över natten vid 4 ° C på is och tillsätt sedan 10 ml av KO-DMEM. Blanda väl med kyld pipetter och lagra 1ml-portioner vid -20 ° C.
   2. Tina en alikvot av Matrigel vid 4 ° C i minst 2 timmar eller över natten för att undvika att det bildas en gel.
   3. Tillsätt 5 ml kall KO-DMEM till matrigel, blanda väl med en pipett.
   4. Fyll upp till 15 ml med kallt KO-DMEM och blanda med hjälp av en pipett.
   5. Lägg matrigel på plattan eller flaskan ska behandlas (tabell (i))

Skylt / Flask	Volym / Tja eller flaskan
12-brunnar	0,5 ml per brunn
6-brunnar	1 ml per brunn
25cm 2 kolv	2 ml per flaska

Tabell 1. Rekommenderad volymer matrigel för beläggning typiska plasten för hESC kultur.

6. 6. Inkubera plåt eller flaskan över natten vid 4 ° C eller rumtempature i 1 timme före användning.
   7. Plattor eller kolvar som har belagts med matrigel kan lagras vid 4 ° C i upp till 1 vecka. De ska vara tydligt märkta med datum de var belagda. Kassera plattor eller flaskor som inte används inom en vecka.
      1. Före användning låta belagda kultur behållaren att komma upp till rumstemperatur i en vävnadskultur huva.
      2. Omedelbart före användning aspirera matrigel och lägga till cellsuspension till brunnen eller flaskan.

2. Rutinunderhåll av hESC kulturer och karakterisering

1. Återupplivning av hESC linjer
   1. Ta bort hESCs från flytande kväve lagring och snabbt tina i 37 ° C vattenbad.
   2. Överför cellsuspension noga till ett sterilt rör som innehåller flera ml varmt medium.
   3. Pellets cellerna genom centrifugering @ låg hastighet för 5min (1000 RPM).
   4. Sug bort supernatanten och mycket försiktigt resuspend cellerna i varma ES medium och platta ut på en MEF matare lager.
   5. Refeed celler dagligen med färska ES medellång och på subconfluence, cellerna kräver cellerna passaging.
2. Rutinmässig hESC underhåll
   ES-celler odlas i plattor eller kolvar täckta med matrigel. Cellerna måste undersökas och matas dagligen:
   1. Undersök i mikroskop för kontaminering, cellmorfologin och sammanflödet.
   2. Aspirera det använda mediet.
   3. Lägg till en lämplig volym av färska Mouse Embryonic Fibroblast-conditioned Medium (MEF-CM) + mänskliga bFGF (slutlig koncentration 4 ng / ml) eller andra serum fria medier ^6.
3. Passaging celler med kollagenas
   hESC linjer (H1, H9 och RCM-1) kommer att nå sammanflödet var 5-7 dagar efter passaging på 01:03 delningsfaktorn. Tidigt passage hESCs i närvaro av stroma växer långsammare och tiden på matrigel kan bli en viktig faktor. Mänskliga ekonomiska och sociala råd bör inte lämnas längre än 14dagar på samma matrigel grund matris nedbrytning och i detta fall kan det vara nödvändigt att passagen cellerna på en 1:1 eller 1:02 delningsfaktorn Om cellerna subconfluent.
   
