Génération robuste des hépatocytes comme des cellules embryonnaires humaines à partir populations de cellules souches

Résumé

Cet article se concentrera sur la génération de l'endoderme hépatiques humaines embryonnaires humaines à partir des populations de cellules souches.

Résumé

Malgré les progrès dans la toxicité des médicaments de modélisation humaine, de nombreux composés échouent lors des essais cliniques en raison d'effets secondaires imprévus. Le coût des études cliniques sont considérables, il est donc essentiel que plusieurs écrans toxicologie prédictive sont développées et déployées au début du développement de médicaments (Greenhough et al 2010). Hépatocytes humains représentent le modèle actuel de l'or standard pour évaluer la toxicité des médicaments, mais ils sont une ressource limitée qui présentent fonction variable. Par conséquent, l'utilisation de lignées cellulaires immortalisées et des modèles de tissus animaux sont couramment employées en raison de leur abondance. Alors que les deux sources sont informatifs, ils sont limités par la fonction pauvres, la variabilité des espèces et / ou d'instabilité dans la culture (Dalgetty et al 2009). Les cellules souches pluripotentes (PSC) sont une source intéressante alternative d'hépatocytes humains comme des cellules (CLH) (Medine et al 2010). CPP sont capables d'autorenouvellement et de différenciation à tous les types de cellules somatiques dans l'adulte et représentent ainsiune source potentiellement inépuisable de cellules différenciées. Nous avons développé une procédure qui est simple, très efficace, se prêtent à l'automatisation et les rendements fonctionnels CLH humaine (Hay et al 2008; Fletcher et al 2008; Hannoun et al 2010; Payne et al 2011 et Hay et al 2011). Nous croyons que notre technologie peut conduire à la production évolutive de CLH pour la découverte de médicaments, la modélisation des maladies, la construction d'appareils extra-corporelle et, éventuellement, les thérapies cellulaires de transplantation base.

Protocole

1. La préparation initiale de tous les stocks de produits chimiques et le revêtement de la culture en matière plastique

Toutes les étapes à réaliser dans une hotte de culture de tissus dans des conditions aseptiques.

1. Préparation du facteur humain de croissance fibroblastique basique (hbFGF)
   1. Préparer une solution BSA 10% dans le PBS et filtrer à travers un filtre de 0,22 um.
   2. De la solution à 10% de BSA préparer une solution à 0,2% de BSA.
   3. Ajouter 10 ml hbFGF 0,2% de BSA mg solution/100.
   4. Pré-humide, un filtre de 0,22 um en filtrant 5 ml de solution de BSA à 10% à travers le filtre. Jeter les 10....

Discussion

Nous avons développé un modèle simple, homogène et hautement reproductibles in vitro pour générer des niveaux évolutifs du CLH humaine. Notre modèle a été validé par un certain nombre de laboratoires externes collaborent. Nous avons régulièrement de caractériser des cellules souches dérivées CLH utilisant notre boîte à outils dans la maison de marqueurs spécifiques de développement et des tests fonctionnels du foie (dont la plupart sont disponibles dans le commerce). Les étapes essentielles dans notre processus.......

Matériaux

Plaques revêtement Matrigel et flacons

1. Matrigel (10 ml, BD Biosciences, RU); conserver à -20 ° C.
2. KO-DMEM (500 ml, Gibco, Invitrogen, Royaume-Uni); conserver à 4 ° C.
3. Plaques de culture tissulaire (6 puits, 12 puits, Corning, Royaume-Uni)
4. Flacon de culture de tissus (25 cm2 ventilé, Corning, Royaume-Uni)

Entretien CSEh

1. Moyenne de fibroblastes de souris embryonnaires conditionné (MEF-CM) (100 ml, R & D Systems, États-Unis); conserver à -20 ° C.
2. BSA solution (50 ml, Sigma Aldrich, Royaume-Uni); conserver à 4 ° C.
3. L'homme facteur de croissance basique des fibroblastes (100 ug, Peprotech, Etats-Unis); conserver à -20 ° C.

CSEh repiquage avec de la collagénase

1. Ainsi Confluent ou un flacon de CSEh.
2. Puits Matrigel enduits ou des flacons, le cas échéant.
3. Phosphate saline tamponnée (-MgCl _{2, CaCl-2)} (500 ml, Gibco, Invitrogen, Royaume-Uni); stocker à température ambiante.
4. Collagénase IV (1 g, Gibco, InvitrOgen, Royaume-Uni); conserver à 4 ° C.
5. Moyenne de fibroblastes de souris embryonnaires conditionné (MEF-CM) (100 ml, R & D Systems, États-Unis).
6. L'homme facteur de croissance basique des fibroblastes (100 ug, Peprotech, Etats-Unis).

La différenciation des CSEh au endoderme hépatique

1. RPMI 1640 (500 mL, Gibco, Invitrogen, Royaume-Uni); conserver à 4 ° C.
2. Supplément B27 (10 ml, Gibco, Invitrogen, Royaume-Uni); conserver à -20 ° C.
3. Activine A (2 ug, Peprotech, Etats-Unis); conserver à -20 ° C.
4. Recombinant Wnt3a la souris (2 ug, R & D Systems, États-Unis); conserver à -20 ° C.
5. KO-DMEM (500 ml, Gibco, Invitrogen, Royaume-Uni); conserver à 4 ° C.
6. KO-SR (500 ml, Gibco, Invitrogen, Royaume-Uni); conserver à -20 ° C.
7. Non-acides aminés essentiels (100 ml, Gibco, Invitrogen, Royaume-Uni); conserver à 4 ° C.
8. β-mercaptoéthanol (10 ml, Gibco, Invitrogen, Royaume-Uni); conserver à 4 ° C.
9. DMSO (Sigma Aldrich, Royaume-Uni); stocker à température ambiante
10. Leibovitz L-15 milieu de culture (500 ml, SIGMune Aldrich, Royaume-Uni); conserver à 4 ° C.
11. Bouillon tryptose phosphate (100 ml, Sigma Aldrich, Royaume-Uni); conserver à 4 ° C.
12. Fœtale sérum bovin, inactivé par la chaleur (500 ml, Gibco, Invitrogen, Royaume-Uni); conserver à -20 ° C.
13. Hydrocortisone 21-hémisuccinate (100 mg, Sigma Aldrich, Royaume-Uni); conserver à -20 ° C.
14. Insuline (pancréas de bovin) (100 mg, Sigma Aldrich, Royaume-Uni); conserver à -20 ° C.
15. L-glutamine (100 ml, Gibco, Invitrogen, Royaume-Uni); conserver à -20 ° C.
16. L'acide ascorbique (25 g, Sigma Aldrich, Royaume-Uni); conserver à -20 ° C.
17. Human HGF (10 ug, Peprotech, Etats-Unis); conserver à -20 ° C.
18. Recombinant Human oncostatine M (OSM) (50 mg, R & D Systems, États-Unis); conserver à -20 ° C.
19. Seringue conduit l'unité filtre de 0,22 um (Millipore, Royaume-Uni)

Caractérisation de l'endoderme hépatique CSEh dérivées

Immunocoloration

1. Tampon phosphate salin (-MgCl _{2, CaCl-2)} (500 ml, Gibco, Invitrogen, Royaume-Uni); STOre à la température ambiante.
2. PBST, PBS composé avec 0,1% de Tween 20 (Sigma-Aldrich, Royaume-Uni).
3. Paraformaldéhyde (PFA) (Sigma-Aldrich, Royaume-Uni) est constituée en PBS, stocker à -20 ° C.
4. Le glycérol (Sigma-Aldrich, Royaume-Uni), de stocker à température ambiante.
5. Tris Base (Sigma-Aldrich, Royaume-Uni), de stocker à température ambiante.
6. Éthanol
7. Sérum (ABD Serotech, Royaume-Uni), conserver à -20 ° C.
8. Anticorps secondaire, les fluorophores Alexa (Molecular Probes, Invitrogen, Royaume-Uni).
9. Mowiol 4-88 (Polysciences Inc, États-Unis) est constitué de Tris HCL et le glycérol comme instructions du fabricant. DAPI (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Royaume-Uni) est ajouté à la solution MOWIOL à une dilution 1:1000.

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Les anticorps primaires
* Antigène	Tapez	Fournisseur	De dilution
ALB	Monoclonaux de souris	Sigma-Aldrich	1 / 500
E-cadhérine	Monoclonaux de souris	Millipore	1 / 100
α-fœtoprotéine	Monoclonaux de souris	Sigma	1 / 500
SSEA-4 FITC	Monoclonaux de souris	Biolegend	1 / 100
IgG	Monoclonaux de souris	DAKO	1 / 500
Anticorps secondaire
Anti-souris conjugué FITC	Chèvre monoclonaux	Invitrogen	1 / 400

Tableau 2. Les anticorps utilisés pour CSEh dérivées hépatiques endoderme immunomarquage, les concentrations utilisées, les espèces développées à l'intérieur et les entreprises qu'ils sont achetés.

Analyse fonctionnelle de l'endoderme hépatique et de Normalisation (par mg de protéine)

Tests du cytochrome P450

1. p4-GLO CYP3A4, CYP1A2, Kits et luminomètre (Promega, États-Unis).
1. Blanc fond plat plaque de 96 puits d'essai (BD Biosciences, RU).
2. BCA Assay Kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific, RU).
3. Transparent 96 plaque de dosage bien (Iwaki, Royaume-Uni)