   Enzym Inkubation
   1. Alla steg skall utföras i en vävnad kultur huva under aseptiska förhållanden.
   2. Se till att det finns en ny matrigel belagd maträtt eller flaskan upprättad enligt avsnitt 1.6.
   3. Bestäm önskad delningsfaktorn för cellerna. Ett antal faktorer är inblandade för att avgöra delningsfaktorn:
      1. Hög stroma med låga antalet kolonier: kan passerats tillbaka till en mindre bra storlek eller kan passerats 01:01 som kommer bli av med några stroma och därmed öka kolonin till stromat förhållandet, att främja hESC tillväxt.
      2. Hög stroma med stora kolonier, beroende på antalet kolonier, kan passerats 1:1 eller 1:2 om det finns tillräckligt stora hESC kolonier.
      3. Typiska växer hESCs med lite stroma eller ingen stroma och / eller viss differentiering kan vara passerats 1:2 eller 3.
      4. Sug media från brunnen eller flaskan.
      5. Tvätta en gång med 2 mls PBS (-MgCl _{2,-CaCl 2).}
      6. Lägg till en lämplig volym av kollagenas (200 U / ml späds ut i KO-DMEM) och inkubera vid 37 ° C i 2-5 min. Från och med 2 minuter och framåt regelbundet undersöka under mikroskop (1 minut). Vid den punkt de differentierade celler börjar lyfta och kolonierna börjar att lyfta på kanten cellerna är redo att passerats.
   Skrapning och samlande hESCs
   3. 6. Aspirera kollagenas.
      7. Tvätta en gång med 2 mls PBS (-MgCl _{2,-CaCl 2).}
      8. Lägg till en lämplig volym av MEF-CM beroende på delningsfaktorn och använda en cell skrapa fysiskt avlägsna celler från ytan av bra eller kolven, sedan kör det gently genom att pipettera upp och ned 2-3 gånger med en 10 ml pipett. Det är viktigt att hESCs hålls i klumpar av celler och inte delas upp i enstaka celler.
   Nicasiling den hESCs
   3. 9. Replate den resulterande cellsuspension på den nya matrigel belagda kolvar eller brunnar.
      10. Gör volymen MEF-CM upp till 4 ml för en brunn på en 6-brunnar.
      11. Vid placering av celler i inkubatorn agitera för vävnadsodling behållaren för att se så jämn som möjligt en fördelning av kolonier som kolonierna tenderar att bosätta sig i mitten av vävnadsodling skylt / kolv som påverkar cellens nicasiling och differentiering.
4. Rutinmässig karakterisering av hESC populationer med flödescytometri
   1. hESC befolkningen granskas via flödescytometri en gång i månaden för markörer stamceller som 3 oktober / 4, Tra 1-60 och SSEA-4.
   2. hESCpopulationer tas bort från sina substrat som enda cellsuspensioner efter en 5 minuters behandling med trypsin / EDTA (Invitrogen).
   3. Resuspendera enskilda celler på 1x10 ⁶ celler / ml i PBS kompletteras med 0,1% BSA och 0,1% natriumazid.
   4. Inkubera cell förberedelser vid 4 ° C med respektive antikroppar i 40 minuter.
   5. Tvätta cellerna två gånger med PBS kompletteras med 0,1% BSA och 0,1% natriumazid för att avlägsna obundna antikroppar och återsuspendera till en slutlig volym på 100 mikroliter och analysera med flödescytometri.
   6. Data för 3 till 40000 "live" händelser förvärvas för varje prov genom en FACS Kaliber flödescytometer utrustad med en 488-nm laser och analyseras med hjälp CellQuest programvara (Becton Dickinson, San Jose, CA). Ofärgade celler ingår som kontroller. Döda och apoptotiska celler tillsammans med skräp uteslöts från analysen med hjälp av ett elektroniskt live-porten på Forward Scatter och sida parametrar scatter.

3. Difring av hESCs till nedsatt endoderm

1. Beredning av medier för differentiering av hESCs till nedsatt endoderm. All media Preparatet bör utföras i en vävnadsodling huva under aseptiska förhållanden.
   1. Beredning av RPMI: B27 priming medium för endoderm differentiering
      1. För RPMI-B27 medium, blanda RPMI 1640 (500 ml) och B27 (50x, 10 ml)
      2. Swirl att blanda komponenter.
      3. Lägg till alla komponenter till ett filter och filtrera i vakuum, förvara vid 4 ° C.
   2. Beredning av SR-DMSO medium för hepatocyte differentiering
      1. För SR-DMSO medium, blanda 80% KO-DMEM, 20% KO-SR, 0,5% L-glutamin, 1% icke-essentiella aminosyror, 0.1mm β-Mercaptoethanol och 1% DMSO.
      2. Filtrera lösningen under vacum, förvara vid 4 ° C och delprov och förvara vid -20 ° C vid behov.
      3. Använd 4 ml per brunn på en 6-brunnar, och 6 ml per T25 kolven.
   3. Beredning av L15 mognad medium för HEPAtocyte mognad
      1. För L-15 medium Blanda 500 ml Leibovitz L-15 medium, tryptos fosfat buljong (slutlig koncentration 8,3%), värmeinaktiverad fetalt bovinserum (slutlig koncentration 8,3%), 10 mikroM hydrokortison 21-hemisuccinate, 1 mikroM Insulin (nötkreatur bukspottkörteln ), 1% L-glutamin, 0,2% askorbinsyra.
      2. Filtrera lösningen under vacum, förvara vid 4 ° C och delprov och förvara vid -20 ° C vid behov.
   4. Beredning av slutligt RPMI: B27 grundning medelstora
      1. Fördela erforderlig volym priming medium för försöket (1 ml per brunn på en 6-brunnar, och 2 ml per T25 kolv).
      2. Lägg Activin A till en slutlig koncentration av 100 ng / ml.
      3. Lägg rekombinant Wnt3a till en slutlig koncentration på 50 ng / ml.
      4. Blanda väl och media är nu klar för användning.
      5. Detta slutliga medier bör bestå nytt varje dag.
   5. Beredning av slutligt L-15 mognad medelstora
      1. Fördela önskadVolymen av L-15 medium för experimentet (4 ml per brunn av en 6-brunnar, och 6 ml per T25 kolv).
      2. Lägg HGF till en slutlig koncentration på 10 ng / ml.
      3. Lägg OSM till en slutlig koncentration på 20 ng / ml.
      4. Blanda väl och media är nu klar för användning.
      5. Detta slutliga medier bör bestå nytt varje dag.
2. Grundning hESCs till definitiv endoderm
   1. Kultur hESCs (H1, H9 och RCM-1) och propagera för matrigel plåt med musen embryonala fibroblast MEF-CM kompletteras med bFGF.
   2. Initiera nedsatt differentiering när hESCs når en confluency nivå på ca 30% -60% (beroende på hESC linje) genom att ersätta MEF-CM med priming medium (RPMI 1640-B27 kompletteras med 100 ng / mL Activin A och 50 ng / ml Wnt3a.
   3. Cellerna odlas i priming medium för 3 dagar (ändra mediet var 24 timmar) och slutligt grundning medium med Activin A och Wnt3a består nytt varje dag.
   4. Dag 8 kulturen cellerna i mognad och underhåll medium (L-15) kompletterad med 10 ng / ml hHGF och 20 ng / ml OSM i 9 dagar (ändra medelhög var 48 timmar). Mognad och underhåll medium med hHGF och OSM består nytt varje dag.
   5. Cellerna uppvisar successivt morfologiska förändringar från en taggig / triangulär form med en karakteristisk lever morfologi visar en månghörnigt utseende (Figur 2A).
   6. Schematisk för lever-cellulär differentiering:

4. Karakterisering av hESC härrör nedsatt endoderm

1. Immunfärgning
   1. Tvätta hESC härrör HLCs med PBS två gånger, 1 minut varje tvätt.
   2. Fäst HLCs med 4% PFA 20 minuter vid rumstemperatur (cellens kan lagras i PBS vid 4 ° C och färgas vid ett senare tillfälle). Cellerna kan även fästas med iskall metanol i 10 min vid -20 ° C.
   3. Tvätta cellerna två gånger med PBS, 5 minuter varje tvätt.
   4. Inkubera cellerna i 2 minuter vid rumstemperatur med 100% etanol för nukleär färgning (detta steg är inte nödvändigt om metanol fixering används).
   5. Tvätta cellerna två gånger med PBS, 5 minuter varje tvätt.
   6. Blockera cellerna med PBS / T (0,1% Tween) / 10% BSA i 1 timme i rumstemperatur.
   7. Avlägsna den blockerande buffert och tillsätt respektive primära antikroppen späds i PBS / T (0,1% Tween) / 1% BSA och inkubera i 2 timmar i rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C med agitation.
   8. Tvätta cellerna tre gånger med PBS / T (0,1% Tween) / 1% BSA vid rumstemperatur, 5 minuter varje tvätt.
   9. Tillsätt en lämplig sekundär Alexa Fluor antikropp (1:400) som spätts i PBS till cellerna och inkubera i rumstemperatur i 1 timme i mörker med agitation. Tvätta cellerna tre gånger med PBS, 5 minuter varje tvätt.
   10. Montera varje brunn med MOWIOL 4-88 och DAPI (1:1000). Täck väl med ett täckglas, trycka på täckglas försiktigt så att alla luftbubblor avlägsnas och förvaras vid 4 ° C i mörker.
2. RNA-isolering och extraktion
   1. Tvätta hESC härrör HLCs med PBS och aspirera.
   2. Tillsätt 1 mL TRIZOL reagens och inkubera vid rumstemperatur i 5 minuter.
   3. Skrapa cellerna och placera i ett 1,5 ml Eppendorf (förvaras vid -80 ° C för senare användning vid behov).
   4. Tillsätt 0,5 ml kloroform till Eppendorf och blanda genom att vända, se till att detta sker i ett dragskåp.
   5. Centrifugera lösningen vid 13.000 rpm i 15 minuter vid 4 ° C.
   6. Samla vattenskiktet och placera i ett rent Eppendorf, se till att det inte finns några föroreningar från gränssnittet.
   7. Tillsätt 1 ml isopropanol och blanda genom att vända, låt stå i rumstemperatur i 10 minuter till utfälldlätta RNA.
   8. Centrifugera vid 13.000 rpm i 10 minuter vid 4 ° C.
   9. Aspirera supernatanten och se till att inte störa RNA pelleten. Tvätta med 0,5 ml 70% etanol och låt stå i rumstemperatur i 5 minuter.
   10. Centrifugera vid 8000 rpm i 5 minuter vid 4 ° C.
   11. Aspirera etanol och låt torka i rumstemperatur i 5-10 minuter.
   12. När all etanol har avdunstat, Återsuspendera pelleten i 30 l avjoniserat vatten. Förvara RNA vid -80 ° C för senare användning.
   13. Kvantifiera RNA-koncentrationen med hjälp av en nanodrop.
3. Omvänd transkription PCR
   1. Inrätta en reaktion med hjälp av tidigare isolerade RNA (200 ng), random hexamerer, nukleotider (10mm) omvänt transkriptas och respektive buffert i ett tunnväggiga 0,5 ml Eppendorf.
   2. Inrätta ett negativt RT, ovanstående reaktion utan omvänt transkriptas.
   3. Placera rören i en thermo apparat, PCR-maskin och satte upp följande program:
      1. 37 ° C - 5 minuter (1 cykel)
      2. 42 ° C - 1 timme (1 cykel)
      3. 95 ° C - 5 minuter (1 cykel)
   4. Förvara cDNA vid -20 ° C för senare användning vid behov.
4. TaqMan kvantitativ omvänd transkriptas polymeraskedjereaktion Harvest celler vid olika tidpunkter under differentiering protokollet. Extrahera RNA och utföra omvänd transkription qPCR med följande grundfärger och analys på efterfrågan, (Applied Biosystems) protokollet:
   1. 4 oktober Hs03005111_g1
   2. Nanog Hs02387400_g1
   3. Albumin Hs00910225_m1
   4. Alfa-fetoprotein Hs00173490_m1

För RNA isolering och gärna utvinning se avsnitt 3.3.2

1. Omvänd transkription och TaqMan qPCR
   1. Ta 1 mikrogram av RNA och omvänd transkribera till cDNA med hjälp av Invitrogen är Upphöjd III omvänd transkriptionkit, enligt tillverkarens anvisningar.
   2. 1 ìl av cDNA används i ett 25 l TaqMan reaktion som består av lämpliga grundfärger från Applied Biosystems, 18S ribosomala primers kontroll och Invitrogen är 2x platina qPCR supermix UDG med rox och en lämplig mängd vatten.
   3. Blanda väl och plats 10 ìl av varje prov i två brunnar på antingen en 96 eller 384 bra qPCR plattan.
   4. När alla prover är laddade, plus lämpliga kontroller), tätning plattan och analysera på Applied Biosystems 7900HT TaqMan maskin.
   5. Resultaten uttrycks som relativa uttryck över ett kontrollprov.

5. Funktionell analys av hESC härledda Nedsatt endoderm cytokrom P450 analyser - http://www.promega.com/tbs/tb325/tb325.pdf
   1. Inkubera dag 17 hESC härstammar han med det specifika substrat för 5 timmar vid 37 ° C (n = 3). Använd material vävnadskultur som ennegativa kontrollen och inkubera vid 37 ° C i 5 timmar.
   2. Samla supernatanterna och utföra analysen enligt tillverkarens anvisningar.
   3. Mät den relativa nivåer av basal aktivitet och normalisera till per mg protein som bestäms av BCA Assay (http://www.piercenet.com/products/browse.cfm?fldID=02020101).

Anteckningar

1. Alla volymer är baserade på en 6-brunnar format. Justera volymen följaktligen för den önskade plattan eller flaskan.
2. Alla grundning, differentiering och mognad medium filtreras under vakuum före användning.
3. Grundning, differentiering och mognad medium lagras vid 4 ° C i högst 2 veckor. Bedöma hur mycket medel som krävs för experimentet och alikvoten resterande media och förvara vid -20 ° C för framtida bruk.
4. Matrigel består enligt tillverkarens anvisningar, 1 ml portioner kan lagras vid -20 ° C fram till användning.
5. Growth faktorer gång gjordes upp och alikvoteras kan förvaras vid -20 ° C och när tinats kan lagras vid 4 ° C i högst 2 veckor.
6. Den primära antikroppen vanligtvis används för att karakterisera hESC härrör HLCs är albumin (1:250, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO).

5. Representativa resultat:

Karakterisering av hESCs underhållas innan nedsatt differentiering

För att karakterisera status stamceller från H9 hESCs som används i studien har vi studerat ett antal parametrar. Cellerna uppvisade hESC morfologi, små, tätt packade celler växer i definierade kolonier (Figur 1A) och uttryckte en pluripotenta stamceller markörer cell genen, oktober-3 / 4 och NANOG (Figur 1B). Vi hittade inte signifikanta skillnader i uttrycket av dessa gener jämfört med en H7 hESC rad positiva kontrollen. Dessutom var 90,1% av hESCs befolkningen positiva för stamceller markör SSEA-4 (Figur 1C).

hESC differentiering till nedsatt endoderm

Mänskliga embryonala stamceller effektivt kan differentieras till nedsatt endoderm in vitro (Hay et al 2008). I dag 9 av differentiering var stamceller efter skörd och differentiering av hESC till HLCs bedömdes. Som tidigare rapporterat hESCs uppvisade en rad djupgående morfologiska förändringar, och dag 9, visade tidigt hepatocyte morfologi utveckla en kantig utseende (Figur 2A). Dessutom var nedreglering av oktober-3 / 4 över 9 dagtid naturligtvis observeras (Figur 2B). Däremot var leverförändringar avskrifter AFP och albumin upp-reglerad (Figur 2C) från dag 7 och framåt.

In vitro-mognad nedsatt endoderm

Nedsatt endoderm var mognat in vitro med det fastställda förfarandet (Hay et al 2008). Den sista dagen av differentiering kulturer var immunostained för mänskliga levern markörer albumin, AFP och E-cadherin. Avkastningen av HLCs använda våra Förfarandet är vanligtvis 90% (Hay et al 2008; Hanoun et al 2010; Payne et al 2011). HLCs färgade positivt för albumin, alfa-fetoprotein och E-cadherin (Figur 3).

Figur 1. Karakterisering av hESCs används i denna studie. (A) faskontrast mikroskopi bilder representant hESC morfologi observerats i kulturen på 4x och 10x förstoring. Bilderna har tagits med en Nikon TE3000 / U inverterat mikroskop (B) odlade hESCs är Octamer (okt-3 / 4) positiv och NANOG positiv. H7 hESCs blev använda som en kontroll för pluripotens nivåer genuttryck. Relativ uttryck refererar till veck av induktion jämfört med den endogena genen kontroll, β-2-mikroglobulin. (C) FACS tomter visa hESC ytan nivåer markör yttrandefrihet, inbegripet skede specifika embryonala antigener SSEA 4.

69/2969fig2.jpg "/>
Figur 2. (A) faskontrast mikroskopi representativa bilder av hESC-derived nedsatt endoderm morfologi på dag 9 av differentiering observerats i kulturen, i x4 och x10 förstoring. (B) Karakterisering av förändringar i genuttryck. RNA extraherades och cDNA analyserades med kvantitativa PCR, visar progressiv nedreglering av odifferentierade celler genuttryck (okt-3 / 4) och (C) uppreglering av hepatocyte genuttryck (albumin och α-fetoprotein). Relativ uttryck refererar till veck av induktion jämfört med den endogena genen kontroll, β-2-mikroglobulin vid dag 0 av differentiering. P <0,05 betecknas * och P <0,001 betecknas *** mäts av studenter t-test i jämförelse med hESCs dag 0. Felstaplar representerar en standardavvikelse.

Figur 3. Characterisation av hESC-derived nedsatt endoderm
Immuncytokemi visar uttryck för hepatocyte markörer, albumin, AFP och E-cadherin i hESC (H9) som härrör nedsatt endoderm. Negativa kontroller utfördes med motsvarande immunglobulin G (IgG) och representanter bilder visas.

Figur 4. HESC (H9) som härrör HLCs uppvisar metabolisk aktivitet. På Dag 17, H9 differentierade för att HLCs uppvisade CYP3A metabolisk aktivitet (n = 6).

Discussion

Vi har utvecklat en enkel, enhetlig och mycket reproducerbar in vitro-modell för att skapa skalbara nivåer av mänsklig HLCs. Vår modell har godkänts av ett antal externa samverkande laboratorier. Vi karakteriserar rutinmässigt stamceller härstammar HLCs använda vår i huset verktygslåda av utvecklingsstörningar markörer och lever specifika funktionella tester (varav de flesta kommersiellt tillgängliga). Den kritiska steg i vår process är: underhåll av stamceller pluripotens, förmågan att styra differentiering stamceller för att definitivt endoderm, specifikation av homogena kulturer lever endoderm och förmågan att dra mogna nedsatt endoderm uppvisar bred funktion in vitro.

En begränsning till den storskaliga utbyggnaden av stamceller härstammar HLC teknik har på kort sikt differentieras funktion av mogna nedsatt endoderm i kultur (~ 4 dagar på matrigel). Som sådan har vi skärmade en polymerbibliotek för bio-aktiva och nya cellulära stöder. Detta har lett till identifiering av en roman stöd som upprätthåller leverfunktionen under minst 15 dagar. Den framtida inriktningar för denna teknik är initialt industriell tillämpning inom drug discovery-processen (Hay et al 2011). Medellång sikt vinster utgör denna teknik kommer sannolikt att vara humaniserade extra kroppsliga levern stödja enheter för att överbrygga eller behandling av patienter med leversjukdom. Långsiktiga vinster från den här tekniken kan i cellbaserade transplantation behandling för leversjukdom, men aktuella data visar att denna strategi kräver betydande insatser innan den kan användas säkert på kliniken (Payne et al 2011).

Sammanfattningsvis är betydelsen av vårt in vitro-teknik för förmågan att skapa homogena och obegränsade kulturer hifi mänskliga HLCs för tillämpad biologi.

Materials

Matrigel coating plates and flasks Matrigel (10 mL, BD Biosciences, UK); store at -20°C. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C. Tissue culture plates (6 well, 12 well, Corning, UK) Tissue culture flask (25 cm2 vented, Corning, UK) hESC Maintenance Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA); store at -20°C. BSA solution (50 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C. Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA); store at -20°C. Passaging hESCs with collagenase Confluent well or flask of hESCs. Matrigel coated wells or flasks as appropriate. Phospate buffered saline (-MgCl2, -CaCl2) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature. Collagenase IV (1 g, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C. Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA). Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA). Differentiation of hESCs to hepatic endoderm RPMI 1640 (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C. B27 Supplement (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C. Activin A (2 μg, Peprotech, USA); store at -20°C. Recombinant mouse Wnt3a (2 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C. KO-SR (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C. Non-essential amino acids (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C. β-Mercapt–thanol (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C. DMSO (Sigma Aldrich, UK); store at room temperature Leibovitz L-15 culture medium (500 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C. Tryptose phosphate broth (100 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C. F–tal bovine serum, heat inactivated (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C. Hydrocortisone 21-hemisuccinate (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C. Insulin (bovine pancreas) (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C. L-Glutamine (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C. Ascorbic acid (25 g, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C. Human HGF (10 μg, Peprotech, USA); store at -20°C. Recombinant Human Oncostatin M (OSM) (50 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C. Syringe driven filter unit 0.22 μm (Millipore, UK) Characterisation of hESC derived Hepatic Endoderm Immunostaining Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature. PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20 (Sigma-Aldrich, UK). Paraformaldehyde (PFA) (Sigma-Aldrich, UK) is made up in PBS, store -20°C. Glycerol (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature. Tris Base (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature. Ethanol Serum (AbD Serotech, UK), store at -20°C. Secondary Antibody, Alexa Fluorophores (Molecular Probes, Invitrogen, UK). MOWIOL 4-88 (Polysciences Inc, USA) is made up in Tris HCL and glycerol as per manufacturers instructions. DAPI (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK) is added to the MOWIOL solution at a 1:1000 dilution. Primary antibodies Antigen* Type Supplier Dilution ALB Mouse Monoclonal Sigma Aldrich 1/500 E-Cadherin Mouse Monoclonal Millipore 1/100 α-fetoprotein Mouse Monoclonal Sigma 1/500 SSEA-4 FITC Mouse Monoclonal Biolegend 1/100 IgG Mouse Monoclonal DAKO 1/500 Secondary antibodies Anti-mouse FITC conjugate Goat Monoclonal Invitrogen 1/400 Table 2. The antibodies used for hESC derived hepatic endoderm immunostaining, the concentrations used, the species developed in and the companies they are purchased from. Functional Analysis of Hepatic Endoderm and Normalisation (per mg protein) Cytochrome P450 Assays p4-GLO CYP3A4, CYP1A2, Kits and luminometer (Promega, USA). White flat bottom 96 well assay plate (BD Biosciences, UK). BCA Assay Kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK). Transparent 96 well assay plate (IWAKI, UK)